KĨ THUẬT WESTERN BLOT

KĨ THUẬT WESTERN BLOT MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG GIỚI THIỆU PHƯƠNG PHÁP WESTERN BLOT 1.1 Sơ lược Sir Edwin Southern 1.1.1 Sơ lược cá nhân 1.1.2 Thành tựu 1.2 Khái niệm 1.3 Ngun lí 1.4 Quy trình 1.4.1 chuẩn bị mẫu 1.4.2 chạy điện di chiều với SDS page 1.4.3 Chuyển protein từ gen đến màng 1.4.4 Lai với Antibody 1.4.5 Phát phân tích hình ảnh 1.5 Ưu, nhược điểm 1.5.1 Ưu điểm 1.5.2 Nhược điểm 1.5.3 Đọc kết xét nghiệm western blot 1.6 Hệ thống V3 Western Blot 1.7 So sánh với phương pháp ELISA 1.8 Ứng dụng CHƯƠNG 2: ỨNG DỤNG 2.1 Tình hình bệnh tác hại bệnh giới Việt Nam 2.1.1 Tình hình ni tơm giới 2.1.2 Tình hình ni tơm Việt Nam 2.2 giới thiệu hội chứng Taura-TS 2.2.1 Khái niệm 2.2.2 Đặc điểm cấu trúc gene Taura-TS 2.2.3 Biểu bệnh hội chứng Taura tôm 2.3 Các phương pháp kĩ thuật chuẩn đoán virus Taura 2.3.1 Chuẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng 2.3.2 Phương pháp miễn dịch 2.3.3 phương pháp chuẩn đoán mẫu dỏ gene 2.4 Vật liệu phương pháp 2.4.1 Các dung dịch gốc để nhuộm màu gel 2.4.2 Các dung dịch để thực Western Blot 2.4.3 Vật liệu 2.4.3.1 Kháng thể 1 2.4.3.2 Mẫu 2.4.4 Phương pháp 2.5 Kết KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO MỞ ĐẦU Với thành công công nghệ sinh học năm gần đây, giới phương hướng nghiên cứu ứng dụng công tác bảo vệ thực vật có chuyển hướng rõ rệt Cùng với thành cơng lớn cơng nghệ sinh học, kĩ thuật sinh học phân tử đời: phương pháp western blot, PCR,…Phương pháp western blot kĩ thuật quan tromg sử dụng tế bào sinh học phân tử Bằng cách sử dụng western blot, nhà nghiên cứu xác định protein cụ thể hỗn hợp phức tạp có chứa protein chiết xuất từ tế bào CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP WESTERN BLOT 1.1 Sơ lược Sir Edwin Southern 1.1.1 Sơ lược cá nhân 2 - Sir Edwin Southern nhà sinh học phân tử người Anh đoạt giải thưởng Lasker, giáo sư danh dự Đại học Oxford đồng nghiệp Trinity College, Oxford Ông biết đến rộng rãi với việc phát minh blot miền Nam, xuất năm 1975 quy trình thí nghiệm phổ biến phát triển Southern blot cho DNA vào năm 1997 1.1.2 Thành tựu - Người chiến thắng giải thưởng quốc tế Gairdner - Foundation (1990) Trao tặng Huân Chương Hoàng gia Hội Hoàng Gia - London (1998) Giải thưởng danh giá Albert Lasker cho nghiên cứu y học lâm sàng (2005) 1.2 Khái niệm - Western blot kĩ thuật xét nghiệm protein polyacrylamide gel chuyển đến môi trường bền vững - cố định Là kĩ thuật lai protein với protein(giữa kháng nguyên với kháng thể) protein kháng nguyên phát qua phản ứng tạo màu phát huỳnh quang 3 1.3 Nguyên lí Trong Western Blot, hỗn hợp protein phân tách điện di SDS-PAGE, miếng gel ngâm với sodium dodecyl sulfate (SDS) – tác nhân biến tính protein Các vạch protein chuyển lên màng nitrocellulose vạch protein phát cách ngâm màng cellulose với kháng thể đơn dòng đa dòng có gắn enzyme đánh dấu phóng xạ đặc hiệu cho protein quan tâm Nếu protein quan tâm kết hợp kháng thể đánh dấu phóng xạ, vị trí điểm phát cách chụp màng lên film X quang 1.4 Quy trình tiến hành 1.4.1 Xử lí mẫu - Nên lấy mẫu từ tồn mơ hay canh trường (môi trường nuôi cấy) tế bào Đầu tiên, xử lý mô rắn phương pháp học sử dụng máy nghiền (khi lượng mẫu lớn), sử dụng máy đồng hóa (máy nghiền đồng thể) siêu 4 âm (với số lượng mẫu nhỏ) Cũng phá hủy tế bào phương pháp hóa học Tuy nhiên, mẫu virus hay mẫu lấy từ mơi trường nguồn protein xác định Western Blot, không bắt buộc phải nghiên cứu tế bào - Có thể sử dụng loại chất tẩy rửa, muối, đệm để thúc đẩy ly giải tế bào hòa tan protein Thường bổ sung chất kìm hãm protease phosphatase để ngăn chặn phá hủy mẫu enzyme có mẫu Nên tiến hành chuẩn bị mơ nhiệt độ thấp để tránh tượng biến tính protein suy giảm (mất chức năng) - Phối hợp kỹ thuật hóa sinh học – bao gồm nhiều phương pháp lọc ly tâm – sử dụng để phân tách thành phần tế bào bào quan khác 1.4.2 Chạy điện di chiều với SDS page - Phổ biến điện di gel sử dụng gel polyacrylamide đệm nạp với SDS (sodium dodecylsulfate): chất khử amionic gây biến tính protein cách bao quanh khung polypeptide khiến phân tử duỗi thẳng 5 - Hỗn hợp protein hoà tan dung dịch sodium dodecyl sulfate(SDS), chất tẩy mang điện tích âm - phá tất nối khơng cộng hố trị protein ban đầu Điện tích âm có đựơc gắn với SDS lớn nhiều điện tích thân proteinban đầu; điện tích ban đầu protein không ảnh hưởng đáng kể đến điện tích phức hợp.Phức hợp SDS-protein sau mẫu để chạy điện di Sau mẫu nạp vào giếng - gel Độ phân giải SDS-Page rất lớn, phức hành tách thành hàng trăm vết bang gel Khi điện di kết thúc, protein gel nhìn thấy dãy băng cách nhuộm với bạc hay chất nhuộm màu Coomassie blue 1.4.3 Chuyển protein từ gen đến màng - Để protein vào để phát kháng thể, protein chuyển từ gel lên màng - nitrocellulose polyvinylidene difluoride (PVDF) Phương pháp để chyển protein sử dụng dòng điện để kéo protein gel vào protein gel vào PVDF màng nitrocellulose  Tính đồng hiệu tổng thể chuyển protein từ gel màng kiểm tra cách nhuồm màng với coomassise Brilliant Blue S thuốc nhuộm ponceau Ponceau S phổ biến hai, độ nhạy cao độ hoà tan nước, sau làm cho dễ dàng để sau destain thăm dò màng 1.4.4 Lai với Antibody 6 - Các protein chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí phân tách gel Rửa màng lai từ 5-10 phút dung dịch TBS - Ủ dung dịch khoá - sau rửamangf lai lần TBS, 5-10 cho lần rửa - Ủ màng lai cố định protein 1-2 với kháng thể sơ cấp (primary antibody) với kích động nhẹ Kháng thể sơ cấp kháng thể đặc hiệu, bám vào protein tạo thành phức hợp protein-kháng thể protein quan tâm - Sau rửa màng lai 2-6 lần với TTBS, 5-10 cho lần rửa - Tiếp theo ủ màng lai với kháng thể thứ cấp (secondary antibody) có enzyme (alkalin phosphatase horseradish peroxidase) kèm tiếng có kích động nhẹ - sau rửa màng lai 3-6 lần với TTBS, 5-10Min cho lần rửa - Sau rửa màng lai lần cuối với TBS - Tiếp tục ủ màng lai hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme Nếu việc diễn cách xác phát thấy băng nơi có mặt phức hợp protein-kháng thể thứ cấp-enzyme hay nói cách khác nơi có mặt protein quan tâm - Đặt phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát điểm sang phát enzyme 1.4.5 Phát phân tích hình ảnh 7 - Phương pháp phát đo màu phụ thuộc vào ủ màng lai với chất có khả phản ứng với enzyme (như peroxidase) rang buộc với kháng thể thứ cấp - Phản ứng diễn cách chuyển đổi thuốc nhuộm hồ tan thành dạng khơng hồ tan màu sắc khác tủa thành vết bên cạnh enzyme qua xuất vết màng - Các đầu dò gắn huỳnh quang kích thích ánh sang phát xạ kích thích sau phát photosensor CCD máy ảnh trang bị với lọc khí thải thích hợp chụp hình ảnh kĩ thuật số cho phép phân tích liệu xa phân tích trọng lượng phân tử số lượng phân tử - Phương pháp phát Chemilumnescent phụ thuộc vào ủ màng lai với chất luminesce tiếp xúc với reporter kháng thể thứ cấp Ánh sang sau phát phim ảnh, gần máy ảnh CCD chụp hình ảnh kĩ thuật số 1.5 Ưu, nhược điểm 1.5.1 Ưu điểm - Đây phương pháp xét nghiệm gián tiếp tìm kháng thể kháng kháng nguyên virus HIV, thường làm sau nguy tháng - xét nghiệm có giá trị khẳng định Theo tổ chức y tế giới quy định: để đánh giá trường hợp (+) dương tính với HIV cần thiết phải có mẫu thử dương tính: + Elisa + Western blot + Hoặc IFA + Western blot - Ưu điểm bật xét nghiệm kháng nguyên phát HIV1&2 kháng nguyên tinh chế điện li gel Polyacrylamide chuyển - sang giấy nitrocellulose ủ với huyết Hầu kháng thể kháng kháng nguyên HIV phát kể kháng thể kháng nguyên quan trọng nhất: 8 + Kháng thể P24 ( Kháng nguyên lõi tiền nhân P24 P55) + Kháng thể kháng gen vỏ gp160 mảnh tạo ran ó gp 120 + Kháng thể kháng protein màng gp41 mà hầu hết nhiễm HIV có liên quan đến cấp độ lâm sang họ + Kháng thể kháng sản phẩm gen Polymerase P31, P51, P66 + Kháng thể gen tat P14, gen nef P27, gen vif P23 gen gag P31.P9.P7 không thường xuyên xuất hiệ Nhạy Elisa pha lồng 2log huyết 1.5.2 Nhược điểm - Nhược điểm phương pháp xét nghiệ khó đắt Elisa, phụ thuộc chủ quan người đọc mắt thường đòi hỏi thời gian 24h 1.5.3 Đọc kết xét nghiệm western blot - Đọc kết xét nghiệm Western blot : + Kết dương tính :  Theo trung tâm kiểm sốt bệnh tật Mỹ CDC: có kháng thể kháng vỏ dải bang đặc trưng khác HIV Ngồi cần có có mặt P41 đủ để kết luận (+)  Theo tiêu chuẩn y tế giới: (+) có dải protein vỏ (+), Protein lõi, Protein Polymerase + Kết luận âm tính: khơng có dải bang đặc trưng cho HIV + Kết qủa không xác định:  Khi hình thái xuất dải bang khác không đủ tiêu chuẩn nêu phải xét nghiệm lại sau 2-3 tháng kháng thể kháng kháng nguyên lõi (P17 P24, P55) chứng tỏ có nhiễm trùng sớm với HIV  Bộ sinh phẩm đòi hỏi không dải bang không (-) coi âm tính phải có P24, P31, P41 hay P160 coi dương tính  Tỉ lệ (+) giả có ví có người Western blot (-) ni cấy lại (+) Tỉ lệ xảy khoảng 1/250 000 người sử dụng đồng thời Elisa Western Blot  Khuyến cáo sử sụng Elisa với Western blot để khẳng định HIV (+) 1.6 Hệ thống V3 Western Workflow 9 Bio-Rad’s V3 Western Workflow phương pháp gồm bước để đơn giản quy trình western blotting: B1: Tách biệt protein Chứa công nghệ độc đáo xây dựng vào hoá học gel cho phép - nhanh chóng, chất lượng cao, tách biệt protein thời gian 15 phút - B2: Hình tượng hố protein Sử dụng cơng nghệ miễn phí vết,covalently liên kết với protein, sau 1phút kích hoạt MP ChemiDoc hình - B3: Chuyển protein Trans-Blot Turbo hệ thống protein máy chuyển giao nhanh chóng Làm giảm bước chuyển giao phút, trì chuyển protein cao hiệu loạt khối lượng phân tử - B4: Xác minh chuyển giao protein ChemiDoc MP hình kết hợp với cơng nghệ bẩn miễn phí cho phép xác minh chuyển protein - B5: Validate quantitate Có thể để xác nhận liệu wedtern thấm qua bình thường hố protein tổng số kết hợp với protein vệ sinh 1.7 So sánh với phương pháp ELISA 1.7.1 Phương pháp Elisa (enzyme immune assay) Còn gọi EIA ( enzyme immune assay) - Nguyên tắc: dựa kết hợp đặc hiệu kháng nguyên kháng thể gắn với enzyme liên kết đồng hoá trị Kháng nguyên gắn bó với giếng 10 10 plastic kháng thể liên kết với enzyme gắn với kháng nguyên Kháng thể không gắn kháng nguyên bị rửa trơi Enzyme giữ lại lượng kháng thể gắn enzyme phát cách cho them vào chất (introphenol phosphate) làm thay đổi màu hoạt tính enzyme Độ màu tạo thành tỉ lệ với lượng enzyme bám giếng plastic, từ suy lượng kháng thể, sau tiếp tục suy lượng kháng nguyên - Quy trình: + phương pháp thiết kế cho việc phát định lượng vật chất peptides, protein, antibodies,… + Kĩ thuật ELISA gồm thành phần tham gia phản ứng: kháng nguyê, kháng thể chất tạo màu, thực qua bước:  Phản ứng miễn dịch học: kết hợp kháng nguyên kháng thể  Phản ứng hố học: thơng qua hoạt tính xúc tác enzyme làm giải phóng oxy ngun tử [O] từ H2O để oxy hoá chất thị màu, làm thay đổi màu hỗn hợp dung dịch thí nghiệm + Kĩ thuật nhạy cảm đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên hay kháng thể nồng độ thấp 1.7.2 So sánh - Phát màu - Mẫu dò + Trích từ protein tế bào + Phức hợp protein-kháng nguyên sơ câp-kháng nguyên thứ cấp + Gắn với enzyme đánh dấu phóng xạ + Chạy gel SDS-PAGE + Tắc nghẽn với protein dư + Kháng thể đối kháng với protein X đánh dấu phóng xạ hay enzyme + Trích từ kháng nguyên + Phức hợp kháng nguyên-kháng thể + Cho thêm chất tạo màu 11 11 + Chạy đĩa plastic + Tắc nghẽn với kháng nguyên dư + Kháng thể gắn đặc hiệu với kháng nguyên thông qua enzyme 1.8 Ứng dụng Phương pháp western blot ứng dụng để: - Xác định hoạt động gen thơng qua có mặt - protein mô Đánh giá mức độ hoạt động mạnh yếu gen mục tiêu Đánh giá độ lớn gen mục tiêu Định dạng protein mục tiêu Phân tích trồng chuyển đổi gen Đánh gía tính chuyên biệt antibody Phân tích bệnh vi khuẩn virus gây Phân tích phát triển thực vật Trong thực tế, western blot ứng dụng để: - Xác định bênh nhân có kháng thể chống HIV mẫu huyết không Western Blot sử dụng thử nghiệm xác minh nhiễm viêm gan B CHƯƠNG 2: ỨNG DỤNG 2.1 Tình hình bệnh tác hại bệnh giới Việt Nam 2.1.1 Tình hình ni tơm giới Hiện nay, nghề nuôi tôm đà phát triển mạnh vầ nghành đem lại thu nhập lớn cho kinh tế quốc dân số nước giới Tuy nhiên, nghề ni tơm gặp khơng khó khan tơm mắc bệnh gây chết hang loạt Một rong bệnh nguy hiểm tôm nuôi virus gây nên virus hội chứng Taura (TSV) Bệnh xảy tất cẩ nước nuôi tôm ảnh hưởng lớn đến nghề nuôi tôm công nghiệp giới (Nguyễn Văn Hảo,2000) Trong thời gian qua, virus hội chứng taura(TSV) bùng phát nhiều khu vực nuôi tôm giới, đặc biệt nước châu Mỹ12 12 Latinh Vào tháng 4/2005 virus hội chứng Taura lại gây dịch lớn Châu Mỹ(Infofis, 6/4/2005), khiến sản lượng tôm Venezuela sụt giảm khoảng 90% Và virus hội chứng Taura lây lan sang nước Châu Á tôm TCT du nhập nuôi nhiều Đài Loan, Trung Quốc, Thái Lan Năm 1999/2000 TSV phát TCT Trung Quốc Đài Loan (Tu et al., 1999; Yu Song,2000) với 19 trường hợp thông báo cho OEI từ Đài Loan vào năm 1999, dẫn đến 700.000 trường hợp 200.000 tôm chết vào năm 2000 dẫn đến 500.000 trường hợp vầ 50.000 tơm chết vào năm 2001 2.1.2 Tình hình ni tơm Việt Nam Việt Nam có nhiều điều kiện thuận lợi để phát triển nghề nuôi tôm biển Sản lượng tơm xuất tồn quốc đạt 40-45 ngàn tấn/năm, chiếm gần 10% sản lượng tôm Châu Á, mang lại lợi ích đáng kểcho người ni tơm (Lý Thị Thanh Loan 2001) Cùng với phát triển nghề nuôi tôm qui mô công nghiệp,”dịch bệnh” tôm Việt Nam bắt đầu xuất từ năm đầu thập niên 90 Năm2003, bệnh hội chứng Taura bùng phát tôm thẻ chân trắng, gây ảnh hưởng nghiêm trọng nhiều vùng nuôi Quảng Ninh, Phú Yên, Bạc Liêu, Cà Mau 2.2 Giới thiệu hội chứng Taura-TS 2.2.1 Khái niệm Tên phổ thông thường gọi virus gây bệnh hội chứng Taura(TSV) Ngồi có số tên gọi khác tác nhân gây bệnh hội chứng Taura (Taura Syndrome Disease-TSD); bệnh đỏ đuôi (Red Tail Disase-RTD) (Lightner,1996) 2.2.2 Đặc điểm cấu 13 13 trúc gene Taura- TS TST loại virus RNA có dạng hình khối 20 mặt, đường kính 30-32nm, Khơng - có vỏ envelope chép nguyên sinh chất tế bào vật chủ Genome TSV có kích thước khoảng 9kb, xoắn đơn thẳng, có 10.205 nucleotid, tạo chuỗi poly-A-3’, chứa hai khung đọc mở (Open Reading Frame-ORF) lớn 2.2.3 Biểu bệnh hội chứng Taura Tôm Hội chứng Taura biết bệnh tơm thẻ chân trắng giai đoạn nhỏ xảy xa khoảng 14-40 ngày sau thả Tôm bị hội chứng Taura thường lầ hội chứng loại tôm giống nhỏ, khoảng 0.05-5g , nhiên tôm lớn bị ảnh hưởng Q trình diễn biến bệnh hội chứng Taura xuất chủ yếu giai đoạn chu kì lột xác Biểu bệnh tiến triển theo hai pha: + Pha tiền cấp tính có biểu hiện:  Thường thấy tơm chết hấp hối lưới nằm đáy bể  Tôm thường yếu phương hướng di chuyển  Biểu lan toả vùng sắc tố đỏ làm cho tồn thân tơm có màu đỏ nhạt, quạt chân bò có màu đỏ rõ rệt thường chết lột xác 14 14  Vỏ mềm, ruột trống rỗng thường giai đoạn muộn chu kì lột xác  Là điểm nhạy cảm trình phát sinh bệnh hội chứng Taura + Pha mãn tính có biểu hiện: Biểu kiểu tổn thương bệnh vi khuẩn gây có nhiều điểm bị đen hố 2.3 Các phương pháp kỹ thuật chẩn đoán virus Taura 2.3.1 Chẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng Ở thời kì phát bệnh tơm có màu đỏ nhợt nhạt, tồn vỏ thân có màu đỏ rõ rệt (bệnh đỏ thân, hồng thể) kèm theo dấu hiệu tiêu biểu mỏng vỏ, xoang tiêu hố rỗng, tơm thường chết nhiều thời kì lột xác 2.3.2 Phươn g pháp miễn dịch Có thể sử dụng Monoclonal Antibodies (Mas) để xác định TSV mẫu huyết dịch tế bào đồng thể từ tơm Mas áp dụng để kiểm tra mẫu mô đông lạnh, cố định Hiện thị trường có sản phẩm DiagXotics 2.3.3 Phươn g pháp chẩn đoán 15 15 mẫu dò gen Ngun lí phương pháp sử dụng đoạn oligonucleotide (thiết kế trình tự gene đặc hiệu TSV) gắn với chất thị gọi mẫu dò (probe) Chất thị enzyme, đồng vị chất phát huỳnh quang…Sau lai probe với DNA-RNA virus Những probe tổng hợp phòng thí nghiệm từ nguồn thương mại Phương pháp có độ xác đặc hiệu, độ nhạy lớn phương pháp chẩn đoán truyền thống, tế bào học cổ điển 2.4 Vật liệu phương pháp 2.4.1 Các dung dịch gốc để nhuộm - gel Dung dịch nhuộm (0.025% Coomassie Brillant Blue R250; 40% methanol; 7% - acetic acid) Dung dịch giải nhuộm I (40% methanol; 7% acetic acid) Dung dịch giải nhuộm II (5% methanol; 7% acetic acid) 2.4.2 Các dung dịch gốc để thực wester n blot Towbin transferbuffer (25mM Tris, 192mM glycine, 20%meOH, 0.1%SDS) 2.4.3.1 Kháng thể 16 2.4.3 Vật liệu 16 2.4.3.1 - Kháng thể sơ cấp: kháng thể đa dòng tổng hợp kháng với WSSV, IHHNV, MBV, YHV (được sản phòng thí nghiệm Cơng Nghệ Tế Bào Động Vật-Viện - Sinh Học Nhiệt Đới) Kháng thể sơ cấp: kháng thể đa dòng đặc hiệu với RTV ( sản phòng thí nghiệm Cơng Nghệ Tế Bào Động Vật-Viện Sinh Học Nhiệt Đới) - Kháng thể thứ cấp: IgG kháng huyết thỏ kháng IgY, đánh dấu enzyme Peroxidase 2.4.3.2 Mẫu - Chuẩn bị mẫu + Protease tôm loài động vật thuỷ sinh khác protease nội bào, tập trung nhiều quan tiêu hố , sau dến nội tạng thịt Đặc biệt tơm đặc điểm hệ tiêu hố nội tạng nằm phần đầu nên hệ enzyme tập trung nhiều phần đầu sau đến quan khác + Mẫu đầu nội tạng tôm sú phân tách từ tôm sú sống , loại 40-50 con/kg nuôi Cần Thơ Tôm chở thùng sục khí phòng thí nghiệm , rửa giất chết cách trộn với đá vụn , tỷ lệ tơm/ đá 1:3, sau tách lấy đầu nội tạng +Xay đầu tôm cối xay thịt , nghiền nhuyễn cối inox với cát thạch anh xử lý làm Nội tạng nghiền Dùng dung môi (nước cất , dung dịch muối sinh lí, đệm phosphate, đệm Tris HCl) với tỉ lệ khác , khuấy đảo liên tục điều kiện nhiệt độ 0-4 độ C 40 phút để chiết rút enzyme , ly tâm lạnh độ C , tốc độ 6000 vòng/phút 15 p để loại bỏ phần cặn , thu dịch chiết (DC) Khảo sát ảnh hưởng tỷ lẹ dung môi loại dung môi chiết với mẫu - Mẫu lấy + Virut gây hội chứng đỏ đuôi thu từ tôm sú (RTV- Pm) nhân lên tế bào côn trùng SF9 + Virut gây hội chứng đuôi thu từ tôm thẻ chân trắng (RTV- Pv) nhân lên tế bào côn trùng SF9 2.4.4 Phươn g pháp 17 17 Khá 2.4.4.1 Phương pháp SDS-PAGE - SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) phương pháp điện di protein đứng, để phân tách thành phần protein theo trọng lượng phân tử - Chuẩn bị mẫu để điện di: +Mẫu nhận trực tiếp từ phòng Công Nghệ Tế Bào Động Vật-Viện Sinh Học Nhiệt Đới +Trong Tube Eppendorf, trộn thể tích (V) mẫu protein với thể tích (V) 2X Treatment buffer.Đặt vào nồi đun cách thuỷ sôi phút Mẫu sau chuẩn bị xong nên giữ đá bào thực thí nghiệm + Dùng pipette với đầu tip (cone) nhỏ, cho mẫu từ từ vào giếng gel.Luôn để giếng chứa thang protein chuẩn -Thực điện di +Đậy nắp máng điện di Nối điện cực vào cấp điện + Bật điện nguồn Chỉnh dòng điện 100mA + Quan sát di chuyển vạch màu gel điện di, vạch màu chạm đáy gel, tắt điện nguồn Quá trình điện di hồn tất + Đổ bỏ dung dịch điện di Gở khuôn gel máng Cẩn thận gở tách gel khỏi khuôn gel để tiến hành nhuộm hay blotting 2.4.4.2 Phương pháp Western Blot Sau thực chuyển Protein lên gel SDS ta thực phản ứng gắn protein-kháng thể phương pháp Western blot với bước sau:  Tách bỏ phần stacking gel khỏi running gel Ngâm running gel Towbin transfer buffer 5-15 phút để cân ion  Ứng với gel, cắt giấy thấm màng nitrocellulose cho vừa với cassetle  Làm ướt màng nitrocellulose cách thả dần vào khay nước nước cất 2-3 phút  Đặt gel lên màng cho vào hai tờ giấy thấm dày cắt bước Sau kẹp chúng vào hai bọc nylon mềm (sponge) kẹp vào cassette Tất thao tác phải thực khay chứa Towbin transfer buffer 18 18  Dùng pipette thuỷ tinh lăn lên để đuổi bỏ bọt khí (nếu có) lớp  Cho dung dịch Towbin transfer buffer vào buồng để ngập hai hai lưới điện cực  Cho cassette chuẩn bị bước vào buồng, ý đặt mặt có màng nitrocellulose gần lưới điện cực [+]  Đặt buồng lên máy khuấy từ Nối hệ thống làm lạnh vào buồng Bật máy     quay từ để làm lạnh dung dịch đệm trình chuyển band Nối buồng với cấp Bật điện cấp điều chỉnh điện 50V Sau hoàn tất chuyển band, chuyển điện zero, tắt nguồn điện Tháo cassette lấy màng khỏi hệ thống Màng nitrocellulose đưa vào quy trinh phát phản ứng miễn dịch  Ủ màng 100ml dung dịch TTBS TTBS có chứa 5% skim milk (blocking buffer) nhiệt độ phòng hay qua đêm độ C  Đổ bỏ dịch này, Rửa lần Trong 10 phút với TTBS, tiếp tục ủ màng với TTBS có pha kháng thể đặc hiệu (primary antibody) độ pha loãng 1/5000 Thời gian ủ 60 phút 37độ C  Rửa màng lần 10 phút TTBS  Ủ tiếp màng dung dịch TTBS có pha kháng thể cộng hợp nộng độ 1/50000 Thời gian ủ 60 phút 37 độ C  Rửa màng 10p TTBS Sau bước này, tiến hành trình sinh màu  Cho màng vào dung dịch màu( pha dung dịch màu cách cho 1mg DAB vào 4ml PBS ,trộn Lọc qua giấy lọc Sau cho 120ul dung dịch CoCl2 1% vào dịch lọc Tiếp tục cho 3ul H2O2 vào dịch pha) Ủ tối 5- 30p màu xanh nâu band đặc hiệu rõ  Rửa màng nhiều lần với nước cất Chụp hình Nếu muốn lưu lại dể khơ gói giấy bạc  Mẫu phân loại điện di gel polyacrylamide12,5% chuyển thấm qua màng nitrocellulose blocking TTBS hoăc TTBS có chứa 5% skim milk  Ủ với kháng nguyên mục tiêu màng với kháng thể sơ cấp  Rửa  Hiện màu  Chụp hình 2.5 Kết - Giếng 1: Thang protein chuẩn Low Range 19 19 - Giếng 2,3: Dịch siêu ly tâm tế bào nhiễm RTV từ tôm sú thu Long An (RTVPmLA/SLT) - Giếng 4,5: Dịch tế bào (DTB) Sf9 - Giếng 6,7: DTB nhiễm RTV từ tôm sú thu Cần Giờ bị bệnh (RTV-PmCG) - Giếng 8: DTB nhiễm virus thu từ tôm sú long An bị bệnh RTV (RT-PmLA) - Giếng 9,10: DTB nhiễm RTV từ tôm thẻ chân trắng (RTV-PvM)  Nhận xét: Kết cho thấy số vạch protein từ gel điện di thể màng lai Đó protein gắn đặc hiệu với kháng thể Kết qủa xác định số vạch protein từ mẫu nhiễm virus khác so với mẫu tế bào đối chứng KẾT LUẬN Western blot kĩ thuật phân tích sử dụng rộng rãi để phát triển protein cụ thể mẫu Sử dụng điện di gen tách protein có nguồn gốc biến tính chiều dài chuỗi polypeptide cấu trúc 3-D protein Các protein chuyển giao cho màng, nơi thăm dò (phát hiện) cách sử dụng kháng thể đặc hiệu vớiprotein Western blot sử dụng lĩnh vực sinh học phân tử, hoá sinh, immuunogenetics ngành sinh học phân tử khác TÀI LIỆU THAM KHẢO https://www.google.com.vn/search? tbm=isch&sa=1&ei=BiYoW93aAcG0rQGwmYygDQ&q=V3+WESTERN+WORKF LOW&oq=V3+WESTERN+WORKFLOW&gs_l=img.3 3209.5230.0.5759.10.10 20 20 0.0.0.0.171.1292.0j10.10.0 1c.1.64.img 0.0.0 0.TzZGgSOjXmI#imgdii= 1adfEMp_sRPw2M:&imgrc=F3hLYSy7Cal4CM:1 http://www.bio-rad.com/en-us/sku/1708292-v3-western-workflowcomplete-system-for-mini-gels?ID=1708292 https://en.wikipedia.org/wiki/Western_blot http://www.wattpad.com/371606-c%C3%B4ng-ngh %E1%BB%87-dna-t%C3%A1i-t%E1%BB%95-h %E1%BB%A3p-c%C3%B4ng-ngh%E1%BB%87-sinh- h%E1%BB%8Dc?p=85 2.5.1.1 Phư phá PAG 21 21 ... nghệ sinh học, kĩ thuật sinh học phân tử đời: phương pháp western blot, PCR,…Phương pháp western blot kĩ thuật quan tromg sử dụng tế bào sinh học phân tử Bằng cách sử dụng western blot, nhà nghiên... người Western blot (-) nuôi cấy lại (+) Tỉ lệ xảy khoảng 1/250 000 người sử dụng đồng thời Elisa Western Blot  Khuyến cáo sử sụng Elisa với Western blot để khẳng định HIV (+) 1.6 Hệ thống V3 Western. .. cứu y học lâm sàng (2005) 1.2 Khái niệm - Western blot kĩ thuật xét nghiệm protein polyacrylamide gel chuyển đến môi trường bền vững - cố định Là kĩ thuật lai protein với protein(giữa kháng nguyên