Nghiên cứu cây chè dây sapa ( ampelopsis cantoniensis ( hook et arn ) planch vitaceae )

Những nghiên cứu về tác dụng sinh học của cây chè dây A... Phạm Thanh Kỳ nghiên cứu về đặc điểm thực vật, xác định tên khoa học, về thành phần hóa học, về độc tính và một số tác dụng sin

♦ ♦ ♦ ♦

VƯƠNG THỊ HỒNG VÂN

NGHIÊN CỨU CÂY CHÈ DÂY SAPA

(Ampelopsis cantonỉensis (Hook, et Arn.) Planch Vitaceae)

Chuyên ngành: Dược Iiệu-dược học cổ truyền

Trong quá trình nghiên cứu đề tài này tôi luôn nhận được sự quan tâm hướng dẫn tận tình của các thầy cô.

Để tỏ lòng biết ơn của mình tôi xin chân thành cảm ơn:

GS.TS Phạm Thanh Kỳ là người thầy đã hết lòng giúp đỡ hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn:

GS Vũ Văn Chuyên

KS Nguyễn Văn Chăm - Bộ môn giải phẫu - Trường ĐH Y Hà Nội

TS Đỗ Ngọc Thanh - Phòng thí nghiệm trung tâm - Trường ĐH Dược

Hà Nội

PGS TS Chu Đình Kính - Viện Hóa học

TS Trần Vân Hiền - Phòng Đông y thực nghiệm - Viện Y học cổ truyền Việt Nam

Tôi xin chân thành cảm ơn:

PGS TS Phạm Quang Tùng - Phòng sau đại học

Các thầy cô trong bộ môn Dược liệu, các cán bộ Phòng đào đạo sau đại học và các bộ môn, phòng ban khác của trường Đại học Dược Hà Nội.

Các cán bộ Phòng Đông y thực nghiệm -Viện Y học cổ truyền Việt Nam.

Đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này.

Xin chân thành cảm ơn.

DS Vương Thị Hồng Vân

Phần I TỔNG QUAN 2

1.1.Vị trí phân loại, phân bố và đặc điểm thực v ậ t 2

1.1.1 Vị trí phân loại, phân bố và đặc điểm thực vật của họ Nho (Vitaceae) 2

1.1.1.1 Vị trí phân loại và sự phân bố của họ N h o 2

1.1.1.2 Đặc điểm thực vật của họ N h o 3

1.1.2 Vị trí phân loại, phân bố và đặc điểm thực vật của chi Am pelopsis 4

1.12.1 Vị trí phân loại chi Ampelopsis 4

1.1.2.2 Số loài và sự phân bô' của chi Ampelopsis 5

1.1.23 Đặc điểm thực vật của chi Ampelopsis 5

1.1.3 Đặc điểm thực vật, sự phân bố của cây chè dây (Ampelopsis cantoniensis Planch.) 5

1.2 Những nghiên cứu về thành phần hóa học 7

1.2.1 Những nghiên cứu về thành phần hóa học có trong chi Ampelopsis 7

1.2.2 Những nghiên cứu về thành phần hóa học của loài Ampelopsis cantoniensis Planch 10

1.2.3 Những nghiên cứu về myricetin 1 1 1.2.5 Những nghiên cứu về dihydromyricetin 1 1 1.3 Những nghiên cứu vê tác dụng sinh học và công d ụ n g 12

1.3.1 Những nghiên cứu về tác dụng sinh học của một số loài Ampelopsis 1

1.3.2 Những nghiên cứu về tác dụng sinh học của cây chè dây (A cantoniensis Planch.) 14

1.3.3.2 Kết quả nghiên cứu về tác dụng điều trị

loét dạ dày - hành tá tràng của chế phẩm Ampeỉop

sản xuất từ chè dây (A cantoniensis Planch.) 16

Phần II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ú u 18

2.1 Nguyên liệu 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Nghiên cứu về thực vật 18

2.2.2 Nghiên cứu về thành phần hoá học 18

2.2.3 Nghiên cứu về tác dụng sinh học 19

2.2.3.1 Tác dụng chống oxy h ó a 19

2.2.32 Tác dụng ức chế khối u của flavonoid toàn phần 21

Phần III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 23

3.1 Kết quả nghiên cứu vê thực v ật 23

3.1.1 Đặc điểm hình thái cây chè dây Sa Pa 23

3.1.2 Đặc điểm vi học cây chè dây Sa Pa 26

3.1.2.1 Đặc điểm vi phẫu thân 26

3.1.2.2 Đặc điểm vi phẫu lá 26

3.1.2.3 Đặc điểm bột lá 27

3.2 Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học 29

3.2.1 Định tính các nhóm chất trong lá cây chè dây bằng phản ứng hoá học 29

3.2.2 Định tính flavonoid bằng SKLM 36

3.2.3 Định lượng flavonoid toàn phần 38

3.2.4 Định lượng tanin 39

3.2.5 Chiết xuất flavonoid toàn phần trong lá cây chè dây Sa Pa 41

3.2.8 Nhận dạng SP3 46

3.3 Kết quả thử tác dụng chống oxy hóa v à ức chê khối u 48

3.3.1 Kết quả thử tác dụng chống oxy hóa 48

3.3.1.1 Thử tác dụng chống oxy hóa bảo vệ tế bào não chuột của MF, MFS, SP ị và SP2 48

3.3.1.2 Xác định hoạt tính dọn gốc tự do anion superoxide 0 2- ' của MF, MFS, SPj và SP2 54

3.3.1.3 Thử tác dụng của flavonoid toàn phần đến hàm lượng MDA não và gan chuột chịu sốc điện và stress tâm lý 57

3.3.2 Kết quả thử tác dụng ức chế khối u của flavonoid toàn phần 60

Phần IV BÀN LUẬN VỂ KÊT QUẢ 65

4.1 Về m ặt thực v ật 65

4.2 Về m ặt hóa học 65

4.3 Về mặt tác dụng sinh học 6 6 Phần IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 6 8 TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 PHU LUC

STT Ký hiệu Nội dung Trang

1 Bảng 1.1 Số loài của các chi trong họ Nho (Vitaceae) 2

2 Bảng 1.2 Thành phần hóa học có trong một số loài trong chi

Ampelopsis

8

3 Bảng 1.3 Một số flavonoid trong chi Ampelopsis 9

4 Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ 35

5 Bảng 3.2 Vị trí, mầu sắc các vết flavonoid trên SKLM 37

6 Bảng 3.3 Kết quả định lượng flavonoid toàn phần trong lá

17 Bảng 3.14 Tác dụng của dung dịch MF đối với sự tạo thành

anion superoxide trong hệ thống xanthine/xanthine oxidase (dd thử MF lm g/lm l)

54

18 Bảng 3.15 Tác dụng của dung dịch MFS đối với sự tạo thành

anion superoxide trong hệ thống xanthine/xanthine oxidase (dd thử MFS lm g/lm l)

55

19 Bảng 3.16 Tác dụng của dung dịch SPj đối với sự tạo thành

anion superoxide trong hệ thống xanthine/xanthine oxidase (dd thử SPj 0,5mg/ml)

55

2 0 Bảng 3.17 Tác dụng của dung dịch SP2 đối với sự tạo thành

anion superoxide trong hệ thống xanthine/xanthine oxidase (dd thử SP2 0,25mg/lml)

STT Ký hiệu Nội dung Trang

1 Hình 1.1 Vị trí của chi Ampelopsis trong hệ thống phân

loai thưc vât

16 Hình 3.15 Biểu đồ so sánh hàm lượng MDA của lô điều trị

MF và lô đối chứng ở các thời điểm khác nhau

52

18 Hình 3.17 Biểu đồ so sánh tỷ lệ chuột có u trong 13 tuần

2 2 Hình 3.21 Ảnh chuột số 1 lô đối chứng 63

ĐẬT VẤN ĐỂ •

Việt nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới có thảm thực vật rất phong phú và đa dạng, do đó cũng có nguồn dược liệu rất quý và dồi dào Chè dây Cao Bằng là dược liệu đã được nhóm nghiên cứu của GS.TS Phạm Thanh Kỳ nghiên cứu về đặc điểm thực vật, xác định tên khoa học, về thành phần hóa học, về độc tính và một số tác dụng sinh học theo hướng điều trị loét dạ dày- hành tá tràng Tác giả đã được Bộ y tế cho phép sản xuất chế phẩm AMPELOP chữa viêm loét dạ dày-hành tá tràng Qua các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi nhận thấy chè dây là dược liệu có tiềm năng khai thác tốt Để góp phần nâng cao giá trị sử dụng và mở rộng phạm vi khai thác của cây chè dây, chúng tôi được giao nhiệm vụ nghiên cứu cây chè dây mọc ở vùng Sa Pa với mục tiêu so sánh chè dây Sa Pa với chè dây Cao Bằng đã được nghiên cứu

Vì vậy, trong công trình này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các nội dung chính sau:

• Về thực vật: - Mô tả đặc điểm thực vật, kiểm định tên khoa học của cây được gọi là chè dây Sa Pa

- Mô tả đặc điểm vi phẫu và đặc điểm bột dược liệu

• Về hóa học: - Định tính các nhóm chất trong lá chè dây Cao Bằng và Sa Pa

- Định tính và định lượng so sánh flavonoid ở 2 cây trên

- Định lượng tanin trong 2 dược liệu

- Chiết xuất và phân lập các chất chính

• Về tác dụng sinh học:

- Thử tác dụng chống oxy hóa:

+ Tác dụng chống oxy hóa bảo vệ tế bào não+ Tác dụng dọn gốc tự do anion superoxide+ Tác dụng lên MDA chuột chịu sốc điện và stress tâm lý

- Thử tác dụng ức chế khối u

TỔNG QUAN

1.1 VỊ TRÍ PHÂN LOẠI, PHÂN B ố VÀ ĐẶC ĐlỂM THựC VẬT:

1.1.1 Vị trí phân loại, phân bố và đặc điểm thực vật của họ Nho

(Vitaceae):

1.1.1.1 Vị trí phân loại và sự phân bố của họ Nho:

Trong hệ phân loại thực vật, họ Nho (’Vitaceae) không phải là một họ lớn Trước đây, họ Nho có tên Latin là Ampelidaceae được xếp vào bộ Táo ta (.Rhamnales) Từ năm 1987, theo hệ phân loại thực vật của Takhtajan, họ Nho

và họ Gối hạc (Leeaceae) tách ra thành hai họ độc lập nằm trong bộ Nho (’Vitales) Hiện nay, một số tài liệu vẫn cho rằng chi duy nhất Leea của họ Gối hạc (Leeaceae) là một chi thuộc họ Nho và đều nằm trong bộ Táo ta Trên thế

giới, họ Nho có tất cả 10 chi với trên 700 loài, được phân bố ở vùng nhiệt đới

và cận nhiệt đới, một số ít ở vùng ôn đới Ở Việt Nam có 7 chi với số loài khác

nhau tùy theo từng tài liệu được trình bày ở bảng 1 1 :

Chú thích: *: loài thuộc diện bảo tồn

1.1.1.2 Đặc điểm thực vật của họ Nho:

Các cây trong họ Nho có các đặc điểm chung như:

Theo Nguyễn Tiến Bân [5]: Cây dạng dây leo thân gỗ có tua cuốn Lá thường xẻ thùy chân vịt với gân chân vịt hoặc lá kép chân vịt gồm 3-5-7 lá chét, ít khi lá kép lông chim Hoa mẫu 4-5 Nhị đối diện với cánh hoa và dính vào mép ngoài của triền Bộ nhụy gồm 2 lá noãn hợp thành bầu trên 2 (6 ) ô, mỗi ô chia 2 (1) lá noãn Thường là quả mọng, hạt thường có nội nhũ

Theo Vũ Văn Chuyên [7]: Cây có dạng dây leo hoặc dạng bụi leo nhờ tua cuốn, chỉ một số ít là cây bụi thẳng đứng hoặc cây gỗ nhỏ Tua cuốn có nguồn gốc từ thân, mọc đối diện với lá Đặc điểm trên tạo nên cấu tạo hợp trục rất điển hình của thân cây họ Nho Lá mọc so le có lá kèm, có hình dạng khác nhau Lá đơn nguyên, khía thùy hoặc kép chân vịt Hoa nhỏ tập trung thành cụm hoa xim, ngù hay chùm Hoa lưỡng tính hay có khi giảm trở thành hoa đơn tính Hoa mẫu 4-5 Đài hoa không phát triển, trông như những vảy nhỏ, 4-

5 cánh hoa xếp xen kẽ với các lá đài Số nhị bằng số cánh hoa Giữa bộ nhị và

bộ nhụy có đĩa mật phát triển hình vòng khuyên hay khía thùy hoặc chỉ là những tuyến riêng rẽ Nhụy gồm hai lá noãn dính lại với nhau thành bầu trên

có hai ô, trong mỗi ô có hai noãn, một vòi nhụy Núm nhụy hình đĩa hoặc hình đầu Quả mọng, hạt phôi nhỏ và có nội nhũ Thụ phấn nhờ gió

1.1.2 Vị trí phân loại, phân bô và đặc điểm thực vật của chi

A m pelopsis:

1.1.2.1 Vị trí phân loại chi Ampelopsis:

Theo hệ thống phân loại Takhtajan 1987, chi Ampelopsis có vị trí phân

loại được trình bày ở hình 1.1 [3, 6 ]

Hình 1.1 Vị trí của chi Ampelopsis trong hệ thống phân loại thực vật.

1.1.2.2 S ố loài và sự phân bố của chi Ampelopsis:

Chi Ampelopsis là một trong những chi điển hình của họ Nho do có

nhiều cây đã được nghiên cứu dùng để làm thuốc

Theo một báo cáo tại Ukraine, có 5 loài và 3 dạng đã được khẳng định

và được đưa về trồng trong vườn thực vật Donetsk gồm: A heterophylla (A

brevipenduculata), A heterophylla f elegans, A bodinieri, A aconitifolia, A aconitifolia f auranticarpina, A aconitifolia f glabra, A cordata và A vitifolia [24], không thấy có A cantoniensis.

ở Việt Nam có 4 loài: A brevipedunculata (Maxim.) Trautv.

A cantoniensis (Hook, et Arn.) Planch.

A heterophylla Sieb et Zucc.

A japonica (Thunb.) Makino.

Các loài trên có ở Nam Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Indonexia, Lào,

Ấn Độ Ở Việt Nam có ở các tỉnh miền núi phía bắc, Hà Nội, Ninh Bình và Tây Nguyên [6 ]

1.1.2.3 Đặc điểm thực vật của chi Ampelopsis:

Chi Ampelopsis được mô tả với các đặc điểm chung của họ Nho là:

dạng dây leo, lá kép hay đơn có chia thùy Hoa nhỏ tập trung thành cụm hoa xim, ngù hoặc tán mọc đối diện với lá Quả thường có hai ô, hai lá noãn Hạt

có hố nhỏ, hẹp và dài [5,6,7],

1.1.3 Đặc điểm thực yật và sự phân bô của cây chè dây (Ampelopsis

cantoniensis Planch.):

Theo Lecomte [39] loài Ampelopsis cantonỉensỉs Planch, chính là loài

Cissus cantoniensis Hooker et Am = Cissus diversifolia Walp Cũng có tác

giả gọi loài này là Vitis cantoniensis Seem Cả ba tên trên nay được dùng

chung với tên thông dụng là Ampelopsis cantoniensis Planch, và được mô tả

như sau: Thân thuộc loại dây leo, cành có lông nhỏ hình trụ mềm Tua cuốn chia 2-3 nhánh mọc đối diện với lá thay thế cho lá bị thoái hóa Lá kép lông chim có 7-11 lá chét Gốc lá tròn đôi khi hình tim, dài 25-75mm, rộng 15- 20mm Phiến lá nhẵn, mặt dưới ráp, nhạt, răng cưa đôi khi giảm thành mũi nhọn Gân cấp 2 có 4-5 đôi gân phụ tạo thành mạng lưới Cuống lá chét dài 3- 10mm Lá chét cuối cùng thường to, dài gấp đôi các lá chét khác Lá kèm hình mắt chim Cụm hoa xim hai ngả có cuống dài Hoa nhỏ, cuống rất ngắn Nụ hoa hình trứng tròn có những lông nhỏ Đài hình đầu, cánh hoa 5, chỉ nhị hình chỉ Nhụy hình trụ, đầu nhụy gần như hình đĩa, bầu chia hai ô có hai noãn Quả mọng nâu đen, hơi cay Hoa nở vào tháng 6, quả chín vào tháng 9

Theo Phạm Hoàng Hộ [9] mô tả A cantoniensis Planch (Song nho

Quảng Đông) với các đặc điểm: dây leo, thân hơi cứng; vòi đối diện với lá, chẻ hai Lá hai lần kép, mang lá chét mỏng, giòn, mép lá có ít răng thấp, gân phụ 4-5 cặp, lá kèm tròn to Ngù thưa, nụ tròn, hoa 5 phân, cánh hoa dài Quả hình xoan 6*5mm, đen, 3-4 hạt

Sách “Cây cỏ Việt Nam” ghi: trên thế giới cây có ở Lào, Trung Quốc,

Indonexia, Ân Độ, thứ Harmadi Planch, (lá chét không có cuống) có ở Campuchia [9] Ở Việt Nam cây có ở: Cao Bằng, Lào Cai, Lạng Sơn, Hải Phòng, Quảng Ninh, Uông Bí, Hoà Bình, Bắc Thái, Hà Tây, Ninh Bình [6,9]

1.2 N H Ữ N G NGHIÊN c ứ u VỂ T H À N H P H Ầ N H Ó A HỌC:

1.2.1 Những nghiên cứu về thành phần hóa học có trong chi

A m pelopsis:

Nghiên cứu về chi Ampelopsis trên thế giới chủ yếu tập trung vào loài

A brevipedunculata Trautv Phần lớn các bộ phận của cây đều được xác định

thành phần hóa học, đặc biệt là quả Yoshitama Kumijiro và cộng sự đã nghiên cứu thành phần hóa học của quả và sự liên quan giữa các thành phần đó với pH

và màu sắc của quả loài A brevipeduncuỉata Trautv Hai flavonoid và bốn

anthocyanin đã được xác định bằng các phương pháp phân tích phổ Hai flavonoid được xác định là quercitrin và myricetrin Bốn anthocyanin là:

Ở Việt Nam, A cantoniensis Planch, là cây đầu tiên trong chi này được

công bố về thành phần hóa học

Căn cứ vào các tài liệu thu thập được, chúng tôi tóm tắt thành phần hóa học một số loài trong chi Ampelopsis ở bảng 1.2 và các flavonoid đã được xác định cấu trúc hóa học ở bảng 1.3

Bảng 1.2: Thành phần hóa học có trong một số loài thuộc chi Ampelopsis:

ampelopsisionosis C19H30O9, ampelopsisrhamnosideC19H320 8

tachiosid, isotachiosid, lyonisid, rutinosid,

flavon (4,73%), protein (9,25%), nguyên tố vi lượng: K, Ca, Fe, Zn và các vitamin E, Bl, B2

[12][17]

[38]

A meliaefolia Lá myricetin (7,4%) và dihydromyricetin (1,7%) [17]

1.2.2 Những nghiên cứu về thành phần hóa học của loài

Am pelopsis cantoniensis Planch.:

1.2.2.1 Nghiên cứu ở nước ngoài:

Nghiên cứu về A cantoniensỉs trên thế giới hầu như không có Chúng

tôi chỉ tìm thấy hai bài báo của các tác giả Trung Quốc:

Theo Xu Zihong và cộng sự, trong lá A cantoniensis có flavone

(4,73%) protein (9,25%), rất giàu: K, Ca, Fe, Zn và các vitamin E, Bj và B2

[38]

Li Lai và cộng sự công bố phương pháp mới để tách ampelopsin từ lá A

cantoniensis với hàm lượng khoảng 10% [27].

1.2.2.2 Nghiên cứu trong nước:

Lá chè dây mọc ở Cao Bằng có flavonoid, tanin, đường Trong đó flavonoid có hàm lượng cao (18-19%) Tanin thuộc loại tanin catechic có hàm lượng 10,82 -13,3% [17,19]

Bằng SKLM với hệ dung môi: Toluen - Ethyl acetat - Acid formic

[5:6: 1] phát hiện flavonoid toàn phần có 8 vết Dùng sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng điều chế, phân lập được 2 flavonoid tinh khiết Fj và F2 Fị có dạng tinh thể hình kim, mầu vàng, độ chảy 312 - 315°c F2 có dạng tinh thể hình kim mầu vàng nhạt, độ chảy 255 - 257 °c Dựa vào phổ tử ngoại, phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ nhiễu xạ Rơnghen của Fj và F2 đã xác định Fj là myricetin, F2 là dihydro myricetin [11,12,17]

Phùng Thị Vinh và Trịnh Văn Quỳ đã định lượng riêng biệt Fj và F2

trong flavonoid toàn phần bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao cho kết quả: là5,32 ± 0,4% và F2 là 52,83 ± 0,7% [17, 20]

1.2.3 Những nghiên cứu về myricetin:

Myricetin là 1 flavonol được Perkan phân lập từ vỏ cây Mỵrica nagi Thunb., họ Dâu rượu Myricaceae từ năm 1896, có công thức: QsHioOg.

Cấu trúc của myricetin được xác định vào năm 1902 là 3,5,7 trihydroxy 2- (3’, 4 ’, 5’-trihydroxyphenol) 4,l-benzopyran-4-on hay 3, 3’, 4 ’, 5, 5’, 7 - hexahydroxy -flavon và sau đó được Kalff và Robinson tổng hợp năm 1925

Myricetin có những tính chất vật lý như sau: tinh thể hình kim, mầu vàng cánh gián, tnc= 312-315°c, hấp thụ u v ở bước sóng Ằ= 375nm, 255nm,

tan rất ít trong nước lạnh, tan trong nước nóng và trong cồn, tan hoàn toàn trong cồn nóng [17]

Myricetin có dạng glycosid là: myricetin-3-O-D-glucuronid

myricetin-3-rhamnosidmyricetin-3-0-D-(6-galloyl)-galactosid[26]

1.2.4 Những nghiên cứu về dihydromyricetin:

Dihydromyricetin (ampelopsin) là myricetin được no hóa ở liên kết đôi

c2 = c3 trong cấu trúc khung flavonol Công thức cấu tạo được xác định là: 3.5.7.3’,4’,5’ hexahydroxy flavanon, có trọng lượng phân tử 320

Dihydromyricetin dạng tinh thể hình kim mầu vàng đậm, thường tụ lại

thành hình chổi, nhẹ xốp, tnc=255-257°C, hấp thụ u v ở bước sóng x= 292nm,

tan ít trong nước lạnh, tan tốt trong nước sôi, tan trong cồn, tan hoàn toàn trong cồn nóng và ethylacetat [17]

1.3 NHỮNG NGHIÊN c ứ u VỂ TÁC DỤNG SINH HỌC VÀ CÔNG

loài cây thuốc dân tộc cho thấy chỉ có 4 loài trong đó có A japonica có hoạt

tính này với IC50: 54-173 |Lig/ml [25 ]

Theo Oshima Y và Ueno Y (Nhật Bản), dịch chiết MeOH của rễ A

brevipedunculata var hancei (thu hái tại Đài Loan) có tác dụng bảo vệ tế bào

gan khỏi tác hại của CC14 Bốn chất tách từ dịch chiết này (ampelopsin D, E,

H và cis-ampelopsin E) cũng được chứng minh có hoạt tính trên Ampelopsin

E và cis-ampelopsin E ở nồng độ 0,1 mg/ml thể hiện tác dụng bảo vệ tế bào gan: làm giảm mức GPT (alanin aminotransferase) lần lượt 64% và 73% [37]

Theo Yabe N và Matsui H., dịch chiết ethanol của quả A

brevipedunculata kích thích quá trình sinh tổng hợp collagen của nguyên bào

sợi của biểu mô chuột [29]

Cũng như một số flavonoid khác, myricetin có hoạt tính vitamin p [1] Nghiên cứu ảnh hưởng của quercetin và myricetin trên hệ thống tạo gốc tự do và peroxy hóa trong microsom tế bào gan chuột, Laughton M.J và cộng sự nhận thấy những cây có nhiều flavonoid không những có tác dụng chống oxy hoá mà còn làm giảm các chất tiền oxy hoá [28]

Nghiên cứu sự vận chuyển tích cực ion Ca++ qua màng nguyên sinh chất của tế bào gan chuột, Thiyagarajah p và cộng sự kết luận myricetin ức chế sự vận chuyển ion Ca++ ở nồng độ 100 I^M Mức độ ức chế phụ thuộc vào nồng

độ ở nồng độ trên, myricetin không ảnh hưởng đến một số enzym của màng

nguyên sinh chất như 5’-nucleotidase, alkaline phosphatase Myricetin cũng

ức chế các hệ thống vận chuyển tích cực Ca++ ở màng nguyên sinh chất và lưới nội bào tương của các cơ quan khác Phân tích mối quan hệ giữa cấu trúc và tác dụng cho thấy khả năng hòa tan trong lipid của flavonoid và gốc OH ở các

vị trí 5,7,3’,4’ của khung flavonoid làm tăng khả năng flavonoid ức chế vận chuyển Ca++, điều này có thể gợi ý rằng hoạt tính ức chế vận chuyển Ca++ của flavonoid là do tương tác giữa nhóm polyphenol của flavonoid với protein vận chuyển Ca++ [30]

Bên cạnh tác dụng chống oxy hóa, tác dụng chống ung thư của một số flavonoid cũng đang được quan tâm

Camoirano A và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng chống ung thư của một số flavonoid thấy myricetin, bilirubin và curcumin có khả năng ức chế sự đột biến gây nên bởi cả hai tác nhân là 4- nitroquinolin-1- oxyd và khói thuốc

lá trên các chủng Salmonella typhimonium TA 100 và TA98 Acid tanic, quercetin, myricetin ngăn cản sự khởi đầu ung thư trên biểu bì và phổi chuột Sencar gây ra bởi tác nhân hydrocarbon thơm [21]

Theo Sahu Saura và cộng sự, myricetin cảm ứng quá trình tổn hại nhân DNA và peroxy hoá lipid trên gan chuột cô lập trong điều kiện hiếu khí Sự có mặt của Fe(II) ảnh hưởng đến tác dụng trên của myricetin Tác dụng cảm ứng của myricetin đối với sự tổn hại DNA được kích thích bởi catalase, superoxide dismutase (SOD) và manitol khi có mặt Fe (II) Tác dụng cảm ứng của myricetin đối với quá trình peroxy hóa lipid lại bị ức chế rõ rệt bởi SOD khi có

Fe (II) Kết quả này chứng tỏ hoạt tính kích thích quá trình oxy hóa của các polyphenol, các chất vẫn thường được coi là chất chống oxy hóa và chất chống ung thư Kết quả này gợi ý vai trò kép của các flavonoid trong sự phát sinh đột biến và ung thư [32]

Kostas Dimas và cộng sự thử tác dụng gây độc tế bào đối với dòng tế

bào gây bệnh ung thư bạch cầu ở người của myricetin và dẫn chất của

myricetin là 3,7,4’,5’-tetramethyl ether myricetin và 3’, 5-diacetyl myricetin, dùng vinblastin làm đối chứng Kết quả cho thấy: dẫn chất 3’, 5-diacetyl myricetin có tác dụng mạnh hơn dẫn chất còn lại và myricetin không có tác dụng này [23].

1.3.2 Những nghiên cứu về tác dụng sinh học của cây chè dây

(A cantoniensis Planch.):

- Theo kết quả nghiên cứu của nhóm Phạm Thanh Kỳ [13,17,18]:

Cao khô chè dây và các flavonoid: myricetin, dihydromyricetin không gây ngộ độc cấp tính trên chuột thí nghiệm

Cao chè dây không ảnh hưởng tới các chỉ tiêu hóa sinh và huyết học bao gồm: số lượng hồng cầu, bạch cầu, công thức bạch cầu, điện di protein huyết thanh, urê máu, khi cho thỏ dùng thuốc trong thời gian dài 5 tuần

Myricetin không gây rối loạn nhiễm sắc thể, không ảnh hưởng tới sinh sản và di truyền

Thử sơ bộ thấy cao khô chè dây, myricetin, dihydromyricetin có hoạt tính chống oxy hoá cao

Cao khô chè dây và myricetin có khả năng thải độc theo cơ chế trung hòa gốc tự do của tetraclorua carbon

Cao khô chè dây, myricetin và dihydromyricetin còn ức chế sự phát triển của một số chủng vi khuẩn: myricetin trên 1 chủng, dihydromyricetin

và cao khô trên 14 chủng, chủ yếu là các chủng Staphylococcus aureus và một

số vi khuẩn Bacillus

- Phùng Gia Hợp đã dùng cao đặc chè dây điều trị vết bỏng nông: bỏng

độ II (bỏng biểu bì) và bỏng độ III (bỏng trung bì nông) ở 32 bệnh nhân thấy: vết bỏng tạo được màng thuốc, lớp màng thuốc bám chắc vào bề mặt vết thương Khi màng thuốc bong thì vết bỏng lành sẹo, bề mặt mềm và mịn Thời gian khỏi trung bình của bỏng độ II là 9,2 ngày, bỏng độ III là 18,5 ngày Cao chè dây chỉ dùng ở bỏng nông đã xử lý kỹ kỳ đầu, không dùng được trong

trường hợp bỏng sâu, bỏng nông đã nhiễm khuẩn, bỏng đầu mặt, cổ, tầng sinh môn, bàn tay, ngón tay, chân và vùng khớp Việc sử dụng cao chè dây bôi lên tổn thương chỉ gây xót ở lần bôi đầu trong vòng 15-20 phút, không gây độc hại tại chỗ cũng như toàn thân đối với bệnh nhân [1 0 ].

- Loài A japonica:

+ Người dân Trung Quốc dùng toàn thân và rễ làm thuốc thanh nhiệt giải

độc, tiêu sưng chỉ thống và dùng ngoài để chữa bỏng

+ Người dân Việt Nam dùng rễ gọi là Bạch liễm (vị đắng ngọt, hơi lạnh) có tác dụng thanh nhiệt giải độc, tiêu ung tán kết để chữa trĩ rò, tràng nhạc, mụn nhọt sưng lở, bỏng lửa, nước [6 ]

- Loài A heterophylla (Dâu dây): Người dân Việt Nam dùng toàn cây (vị

ngọt đắng, tính mát) có tác dụng thanh nhiệt, tiêu sưng để chữa phong thấp, đau nhức xương và đắp mụn nhọt [6 ]

- Loài A cantoniensis (Chè dây) được dùng lá chủ yếu có vị ngọt, đắng, tính

mát và có nhiều công dụng [6,10,17]:

+ Nhân dân vùng núi phía Bắc dùng pha nước uống hàng ngày thay chè và

để trị đau dạ dày

+ Nhân dân vùng Lạng Sơn dùng đắp lá vào chỗ bị viêm tấy có mủ (áp xe vú).

+ Có nơi nhân dân dùng lá tươi giã đắp vào các vết bỏng

+ Dân ở Sa Pa dùng nước sắc hoặc nước hãm dạng chè uống hàng ngày với tác dụng thanh nhiệt, chữa mất ngủ, kích thích tiêu hóa, điều hòa huyết áp, ổn định thần kinh, đặc biệt chữa đau dạ dày, viêm đại tràng, viêm đường ruột rất tốt

1.3.3.2 Kết quả nghiên cứu về tác dụng điều trị loét dạ dày - hành tá tràng của chế phẩm AMPELOP sản xuất từ chè dây (A cantoniensis Planch.):

- Trong luận án phó tiến sĩ của Vũ Nam [15] đã nghiên cứu chế phẩm AMPELOP trên lâm sàng điều trị cho 44 bệnh nhân có so sánh với nhóm dùng Alusi (36 bệnh nhân) đã đưa ra một số kết luận chính:

+ Chè dây có tác dụng cắt cơn đau trung bình 8,9 ngày, còn Alusi là 17,35 ngày (p < 0,01) Sau 2 tuần điều trị có 90,09% bệnh nhân hết đau, Alusi: 61,11%

+ Chè dây làm liền sẹo ổ loét hành tá tràng 79,55%, Alusi: 50% (p < 0,001) trong đó chất lượng sẹo tốt - trắng đạt 54,28%, còn Alusi: 33,88%

+ Chè dây làm sạch Helicobacter pylori: 42,5%, Alusi: 19,35% (p<0,01)+ Chè dây có tác dụng làm giảm viêm dạ dày, Alusi không có tác dụng này + Chè dây không độc và không có tác dụng không mong muốn

Để nâng cao hiệu quả điều trị của thuốc AMPELOP, các nhà lâm sàng

đã đưa ra một phác đồ điều trị: dùng AMPELOP trong 1 tháng kết hợp với AMOXICILLIN và METRONIDAZOL (FLAGYL) uống trong 10 ngày đầu

- Nguyễn Thị Tuyết Lan theo dõi điều trị cho 40 bệnh nhân loét hành tá tràng có nhiễm Helicobacter pylori (HP) bằng nhóm thuốc AMPELOP- METRONIDAZOL-AMOXICILLIN (AMA) trong luận án thạc sĩ y học [14]

đã kết luận:

+ Tác dụng cắt cơn đau sau 2 tuần điều trị đạt tỷ lệ 95%

+ Tỷ lệ liền sẹo ổ loét tá tràng đạt 92,5%

+ Làm sạch HP đạt 70%

+ Thuốc có tác dụng giảm rõ rệt hoạt động viêm của niêm mạc hang vị dạ dày Từ trạng thái viêm hoạt động mức độ vừa và nặng sang trạng thái viêm không hoạt động hoặc hoạt động nhẹ Mức độ nhiễm HP cũng giảm nhiều đến âm tính

+ Nhóm thuốc AMA được dung nạp tốt, không có tác dụng không mong muốn

- Kết quả nghiên cứu dưới sự chỉ đạo của Nguyễn Khánh Trạch theo dõi điềutrị cho 63 bệnh nhân loét dạ dày - hành tá tràng bằng AMPELOP-AMOXICILLIN-FLAGYL cho thấy [16]:

+ Đánh giá tác dụng của AMPELOP về mặt lâm sàng:

Thuốc AMPELOP có tác dụng tốt trong việc cải thiện các triệu chứng lâm sàng của bệnh loét dạ dày tá tràng: 39/63 bệnh nhân (61,90%) hết hoàn toàn các triệu chứng sau 1 tuần điều trị, 20/63 bệnh nhân (31,75%) hết các triệu chứng sau 2 tuần điều trị Sau cả đợt điều trị, số bệnh nhân hết các triệu chứng lâm sàng: 98,41%, chỉ còn 1 bệnh nhân không hết đau (1,58%)

+ Đánh giá tác dụng làm lành các vết loét:

Tỷ lệ lành sẹo ở mức độ tốt và khá: 85,71%

Các ổ loét có kích thước < lcm liền sẹo tốt: 93,6%

Các ổ loét có kích thước > lcm liền sẹo chỉ đạt 50%

+ Đánh giá tác dụng diệt HP:

Sạch HP: 34/63 bệnh nhân (53,97%)

Giảm HP, còn số lượng ít: 9/63 bệnh nhân (14,28%)

Không thay đổi: 20/63 bệnh nhân (31,75%)

+ Nghiên cứu tác dụng không mong muốn của thuốc:

nhân nghiên cứu không có trường hợp nào có biểu muốn của thuốc

Tronj* tấLcả 63 bệnh

hiện tác dụng không mong

■X Hi ra A ’’ 1

2.2.1 Nghiên cứu về thực yật:

• Mô tả đặc điểm cây trên thực địa, lấy tiêu bản có hoa, quả và chụp ảnh

• Vi phẫu cắt và nhuộm kép theo phương pháp ghi trong tài liệu “Thực tập Dược liệu” [2]

• Vi phẫu sau khi nhuộm kép được chụp qua kính hiển vi

2.2.2 Nghiên cứu về thành phần hoá học:

• Định tính các nhóm chất hữu cơ theo phương pháp ghi trong tài liệu “Thực tập Dược liệu” [2] và “Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc” [8 ]

• Định tính flavonoid bằng SKLM với bản mỏng silicagen GF2 5 4 (MERCK)

• Định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp cân theo tài liệu “Bài giảng Dược liệu tập I” [1]

• Định lượng tanin theo Dược điển Việt Nam n , tập 3 [4]

• Phân lập flavonoid bằng sắc ký cột theo tài liệu [8 ]

• Đo nhiệt độ nóng chảy trên máy Gallenkamp (Sanyo) tại phòng hóa phân tích-tiêu chuẩn - Viện Dược liệu

• Đo độ ẩm trên máy ULTRAX, đo phổ u v trên máy UV-VIS Spectrophotometer cary IF varian (Australia) và đo IR dưới dạng viên nén KBr trên máy FT-IR Spectrophotometer 1650-Perkin Elmer (USA) tại phòng thí nghiệm trung tâm - trường Đại học Dược Hà Nội

• Đo phổ MS trên máy 5989 -B- MS tại phòng cấu trúc- Viện hóa học, trung tâm KHTN và công nghệ quốc gia

2.2.3 Nghiên cứu vê tác dụng sinh học:

2.2.3.1 Tác dụng chống oxy hoá:

• Thử tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào não chuột của chế phẩm MF, MFS, SPj và SP2 (invitro) tại phòng Đông Y thực nghiệm Viện YHCT.Đánh giá tác dụng chống peroxi hoá lipid màng tế bào được thực hiện qua việc xác định hàm lượng MDA, một sản phẩm trung gian của quá trình này dựa theo phương pháp đã được miêu tả bởi Jadwiga Robax (Ba Lan, 1987) và Mitsno Tanaka (Nhật Bản, 1994) với một số thay đổi nhỏ

Nguyên lý của phương pháp là MDA, một sản phẩm được tạo ra trong quá trình peroxi hoá lipid, có thể phản ứng với acid thiobarbituric để tạo phức Trimethine có màu hồng và có đỉnh hấp thụ cực đại ở 530 - 532nm

Cường độ màu của dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ MDA Hàm lượng MDA là số nmol MDA trong lg tổ chức (não chuột) và tính theo công thức:

x = ’ = 3 0 ,S*E

0,156*2Trong đó :

E : Độ hấp thụ quang

3 : Thể tích mẫu khi đo quang

3,2 : Thể tích toàn phần của mẫu phân tích

2 : Thể tích dịch trong để xác định MDA

0,156 : Độ hấp thụ của dung dịch MDA lmM/g được đo bằngCuvet có độ dày lcm, đo tại bước sóng 532nm theo các điều kiện thí nghiệm của Jadwiga Robax

Mô não đặc biệt nhậy cảm với phản ứng peroxy hóa lipid Vì vậy, trong các thí nghiệm với mô não, chúng tôi không dùng các tác nhân oxy hóa bên

ngoài như Fe2+ Phản ứng oxy hóa diễn ra khi mô não tiếp xúc không khí ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.

• Xác định hoạt tính dọn gốc tự do anion superoxide 0 2-' của MF, MFS, SPj

và SP2

Hoạt tính của gốc tự do anion superoxide được xác định theo phương pháp của Imanari và cộng sự bằng cách xác định phức tạo thành giữa anion superoxide 0 2-’ trong hệ Xanthin/ Xanthin Oxidase và NBT [33]

Hỗn hợp được trộn kỹ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó thêm 50jj.l

dd XOD 0,14mg Prot/ml, lắc kỹ và giữ 20 phút ở nhiệt độ phòng Ngừng phản ứng bằng cách cho thêm 50|ul dd CuCl2 6 mM Dung dịch sẽ có màu xanh tím

do phản ứng giữa NBT và anion superoxide 0 2'• Đo quang ở bước sóng 570nm Tác dụng dọn gốc tự do (theo phần trăm) được tính bằng cách so sánh

độ hấp thụ quang học của dung dịch thử so với độ hấp thụ quang học của dung dịch không chứa mẫu thử

Ở điều kiện phản ứng như trên, tác giả cho biết SOD (Superoxide Dismutase) nồng độ 8,0 mg/ml ức chế hoạt độ xanthine oxidase 50% Tác dụng dọn gốc (theo phần trăm) được tính bằng cách so sánh độ hấp thụ quang học của dung dịch chứa mẫu thử so với độ hấp thụ quang học của dung dịch không chứa mẫu thử

• Thử tác dụng của flavonoid toàn phần (MF) đến hàm lượng MDA não và gan chuột chịu sốc điện và stress tâm lý.

- Súc vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng chủng Swiss 6 tuần tuổi do Viện Vệ sinh dịch tễ cung cấp

- Thuốc nghiên cứu là flavonoid toàn phần ký hiệu là MF, đối chứng là NaCl

9 %o.

- Phương pháp nghiên cứu:

Mô hình thí nghiệm: mô hình gây stress áp dụng trong nghiên cứu này dựa theo phương pháp miêu tả trong các tài liệu đã được công bố trước đây của Matsumoto với một thay đổi là dùng chuột Swiss thay cho việc dùng chuột ICR Chuột gây sốc điện được nhốt trong lồng gây sốc có nhiều thanh kim loại dẫn dòng điện nhỏ ở phía đáy chân để chân chuột tiếp xúc với dòng điện và bị điện giật Lồng gây sốc được nối với 1 thiết bị tạo sốc điều chỉnh được cường

độ dòng điện, thời gian cho một lần sốc và thời gian dừng giữa các sốc Chuột gây stress không bị sốc điện nhưng nhìn và nghe những con chuột gây sốc điện kêu to, sợ hãi, nhảy lên, nhảy xuống do đó bị stress tâm lý

2.23.2 Tác dụng ức chế khối u của flavonoid toàn phần (MF):

- Chế phẩm MF được pha loãng trong nước muối sinh lý, nồng độ 0,48g/100ml

- Chuột thí nghiệm:

Chuột nhắt trắng do Viện Vệ sinh dịch tễ cung cấp

Tổng số chuột thí nghiệm: 26 con ( 6 con làm thử)Trọng lượng chuột: 20 ± 1 gram

Chuột đảm bảo các tiêu chuẩn sinh lý bình thường

- Phương pháp tiến hành:

Mô hình tạo khối u thực nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Ramanathan R và cộng sự [31] với một số thay đổi về nồng độ tác nhân gây u

và số lần áp dụng các hóa chất này cũng như đường cho thuốc vào cơ thể súc vật.

Theo dõi số lượng khối u hình thành, đo kích thước khối u ở lô chứng (10 chuột) và lô điều trị bằng MF (10 chuột) trong 13 tuần thí nghiệm, qua đó đánh giá sự ức chế sinh khối u của thuốc MF

Sau 13 tuần, giết chuột ở cả 2 lô (20 chuột), lấy riêng gan, thận xử lý và định lượng MDA trong tổ chức gan, thận Qua đó đánh giá tác dụng của thuốc gây u ảnh hưởng tới gan, thận ở lô chứng và tác dụng chống oxy hóa làm giảm lượng MDA ở lô điều trị bằng MF

Phần III

THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u VỂ THựC VẬT:

3.1.1 Đặc điểm hình thái cây chè dây Sa Pa:

Cây Chè dây ở Sa Pa còn được gọi là Nhảy-xí-cầu-á (tiếng Ráy) Cây ở

dạng dây leo dài, xanh tốt, leo trên các bụi rậm hoặc trên các cây to khác trong rừng, mọc hoang và cũng được người dân đem về trồng trong vườn hoặc ở bờ rào Cây sống lâu năm, mùa đông lá vàng và rụng dần, mùa xuân cây bắt đầu mọc chồi, lá xanh tốt nhất vào mùa hè, cũng là mùa nhân dân địa phương thường thu hoạch lá, ra hoa tháng 6 , ra quả tháng 1 0

Phân tích về thực vật, cây có các đặc điểm sau:

Thân leo, khi non có mầu xanh, thân già có mầu nâu, cứng giòn, phân nhánh nhiều Lá mọc so le, lá kép lông chim lẻ có từ 3 - 11 lá chét, đôi khi hai

lá chét ở gốc lại phân nhánh tiếp thành hai lần lông chim Các lá chét hình trứng (2*4cm), nhọn ở đầu, mặt trên mầu xanh, mặt dưới mầu nhạt hơn Mép

lá có khía răng nông, gân lá hình lông chim Lá chét lẻ (ở ngọn lá) thường có kích thước (3*5cm) lớn hơn các lá chét khác Tua cuốn chia 2-3 nhánh mọc đối diện với lá

Hoa mọc thành cụm xim hai ngả đối diện với lá, cuống cụm hoa dài 4 -

6 cm Hoa nhỏ, cuống ngắn, mềm có những lông nhỏ bao quanh Đài hoa 5, liền nhau tạo thành vòng bao quanh gốc bầu cũng phủ lông mềm Cánh hoa 5, rời nhau, các cánh hoa có hai mép uốn cong lại như hình mũi giày Năm nhị đính trước cánh hoa, nhị nhỏ 1 mm, bao phấn hai ô, khi chín nứt dọc thành hai rãnh Chỉ nhị đính lưng, bao phấn hướng trong Bộ nhụy bầu trên có ba lá noãn, đính noãn trung trụ, vòi nhụy dài 0,5 mm

Quả mọng, lúc non có mầu xanh, khi chín có mầu đỏ mận Trên đỉnh quả còn lại vết tích của đầu nhụy như một cái gai nhỏ Quả thường có 3 hạt, hạt có vỏ cứng mặt ngoài mầu nâu đen.

Mẫu cây có hoa và quả đã được giáo sư Vũ Văn Chuyên xác định tên

khoa học là: Ampelopsis cantoniensis (Hook, et Arn.) Planch, (giống mẫu chè

dây Cao Bằng)

♦ Nhận xét: So với mẫu chè dây Cao Bằng, cây chè dây Sa Pa phần lớn có

cùng các đặc điểm chính, sự khác nhau chủ yếu ở kích thước, màu sắc của thân cành và lá Phiến lá của chè dây Cao Bằng bao giờ cũng dày và lớn hơn, màu sắc lá cũng thường sẫm hơn mẫu thu hái ở Sa Pa tính cùng một thời điểm trong năm Chúng tôi cho rằng sự sai khác này có thể là do điều kiện thổ nhưỡng và khí hậu ở 2 vùng tạo nên

Hình 3.2: Anh cành chè dây Sapa có Hình 3.3: Ảnh chè dây Sapa có mang

3.1.2 Đặc điểm vi học cây chè dây Sa Pa:

3.1.2.1 Đặc điểm vi phẫu thân (Hình 3.4):

Cắt ngang một đoạn thân già, nhuộm kép quan sát dưới kính hiển vi

thấy:

Mặt cắt thân hình tròn Ngoài cùng là lớp bần (1) gồm nhiều hàng tế

bào hình chữ nhật xếp đều đặn

Bên trong là các tế bào mô mềm vỏ (2) hình gần tròn có màng mỏng

Bó sợi (3) là những tế bào hoá gỗ tập trung thành đám hình bầu dục

nằm ở phần mô mềm vỏ, ngay sát ngoài bó libe gỗ

Bó libe gỗ: Libe (4) tập trung thành từng đám, gỗ (6 ) liên tục thành

vòng tròn hướng li tâm Giữa các bó libe-gỗ có 1-3 hàng tế bào tia tủy (5)

ngăn cách

Mô mềm ruột (7) là những tế bào lớn có màng mỏng ở phần giữa thân

♦ Nhận xét: Quan sát vi phẫu thân của 2 mẫu dược liệu thấy: mẫu Sa Pa

có mặt cắt ngang của thân hình tròn, không thấy có đám tế bào mô dày Đối với mẫu Cao Bằng, mặt cắt ngang thân hình đa giác đều, trong lớp mô mềm vỏ

có đám tế bào mô dày ở phần lồi ra của thân Sự sai khác này có thể là do tác giả cắt vi phẫu đoạn thân non với mẫu Cao Bằng, còn chúng tôi cắt ở đoạn thân đã có bần (có cấu tạo cấp II) với mẫu ở Sa Pa

là những tế bào không đều, màng mỏng, nằm dưới lớp mô dày và xen kẽ giữa các bó sợi, libe gỗ Bó sợi (5) là đám tế bào hoá gỗ tập trung thành từng đám

nằm ngay bên ngoài bó libe gỗ Libe gỗ (6 ) gồm nhiều bó xếp đối xứng hai bên, mỗi bó gồm libe phía ngoài, gỗ phía trong.

- Phiến lá :

Mô dậu (7) nằm sát lớp biểu bì trên gồm một hàng tế bào hình chữ nhật xếp vuông góc với biểu bì Mô mềm gồm những tế bào đa giác xếp không xít nhau để hở những khoảng gian bào

♦ Nhận xét: Vi phẫu lá của mẫu Sa Pa giống mẫu Cao Bằng

3.1.2.3 Đặc điểm bột lá (Hình 3.6):

Bột lá có mầu xanh xám mịn, thể chất nhẹ, vị chát

Quan sát dưới kính hiển vi thấy các đặc điểm sau:

Mảnh biểu bì có chứa lỗ khí (1)Mạch điểm (2)

Lông che chở đơn bào (3)Mạch xoắn (4)

Tinh thể calcioxalat hình cầu gai (5)Mảnh biểu bì (6 )

Sợi (7)Tinh thể calcioxalat hình kim (8 )Đám tế bào mô mềm (9)

♦ Nhận xét: Đặc điểm bột lá của chè dây Sa Pa cơ bản giống đặc điểm chè

dây Cao Bằng, tuy vậy trong chè dây Sa Pa chúng tôi tìm thấy tinh thể calci oxalat hình cầu gai và mảnh mạch điểm, 2 đặc điểm này không thấy nêu trong báo cáo ở mẫu Cao Bằng [17]

Hình 3.6: Ảnh bột lá

3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u VỂ THÀNH PHAN h ó a HỌC:

3.2.1 Định tính các nhóm chất trong lá chè dây bằng phản ứng hoá học:

3.2.1.1 Định tính glycosỉd tim:

Lấy lOg bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 250ml, thêm 100ml nước cất, ngâm ở nhiệt độ phòng 24 giờ Lọc qua bông vào cốc có mỏ, cho vào dịch lọc 5ml dd chì acetat 30%, khuấy đều, để lắng, lọc qua giấy lọc Chuyển dịch lọc vào bình gạn 100ml, lắc với cloroform 3 lần, mỗi lần 5ml, gạn lớp cloroform vào cốc có mỏ, chia đều dịch chiết cloroform vào 4 ống nghiệm nhỏ, cô trên nồi cách thủy đến khô, cắn còn lại tiến hành làm các phản ứng:

- Phản ứng Liebermann: Cho vào ống nghiệm chứa cắn lm l anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn, cho thêm đồng lượng acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm cho phân thành hai lớp

Không thấy xuất hiện vòng đỏ tím giữa 2 lớp phân cách (Phản ứng âmtính)

- Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm chứa cắn lm l ethanol 90°, lắc cho hoà tan hết cắn, thêm 1 giọt TT Natri nitroprusiat 0,5% và 2 giọt dd NaOH

10%.

Không thấy xuất hiện mầu đỏ (Phản ứng âm tính)

- Phản ứng Baljet: Cho vào ống nghiệm chứa cắn lm l ethanol 90°, lắc cho hoà tan hết cắn, thêm thuốc thử Baljet mới pha (1 phần acid picric 1% - 9 phần NaOH 10%)

Không thấy xuất hiện mầu vàng da cam (Phản ứng âm tính)

- Phản ứng Keller - Kiliani: Cho vào ống nghiệm chứa cắn lml FeCl3

5% trong acid acetic, nghiêng ống nghiệm cho từ từ acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm

Không thấy xuất hiện vòng mầu đỏ giữa 2 lớp phân cách (Phản ứng

âm tính)

• Kết luận: Dược liệu không có glycosid tim.

3.2.1.2 Định tính flavonoid:

Lấy 0,5 g bột dược liệu cho vào ống nghiệm lớn, thêm 5 ml ethanol 90° Đun sôi cách thủy trong vài phút, lọc nóng, dịch lọc được tiến hành làm các phản ứng sau:

- Phản ứng Cyanidin: Cho vào ống nghiệm nhỏ lm l dịch chiết Thêm một ít bột Magiê kim loại Nhỏ từng giọt HC1 đậm đặc (3 -5 giọt) Để yên một vài phút, dung dịch chuyển từ mầu xanh sang đỏ (Phản ứng dương tính)

- Xác định flavonoid ở dạng aglycon và dạng glycosid: Thêm vào dung dịch vừa mới phản ứng ở trên lm l nước cất để pha loãng rồi lắc với 2 ml octanol Để yên cho phân lớp thấy cả 2 lớp nước và octanol đều có mầu đỏ Vậy trong lá chè dây Sa Pa flavonoid tồn tại cả 2 dạng aglycon và glycosid

- Phản ứng với kiềm: Giỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy lọc, để khô rồi đặt lên miệng lọ amoniac đặc đã mở nút, thấy mầu vàng của dịch chiết tăng lên rõ rệt (Phản ứng dương tính)

- Phản ứng với TT A1C13 3%: Lấy lm l dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2-3 giọt TT AICI3 3% trong cồn thấy mầu vàng của dịch chiết tăng lên rõ rệt (Phản ứng dương tính)

• Kết luận: Dược liệu có flavonoid

3.2.1.3 Định tính anthranoid:

- Phản ứng Bomtrãger: Lấy 3g bột dược liệu cho vào bình nón dung

tích 100ml, thêm 40ml dd H2S04 10% Đun sôi cách thủy 15 phút Lọc lấy dịch chiết, cho dịch lọc vào bình gạn Lắc với 5ml ether ethylic trong 1-2 phút

Để yên cho tách thành 2 lớp, gạn lấy phần ether ethylic, thêm 3ml dd NaOH 10%, lắc, thấy lớp ether ethylic có mầu vàng nhạt Thêm vào dd H202 (0 ,lml

H202 cho 10ml NaOH 10%), lắc đều, dd không mất mầu (Phản ứng âm tính)

- Vi thăng hoa: Đặt một ít dược liệu trong một nắp chai bằng nhôm Hơ nhẹ trên đèn cồn cho đến khi bay hết hơi nước trong dược liệu Đặt lên miệng