KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT DNA

KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT DNA NHÓM 1: - Huỳnh Lộc Nhung - Nguyễn Thị Huyền Trang - Nguyễn Thị Phương Oanh P1: Giới thiệu kỹ thuật, nguyên tắc tiến hành Giới thiệu kĩ thuật -DNA ( Acid Deoxyribose Nucleic) đại phân tử cấu thành từ đơn phân nucleotid Trong thể , tất tế bào có nhân chứa phân tử DNA Phân tử này mang toàn thông tin di truyền cá thể Nguồn thông tin di truyền ổn định nhờ hoat động tự chép DNA theo nguyên tắc “bán bảo tồn”  Thông qua hoạt động máy tế bào , nguồn thông tin chuyển : DNA mRNA Protein Sinh học phân tử phát triển kĩ thuật di truyền DNA vào nghiên cứu chẩn đoán số bệnh Để thực kĩ thuật đòi hỏi phải có nguồn ngun liệu DNA đảm bảo chất lượng Tách chiết DNA khâu , quan trọng qui trình thao tác DNA MỤC ĐÍCH Tìm số kĩ thuật phù hợp với tiêu chuẩn về: chất lượng DNA , hàm lượng DNA, thời gian tiến hành, chi phí thực mức độ độc hại đói với người thực Nguyên lý kĩ thuật tách chiết DNA Tách chiết DNA kĩ thuật hầu hết phòng thí nghiệm phân tử, di truyền sinh học nói chung  Phân tử DNA sau tách chiết cần đảm bảo số lượng chất lượng để đáp ứng phân thức sau Hiện thị trường có sẵn nhiều kít tách chiết DNA tiện dụng: - Việc nắm rõ nguyên lí tách chiết DNA qua trọng để giúp hiểu rõ cách thưc hoạt động kit, giải vấn đề có việc xảy - Cho đến có nhiều quy trình tách chiết DNA đưa báo cáo thành công nhà nghiên cứu Đới với loại mơ, tế bào quy trình tách chiết khác Ngun lí tách chiết DNA từ tế bào gồm bước sau: • Bước 1: phá vỡ nguyên liệu ban đầu( tề bào, mơ) để mở tế bào giải phóng acid nucleic ( DNA RNA ) ( nghiền nito lỏng hòa đêm chiết) • Bước 2: bổ sung chất chống chất hoạt hóa enzyme ADNase làm biến tính phân tử protein, dịch hữu cơ, • Bước 3: tách DNA khỏi tạp chất khác máy ly tâm • Bước 4: kết tủa, rửa hòa tan DNA (rửa dung dịch cồn, hòa tan TE nước cất) Ethanol Isopropanol + Ethanol: thường dùng môi trường dung dịch có lực ion , hay nồng độ muối cao, điều kiện acid nuleid dễ dàng bị kết tủa , kết tủa acid nucleid đạt hiệu cao xử lí mơi trường lạnh + Isopropanol: dùng để kết tủa acid nucleid mơi trường khơng cần có muối , tỉ lệ lượng isopropanol mãu theo thể tích 1:1 Nước cất TE:Acid nucleic: + hòa tan nước cất khử trung dung dịch TE Acid Nucleic bảo quản tốt , hòa tan dung dịch TE,vì dung dịch chứa Tris EDTA 2/ Các phương pháp tách chiết 2.1/ Quy trình tách chiết DNA máu ngoại vi - Lấy máu tĩnh mạch cho vào ống có sẵn EDTA 0,4M, trộn để máu không đông Mẫu máu bảo quản 4℃ lúc tiến hành kỹ thuật -Cho 5ml dúng dịch đệm phá hồng cầu vào ống máu trộn nhiều lần, ly tâm 2500 vòng/phút 10 phút Bỏ dịch nỗi, giữ lại cặn tủa tế bào màu trắng Mục đích chủ yếu để phá hủy hồng cầu, tách riêng bạch cầu Có thể làm nhiều lần cặn tế bào có màu trắng -Làm tan cặn tủa cách dùng máy lắc -Cho tiếp vào ống chứa cặn tủa tế bào 900 µl đệm phá bạch cầu, phá vỡ tế bào máy lắc phút Sản phẩm dùng tách chiết tiếp DNA bảo quản 4℃ vài tuần -Cho thêm vào ống 0,1mg proteinase K lắc đề máy lắc phút - Ủ 50 µl giờ, 15 phút lắc lần - Cho thêm 300 µl NaCl bão hòa 6M, lắc máy lắc 5-10 phút - Ly tâm 2500 vòng /phút 10 phút - Loại bỏ cặn tủa protein, chuyển dịch chứa DNA qua ống khác - Cho nhẹ nhàng ethanol tuyệt đối vào ống có dịch chứa DNA, thể tích ethanol gấp lần thể tích dịch - Nghiên ống nhẹ nhàng xuất tủa DNA - Chuyển tủa sang ống Eppendorf có sẵn 200 µl TE, lắc nhẹ - Để sản phẩm 37℃ 2-3 tủa DNA tan hoàn toàn - Kiểm tra chất lượng DNA cách chạy điện di - Bảo quản DNA nhiệt độ 4℃, -20℃ -80℃ tùy thời gian cần giữ DNA ngắn hay dài 2.2/ Quy trình tách chiết truyền thống Nguyên lý tách chiết DNA Bước 1: Phá màng tế bào, màng nhân Nghiền tế bào, mô dung dịch chất tẩy (SDS) proteinase để phá vỡ màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA môi trường đồng thời phân hủy protein liên kết với DNA - Chất tẩy phân tử lưỡng cực, kết hợp với protein màng phân tử phospholipid làm phá vỡ cấu trúc màng - Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh, chất tẩy khơng ion hóa có tác dụng phá màng nhẹ Bước 2: Loại protein Sau phá vỡ tế bào, DNA trộn lẫn với thành phần khác tế bào chủ yếu protein dung dịch Việc quan trọng lúc tách DNA khỏi thành phần protein tế bào Để thực bước người ta chủ yếu sử dụng hỗn hợp Phenol/ Chloroform Phenol-Cloroform khơng tan nước có khả làm biến tính protein Do đó, protein bị tủa gặp Phenol Trong DNA khơng bị tủa phenol nên tan nước Khi ly tâm phenol/chloroform nặng lắng xuống dưới, protein tủa nằm ranh giới nước phenol, DNA nằm lại pha nước phía Thu pha nước chứa DNA để thực bước Bước 3: Tủa nucleic acid Sau bước tủa protein, DNA thu nằm dung dịch với dung môi nước Sử dụng ethanol isopropanol để tủa DNA dung dịch Sau ly tâm để thu cặn DNA Cặn DNA rửa ethnol 70% hai lần đểlàm mẫu Tiếp theo bay cồn huyền dịch hóa cận DNA thu đệm 3/ Xác định độ nguyên vẹn, độ tinh nồng độ ADN *Xác định độ nguyên vẹn - Khi phá vỡ màng tế bào ngoại lực DNA bị gãy - Xác định độ nguyên vẹn cách: • Mẫu điện ly gel agarose(0,8%) • Sau nhuộm gel dung dịch ethidium bromide soi qua ta cực tím để phát băng DNA • Mẫu xem có độ nguyên vẹn cao băng DNA gọn, tập trung rõ nét • Qua kiểm tra độ nguyên vẹn DNA xác định DNA lẫn RNA hay khơng PHẦN 3: ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC • Hồn chỉnh kỹ thuật chiết tách DNA từ tế bào ối ứng dụng chẩn đoán trước sinh *Nghiên cứu tiến hành chiết tách DNA từ loại dịch ối: dịch ối nguyên không nuôi cấy ( tế bào ối nguyên),dịch ối gồm tế bào ối thành phần tế bào bong q trình ni cấy ( tế bào ối bong), dịch ối gồm tế bào ối nuôi cấy( tế bào ối bám) Sử dụng kỹ thuật PCR nhân gen FMR1 *Đã chiết tách DNA từ loại tế bào ối nguyên, tế bào ối bong, tế bào ối bám DNA nguyên nhiều chiết tách tất loại tế bào ối Để tiết kiệm tế bào ối hay dich ối, cần chiết tách DNA từ tế bào ối thành phần tế bào ối bong q trình ni cấy Ứng dụng thành công việc nhân gen FMR1 DNA thai nhi chiết tách từ tế bào ối Gen FMR1 gì? • FMR1 gen quan trọng, xảy khiếm khuyết gen FMR1, diện NST X nguên nhân gây hội chứng Fragile X Có hai loại NST giới tính X Y Khiếm khuyết gen FMR1 biết đến thiểu trí tuệ fragile X1 protein gây cản trở gen sản xuất protein cách Protein đóng vai trò quan trọng chức hệ thần kinh • Chẩn đốn hội chứng fragile X việc xét nghiệm thực trẻ có biểu chậm phát triển có triệu chứng khác hội chứng vòng đầu lớn số khác biệt mặt Kiểm tra ADN \FMR1 xét nghiệm máu thực để chẩn đốn Xét nghiệm nhằm tìm kiếm thay đổi gen FMR1 liên quan đến hội chứng fragile X => Tách chiết DNA khâu quan trọng để thực phương pháp nhằm chuẩn đoán bệnh phát bệnh cách sớm THANKS FOR LISTENING ... về: chất lượng DNA , hàm lượng DNA, thời gian tiến hành, chi phí thực mức độ độc hại đói với người thực 2 Nguyên lý kĩ thuật tách chiết DNA Tách chiết DNA kĩ thuật hầu hết phòng thí nghiệm...  Phân tử DNA sau tách chiết cần đảm bảo số lượng chất lượng để đáp ứng phân thức sau Hiện thị trường có sẵn nhiều kít tách chiết DNA tiện dụng: - Việc nắm rõ nguyên lí tách chiết DNA qua trọng... dụng kỹ thuật PCR nhân gen FMR1 *Đã chiết tách DNA từ loại tế bào ối nguyên, tế bào ối bong, tế bào ối bám DNA nguyên nhiều chiết tách tất loại tế bào ối Để tiết kiệm tế bào ối hay dich ối, cần chiết