Nghiên cứu bào chế hydrogel acid hyaluronic chứa liposome

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ XUÂN NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HYDROGEL ACID HYALURONIC CHỨA LIPOSOME KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2018 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ XUÂN Mã sinh viên: 1301486 NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HYDROGEL ACID HYALURONIC CHỨA LIPOSOME KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Cảnh Hưng Nơi thực hiện: Bộ môn Bào chế Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất Viện Cơng nghệ Dược phẩm Quốc gia HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới: ThS Nguyễn Cảnh Hưng Là người thầy trực tiếp hướng dẫn, dạy dỗ, tận tình bảo, giúp đỡ tơi động viên suốt thời gian thực đề tài Tôi xin chân thành cám ơn GS.TS Phạm Thị Minh Huệ, ThS Nguyễn Văn Lâm, PGS.TS Vũ Đặng Hoàng tạo điều kiện, góp ý hướng dẫn tơi hồn thiện đề tài Tôi xin gửi lời cám ơn tới thầy cô, anh chị kỹ thuật viên Bộ mơn Bào chế, Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất, Viện Công nghệ dược phẩm Quốc gia tạo điều kiện cho tơi sử dụng thiết bị, máy móc hướng dẫn tơi q trình thực nghiệm Tơi xin trân trọng cám ơn thầy cô Ban giám hiệu Nhà trường tồn thể thầy mơn cán phòng ban trường Đại học Dược Hà Nội tận tình dạy dỗ tơi năm tháng học tập trường Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn chân thành tới gia đình, bạn bè, đặc biệt bạn Hồng Thị Lan Hương nhóm nghiên cứu ln bên tơi, động viên tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa luận Hà Nội, tháng năm 2018 Sinh viên Trần Thị Xuân MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh thối hóa khớp số thuốc tiêm nội khớp điều trị thối hóa khớp 1.1.1 Tổng quan bệnh thối hóa khớp 1.1.2 Tổng quan đường tiêm nội khớp điều trị THK 1.2 Một số đặc tính lưu biến thường đánh giá chế phẩm bù nhớt 1.2.1 Độ nhớt tĩnh hay độ nhớt trạng thái nghỉ η0 (zero shear – viscosity) 10 10 1.2.2 Độ nhớt tốc độ trượt 250 s-1, tính trượt mỏng (shear – thinning) tỷ suất trượt mỏng (shear – thinning ratio) 10 1.2.3 Tính xúc biến (thixotropic) 11 1.2.4 Mơ-đun đàn hồi (G’), mô-đun nhớt (G”) tần số giao cắt (cross – over frequency) 11 1.3 Tổng kết 12 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên liệu, thiết bị 14 2.1.1 Nguyên liệu 14 2.1.2 Thiết bị sử dụng 14 2.2 Đối tượng nghiên cứu 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Phương pháp bào chế liposome 15 2.3.2 Phương pháp đánh giá KTTP liposome 16 2.3.3 Phương pháp khảo sát lưu biến gel HA gel HA chứa liposome 17 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1 Bào chế hệ liposome gel HA - liposome với tỷ lệ thành phần khác 19 3.1.1 Khảo sát lựa chọn phương pháp làm giảm KTTP liposome 19 3.1.2 Khảo sát lựa chọn mơi trường hydrat hóa 22 3.1.3 Ảnh hưởng mơi trường hydrat hóa liposome tới đặc tính lưu biến gel HA 3.2 Đánh giá đặc tính lưu biến gel HA gel HA chứa liposome 24 25 3.2.1 Tính trượt mỏng (shear – thinning) 25 3.2.2 Tính xúc biến (thixotropic) 26 3.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới tần số giao cắt, độ nhớt tĩnh, độ nhớt tốc độ trượt 250 s-1, tỷ suất trượt mỏng hệ gel HA gel HA chứa liposome PHỤ LỤC 28 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt AIA Chol CIA DPPC EPC HA HSPC IA KTTP Na-HA OA PC PL RA SF SPC STT THK KLPT Ý nghĩa Viêm khớp kháng nguyên gây (Antigen-Induced Arthritis) Cholesterol Viêm khớp Collagen gây (Collagen-Induced Arthritis) Dipalmitoyl PC Phosphatidyl cholin trứng (Egg phophatidyl choline) Acid Hyaluronic Phosphatidyl cholin dầu đậu nành hydrogen hóa (Hydrogen soy bean phophatidyl choline) Tiêm nội khớp (Intra-articular) Kích thước tiểu phân Natri hyaluronat Viêm xương khớp (Osteoarthritis) Phosphatidyl cholin Phospholipid Viêm khớp dạng thấp (Rheumatoid Arthritis) Dịch khớp (synovial fluid) Phosphatidyl cholin dầu đậu nành ( Soybean PC) Số thứ tự Thối hóa khớp KLPT trung bình DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.2 Đặc tính lưu biến dịch khớp người khoẻ mạnh độ nhớt bệnh nhân thoái hoá khớp Bảng 1.3 Một số chế phẩm HA tiêm nội khớp thị trường Bảng 1.4 Đặc tính lưu biến số chế phẩm acid hyaluronic tiêm nội khớp khác thị trường Bảng 1.5 Một số nghiên cứu ứng dụng liposome điều trị bệnh khớp Bảng 2.1 Nguyên vật liệu sử dụng q trình thực khóa luận 14 Bảng 3.1 KTTP thu sau siêu âm bể công thức, môi trường hydrat hóa khác nhau: mannitol 5%, HEPES 10mM (HEPES/Man); glucose 5%, HEPES 10mM ((HEPES/Glu) đệm phosphat salin (PBS) 21 Bảng 3.2 Kết đánh giá KTTP mẫu thử độ ổn định môi trường khác 23 Bảng 3.3 Kết đánh giá lưu biến mẫu gel HA gel HA chứa liposome 28 Bảng 3.4 Bảng so sánh mối tương quan độ nhớt mẫu gel chứa liposome 30mM 50mM so với mẫu 10mM, nồng độ gel HA 1,0%, HA 2,0% 30 Bảng 3.5 Bảng so sánh số đặc tính lưu biến hệ gel HA chứa liposome dịch khớp bình thường theo Nicholls cộng 32 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu tạo sụn khớp bình thường sụn khớp tổn thương bệnh nhân thoái hoá khớp Hình 1.3 Cấu trúc phân tử HA cấu tạo từ monome N-acetyl glucosamin acid glucuronic Hình 1.4 Cấu trúc liposome Hình 3.4 Hình ảnh mẫu màng phim hydrat hoá (từ trái qua phải HEPES/Mannitol, HEPES/Glucose PBS) 23 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn thay đổi độ nhớt phức hợp mẫu gel môi trường Glucose/HEPES mannitol/HEPES với độ nhớt phức hợp ban đầu theo thời gian thêm H2O2 24 Hình 3.6 Đồ thị thể tính trượt mỏng (a) gel HA 2,0% (b) gel HA 2% chứa liposome 5% DSPE-PEG 2000 (30mM) .26 Hình 3.7 Đồ thị đánh giá tính xúc biến gel HA Đường cong độ nhớt giai đoạn (màu xanh cây) trùng với đường cong giai đoạn (màu đỏ) thể hệ gel khơng có tính xúc biến .26 Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn thay đổi độ nhớt theo thời gian khảo sát tĩnh xúc biến gel HA 27 Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn khơng có tính xúc biến hệ gel HA, gel HA – liposome 30mM, gel HA – liposome 50mM 27 Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn thay đổ tần số giao cắt theo tổng nồng độ lipid .29 Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn thay đổi độ nhớt tĩnh theo tổng nồng độ lipid KTTP liposome .31 Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn thay đổi tần số giao cắt (cross-over frequency) theo tổng nồng độ lipid KTTP liposome .31 Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn thay đổi độ nhớt tĩnh theo tổng nồng độ lipid, nồng độ DSPE-PEG 2000 KTTP liposome 32 ĐẶT VẤN ĐỀ Mặc dù có nhiều nghiên cứu bào chế đánh giá lâm sàng, chưa có biện pháp điều trị triệt để bệnh thối hố khớp Các tổn thương khớp khơng hồi phục điều trị thuốc sử dụng uống, tiêm tĩnh mạch hay tiêm nội khớp So với đường uống đường tiêm tĩnh mạch, dạng bào chế tiêm nội khớp có cho phép đưa trực tiếp thuốc với nồng độ cao vào vị trí tác dụng, giúp tăng hiệu điều trị giảm độc tính tồn thân Acid hyaluronic (HA) loại thuốc tiêm nội khớp sử dụng rộng rãi điều trị thoái hoá khớp Tiêm nội khớp HA, gọi biện pháp “bù nhớt” (viscosupplementation), giúp khôi phục độ nhớt đặc tính lưu biến dịch khớp tạo hiệu giảm đau lên tới tháng Trên thị trường có nhiều loại chế phẩm HA với đặc điểm cấu trúc HA khác dẫn tới đặc tính lưu biến khác nhau; chế phẩm HA có liên kết chéo chứng minh tốt tác dụng bảo vệ sụn khớp đạt thông số lưu biến tương tự dịch khớp sinh lý, nhiên chúng lại có nguy tồn dư hóa chất dùng để tạo liên kết chéo hóa học Do yêu cầu đặt cần thay tác nhân hóa học biện pháp khác mà bảo toàn cấu trúc tác dụng dược lý gel HA Nhiều nghiên cứu liposome có khả làm thay đổi đặc tính lưu biến gel HA tương tác vật lý Nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài “Nghiên cứu bào chế hydrogel acid hyaluronic chứa liposome” với số nội dung sau: - Bào chế liposome vùng kích thước khác với tổng nồng độ lipid tỷ lệ thành phần khác - Đánh giá ảnh hưởng liposome tới đặc tính lưu biến mức độ thuận tiện tiêm hệ hydrogel acid hyaluronic chứa liposome hướng đến đường tiêm nội khớp CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh thối hóa khớp số thuốc tiêm nội khớp điều trị thối hóa khớp 1.1.1 Tổng quan bệnh thối hóa khớp Thối hố khớp (THK) có tỷ lệ biến thiên nước phát triển, dao động từ đến 20%, bệnh viêm khớp phổ biến nước phát triển Tại Mỹ, tỷ lệ 15% vào năm 1998, lên tới 18,2% vào năm 2020 Ở Việt Nam chưa có thống kê xác thối hóa khớp chiếm tỷ lệ cao bệnh lý xương khớp, đặc biệt thối hóa khớp gối [1] THK tổn thương thối hóa tiến triển chậm, tăng dần sụn khớp, gây kết hợp nhiều yếu tố khác yếu tố gen, chuyển hóa, sinh hóa sinh học kèm theo trình viêm xảy thứ phát Q trình thối hóa tác động đến sụn, xương màng hoạt dịch khớp [1] Hình 1.1 Cấu tạo sụn khớp bình thường sụn khớp tổn thương bệnh nhân thoái hoá khớp [27] Đặc trưng bệnh trình dần sụn khớp Có hai chế cho khởi phát trình THK: chế thứ nhất, với đa số trường hợp tổn thương thối hóa thường khu trú vị trí chịu lực sụn hay vị trí sau chấn thương chấn thương lặp lặp lại (các yếu tố sinh sinh học) cho yếu tố quan trọng dẫn đến khởi phát gây THK Các tế bào sụn phản ứng lại với tác Nhận xét: KTTP mẫu liposome tăng đáng kể sau tuần bảo quản Tuy nhiên, thêm HA vào hỗn dịch liposome để đạt nồng độ cuối HA 2,0%, tiếp tục bảo quản nhiệt độ 4℃, sau tuần đánh giá lại nhận thấy KTTP mẫu khơng thay đổi Có thể thấy, mơi trường hydrogel HA có tác dụng tốt việc chống kết tụ, ổn định tiểu phân liposome Do vậy, môi trường glucose 5%/HEPES 10mM mannitol 5%/HEPES 10mM lựa chọn để tiến hành nghiên cứu 3.1.3 Ảnh hưởng mơi trường hydrat hóa liposome tới đặc tính lưu biến gel HA Ảnh hưởng mơi trường hydrat hố tới đặc tính lưu biến gel HA đánh giá có khơng có tác nhân oxy hoá H2O2 Kết khảo sát cho thấy khơng có khác biệt đáng kể độ nhớt nghỉ gel HA chứa mannitol 5% glucose 5% khơng có mặt tác nhân oxy hố (38,0 40,3 Pa.s) Tuy vậy, H2O2 thêm tới nồng độ 5% vào gel nói trên, có khác biệt đáng kể đặc tính lưu biến mẫu chứa mannitol glucose Kết trình bày hình 3.6 Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn thay đổi độ nhớt phức hợp mẫu gel môi trường Glucose/HEPES mannitol/HEPES với độ nhớt phức hợp ban đầu theo thời gian thêm H2O2 24 Nhận xét: Tất mẫu bị pha loãng với mức độ thêm H2O2 Tuy vậy, thấy nồng độ HA 1% 2%, mẫu mannitol 5% có độ nhớt giảm so với mẫu tương ứng chứa glucose 5% Có thể thấy, mannitol có khả bảo vệ HA khỏi tác nhân oxy hố, glucose khơng có tính chất so với mannitol Trong bệnh khớp, HA dễ bị oxy hoá gốc oxy phản ứng (reactive oxygen species) , giảm khối lượng phân tử [5] So với chất chống oxy hoá khác, mannitol có ưu điểm gây phản ứng phụ không mong muốn, dễ tan Do vậy, môi trường mannitol 5%/HEPES 10mM lựa chọn để bào chế gel HA gel HA chứa liposome cho thí nghiệm 3.2 Đánh giá đặc tính lưu biến gel HA gel HA chứa liposome Kết đánh giá đặc tính lưu biến cho thấy, mẫu gel HA mẫu gel HA chứa liposome khơng có tính xúc biến có không bị ảnh hưởng yếu tố KTTP liposome, nồng độ lipid hay tỷ lệ DSPE-PEG Cả mẫu HA HA chứa liposome có tính trượt mỏng Một số kết đại diện trình bày mục 3.3.1 3.3.2 Ngược lại, thông số độ nhớt trạng thái nghỉ, tỷ suất trượt mỏng, tần số giao cắt bị ảnh hưởng mạnh yếu tố Kết trình bày cụ thể mục 3.3.1, 3.3.2 bảng 3.3 3.2.1 Tính trượt mỏng (shear – thinning) Kết cho thấy tốc độ trượt tăng lên độ nhớt hệ giảm, hệ có tính trượt mỏng (shear - thinning) Đây đặc tính lưu biến quan trọng hệ tiêm nội khớp để bù nhớt, thể vận động nhẹ nhàng (tương tự chế độ đo liên tục, vận động theo chiều) độ nhớt hệ giảm, dễ cử động Tỷ suất trượt mỏng hệ khác khác trình bày bảng 3.3 25 Hình 3.3 Đồ thị thể tính trượt mỏng (a) gel HA 2,0% (b) gel HA 2% chứa liposome 5% DSPE-PEG 2000 (30mM) 3.2.2 Tính xúc biến (thixotropic) Tiến hành khảo sát mẫu gel HA gel HA chứa liposome, kết cho thấy hệ gel khơng có tính xúc biến có tính xúc biến nhỏ có (minh hoạ hình 3.7, 3.8, 3.9) Độ nhớt trượt (Pa.s) Tốc độ trượt (s-1) Hình 3.4 Đồ thị đánh giá tính xúc biến gel HA Đường cong độ nhớt giai đoạn (màu xanh cây) trùng với đường cong giai đoạn (màu đỏ) thể hệ gel khơng có tính xúc biến 26 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn thay đổi độ nhớt theo thời gian khảo sát tĩnh xúc biến gel HA Ở giai đoạn 2, thấy rõ độ nhớt trượt hệ không bị thay đổi theo thời gian tác dụng ứng suất trượt Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn khơng có tính xúc biến hệ gel HA, gel HA – liposome 30mM, gel HA – liposome 50mM Các hệ gel HA chứa liposome khơng có tính xúc biến (hình 3.9) Ở ứng suất trượt cao, độ nhớt không thay đổi theo thời gian (hình 3.8) Khi giảm dần ứng suất trượt 27 hồi phục hoàn toàn Sự khác biệt nhỏ vùng ứng suất trượt thấp độ nhạy thiết bị vùng so với tốc độ trượt cao 3.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới tần số giao cắt, độ nhớt tĩnh, độ nhớt tốc độ trượt 250 s-1, tỷ suất trượt mỏng hệ gel HA gel HA chứa liposome Các kết khảo sát ảnh hưởng thành phần cơng thức tới tính chất lưu biến hệ gel HA gel HA chứa liposome trình bày bảng 3.3: Bảng 3.3 Kết đánh giá lưu biến mẫu gel HA gel HA chứa liposome Nồng độ HA (%) Nồng độ DPSE – PEG 2000 (%) 1% 5 2% 5 Tổng nồng độ lipid (mM) KTTP 10 30 50 10 30 50 10 30 50 10 30 50 10 30 50 10 30 50 100 15,4 µm 15,4 µm 15,4 µm 15,8 µm 15,8 µm 15,8 µm 15,0 µm 15,0 µm 15,0 µm 137 nm 137 nm 137 nm 134 nm 134 nm 134 nm 7,7 µm 7,7 µm 7,7 µm 7,7 µm Độ nhớt đo tốc độ trượt 250 s-1 (η250 (Pa.s)) 0,23 0,27 0,37 0,43 0,74 0,94 1,21 1,63 0,96 1,26 1,74 0,88 1,03 1,24 0,94 1,22 1,80 0,92 1,08 1,32 1,24 28 Tần số giao cắt (Hz) Độ nhớt trạng thái nghỉ (η0) Tỷ suất trượt mỏng (η0 /η250) 5,97 5,28 3,57 2,69 1,45 1,18 0,80 0,48 1,11 0,69 0,43 1,19 1,02 0,72 1,19 0,80 0,45 1,18 0,70 0,56 0,24 1,86 4,61 13,98 73,77 40,78 56,67 113,37 224,17 58,99 119,02 297,17 48,42 71,74 163,84 52,09 102,76 265,76 54,44 83,74 155,80 424,50 8,10 16,85 38,13 170,46 54,81 60,33 93,41 137,66 61,35 94,42 170,36 54,94 69,54 131,86 55,48 84,36 148,02 59,43 77,85 118,34 342,34 Nhận xét: Kết đo độ nhớt tĩnh mẫu gel HA 1,0% 2,0% 2,86 Pa.s 40,78 Pa.s; nồng độ HA tăng độ nhớt tĩnh tăng tăng với mức độ nhanh hơn: độ nhớt tăng 14 lần nồng độ HA tăng lần Bên cạnh đó, với nồng độ HA (1,0 hay 2,0%), tỷ lệ mol DSPE-PEG 2000 (1,0% hay 5,0%) hay vùng KTTP (134 nm, µm hay 15 µm), độ nhớt tĩnh độ nhớt trạng thái nghỉ hệ tỷ lệ thuận với tổng nồng độ lipid (Hình 3.11, 3.12, 3.13) Ngược lại, tần số giao cắt tỷ lệ nghịch với tổng nồng độ lipid Mặt khác, độ nhớt tăng tỷ suất trượt mỏng tăng theo, giá trị độ nhớt 250 s-1 hệ gel liposome tỷ lệ thuận với nồng độ lipid giá trị tuyệt đối mẫu gel liposome 250 s-1 không khác biệt Kết cho thấy việc điều chỉnh tổng nồng độ lipid giúp thu hệ có độ nhớt tần số giao cắt giống với dịch khớp sinh lý Mô đun đàn hồi G’ (Pa) Mô đun nhớt G’’ (Pa) Tần số (Hz) Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn thay đổ tần số giao cắt theo tổng nồng độ lipid Tần số giao cắt mẫu gel HA chứa liposome nhỏ mẫu gel HA nồng độ 29 Tuy vậy, mức độ thay đổi thông số nêu không phụ thuộc vào tổng nồng độ lipid mà phụ thuộc vào thơng số khác Cụ thể: - Nồng độ HA: cố định thông số lại (KTTP liposome, tổng nồng độ lipid) mức độ tăng độ nhớt mẫu gel chứa liposome có nồng độ HA 1,0% cao mẫu HA 2,0% (bảng 3.5) Mặt khác, với gel liposome chứa 2,0% HA, nồng độ lipid thấp (10-30mM), nồng dộ lipid tăng độ nhớt bị ảnh hưởng không nhiều mẫu HA 1,0% Mức độ ảnh hưởng liposome tơi độ nhớt lớn tổng nồng độ lipid khoảng từ 30 - 50mM Bảng 3.4 Bảng so sánh mối tương quan độ nhớt mẫu gel chứa liposome 30mM 50mM so với mẫu 10mM, nồng độ gel HA 1,0%, HA 2,0% Nồng độ HA Độ nhớt tĩnh (Pa.s) 10 mM 30 mM 50 mM 1,0% 100,00% 303,25% 1600,22% 2,0% 100,00% 201,76% 503,76% - Tỷ lệ mol DSPE-PEG 2000: kết tương tự nghiên cứu trước [20]: DPSE-PEG 2000 làm tăng độ nhớt hệ; tăng độ nhớt tổng nồng độ lipid thấp 10-30mM chưa lớn, tổng nồng độ lipid cao (50mM) thấy chênh lệch độ nhớt rõ nét hơn, đặc biệt gel 2,0% HA - Kích thước tiểu phân liposome: kích thước tăng giảm từ 7,7 µm xuống khoảng 130 nm độ nhớt tăng (ở tổng nồng độ lipid khác nhau), giống với kết thu Naila El Kechai cộng (2015 - [20]) khảo sát đặc tính gel HA chứa liposome từ phosphatidyl cholin lòng đỏ trứng (EPC) Các tác giả cho KTTP giảm diện tích bề mặt tăng, lượng DSPE-PEG 2000 tiếp túc với HA tăng, độ nhớt hệ tăng Tuy vậy, kết kích thước liposome HSPC tăng từ 7,7 µm 15,0 µm, độ nhớt tĩnh độ nhớt tốc độ trượt 250 s-1 hệ tăng, đồng thời tần số giao cắt giảm xuống (hình 3.11, 3.12) Nguyên nhân tượng liposome HSPC cứng khó bị biến dạng liposome EPC tác động ứng suất trượt, gây cản 30 trở trình chuyển động lớp gel hệ, đặc biệt ứng suất trượt tốc độ trượt thấp Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn thay đổi độ nhớt tĩnh theo tổng nồng độ lipid KTTP liposome Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn thay đổi tần số giao cắt (cross-over frequency) theo tổng nồng độ lipid KTTP liposome 31 Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn thay đổi độ nhớt tĩnh theo tổng nồng độ lipid, nồng độ DSPEPEG 2000 KTTP liposome Kết luận: Các kết cho thấy, sử dụng liposome để thu hệ gel liên kết chéo tương tác vật lý có đặc tính lưu biến giống với dịch khớp sinh lý Mặc dù khối lượng phân tử HA sử dụng nghiên cứu thấp nhiều so với HA sinh lý dịch khớp, hệ gel bào chế có số lưu biến tương tự dịch khớp bình thường (tần số giao cắt, tỷ lệ trượt mỏng) Một số ví dụ trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 Bảng so sánh số đặc tính lưu biến hệ gel HA chứa liposome dịch khớp bình thường theo Nicholls cộng [4] Chỉ số Khối lượng phân tử (kDal) Độ nhớt tĩnh (Pa.s) Tần số giao cắt (Hz) Tỷ lệ trượt mỏng (η0 /η250) Dịch khớp người bình thường Hệ HA 2,0%liposome 50 mM (15,0 µm) Hệ HA 2,0% liposome 100mM (7,7 µm) 5000 - 6000 1000 1000 - 175 297,17 265,76 0,41 0,43 0,45 70 - 250 170,37 148,02 32 Mặt khác, yếu tố ảnh hưởng tới đặc tính lưu biến hệ gel thơng số ảnh hưởng đến thời gian lưu liposome khớp sau tiêm, lượng dược chất nạp vào liposome tốc độ giải phóng dược chất khỏi liposome, từ ảnh hưởng đến hiệu điều trị Do vậy, để bào chế hệ gel HA chứa liposome tối ưu, nên đánh giá lựa chọn tỷ lệ thành phần tối ưu (chẳng hạn tỷ lệ cholesterol, tỷ lệ DSPE-PEG, loại DSPE-PEG hay phospholipid mang điện tích) cho liposome có thời gian lưu kéo dài tốc độ giải phóng dược chất phù hợp, sau điều chỉnh thêm có đặc tính sinh lý giống dịch khớp 33 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Sau trình nghiên cứu tiến hành thực nghiệm, khóa luận đạt kết sau: - Đề tài bào chế liposome phương pháp hydrat hoá màng phim, mơi trường hydrat hóa HEPES 10mM/Mannitol 5%, kết hợp siêu âm bể để làm nhỏ KTTP tạo hệ liposome vùng kích thước khác (nm µm), tổng nồng độ lipid cao khoảng từ (30 – 50mM) với tỷ lệ DSPE-PEG 2000 khác (1 5%) Mơi trường hydrat hố mannitol 5%/HEPES 10mM pH 7,4 có khả bảo vệ HA khỏi phân huỷ tác nhân oxy hoá H2O2 nồng độ cao - Đề tài khảo sát đánh giá ảnh hưởng yếu tố khác lên đặc tính lưu biến HA Trong số hệ HA chứa liposome khảo sát, có số hệ có đặc tính lưu biến giống với dịch khớp điều kiện sinh lý Kết khảo sát cho thấy dễ dàng thu đặc tính lưu biến mong muốn cách sử dụng liposome ĐỀ XUẤT Trong thời gian nghiên cứu, khóa luận đạt số kết định, điều kiện thực nghiệm thời gian có hạn nên số mục tiêu chưa đạt được, chúng tơi có số đề xuất sau: - Khoá luận bào chế hệ có đặc tính lưu biến giống dịch khớp nồng độ 2% HA Do vậy, nên tiếp tục nghiên cứu để thu hệ tương tự với nồng độ HA khác - Cần theo dõi đội ổn định hệ gel –liposome bào chế - Tiến hành nghiên cứu để khai thác khả nạp dược chất vào liposome (có thể dẫn chất corticoid) để tăng hiệu điều trị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bùi Hải Bình (2016), Nghiên cứu điều trị bệnh thối hóa khớp gối nguyên phát liệu pháp huyết tương giàu tiểu cầu tự thân, Luận án tiến sỹ y học, Đại học Y Hà Nội, Hà Nội, tr.3-13 Ngô Thị Lan (2015), Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin PEG hóa, KLTN Dược sĩ đại học, Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr.9-11 Nguyễn Diệu Linh (2010), Tổng quan liposome số ứng dụng ngành dược, KLTN Dược sĩ đại học, Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr.2-17 Tài liệu tiếng Anh Ambika G.B., Alan J.G (2017), "Cartilage-targeting drug delivery: can electrostatic interactions help?", Nature Reviews Rheumatology, 13, pp.183 Bonanomi M., Velvart M., Weder H (1987), "Fate of different kinds of liposomes containing dexamethasone palmitate after intra-articular injection into rabbit joints", Journal of microencapsulation, 4, pp.189-200 Butoescu N., Jordan O., Doelker E (2009), "Intra-articular drug delivery systems for the treatment of rheumatic diseases: a review of the factors influencing their performance", European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 73, pp.205-218 Knight C., Ih S (1979), "Liposomes as carriers of anti-inflammatory steroids", Frontiers of biology, 48, pp.575 Christopher H.E., Virginia B.K., A.Setton L (2014), "Progress in intra-articular therapy", Nature Reviews Rheumatology, 10, pp.11-22 Eijiro H., Katsuaki K., Izumi T., et al (2002), "Size-dependency of DLlactide/glycolide copolymer particulates for intra-articular delivery system on phagocytosis in rat synovium", Pharmaceutical research, 19, pp.132-139 10 G.Mezger T (2006), Rheology Handbook, Maxbauer, Germany, 11 Hou S., Yu H (1997), "Comparison of systemic absorption of aqueous and liposomal lidocaine following intra-articular injection in rabbits", Journal of the Formosan Medical Association= Taiwan yi zhi, 96, pp.141-143 12 Ih S., Knight C., Dingle J (1976), "Liposomal retention of a modified antiinflammatory steroid", Biochemical Journal, 158, pp.473 13 Dong J., Dinghua J., Zhen W., et al (2013), "Intra-articular delivery of liposomal celecoxib–hyaluronate combination for the treatment of osteoarthritis in rabbit model", International journal of pharmaceutics, 441, pp.285-290 14 Dingle J., Gordon J., Hazleman B., et al (1978), "Novel treatment for joint inflammation", Nature, 271, pp.372 15 Linyi Z., Jasmine S., Anthony J., et al (2017), "Ultra-low friction between boundary layers of hyaluronan-phosphatidylcholine complexes", Acta biomaterialia, 59, pp.283-292 16 López‐García F., Vázquez‐Autón I M., Oil F., et al (1993), "Intra‐articular therapy of experimental arthritis with a derivative of triamcinolone acetonide incorporated in liposomes", Journal of pharmacy and pharmacology, 45, pp.576578 17 Silva M.D., ThomasD., Hazleman B., et al (1979), "Liposomes in arthritis: a new approach", The Lancet, 313, pp.1320-1322 18 Marguerite R., Bernard L., Laurent G., et al (2014), "Effect of Mannitol on Hyaluronic acid Stability in Two in Vitro Models of Oxidative Stress", Polymers, 6, pp.1948-1957 19 Mat N., Ajay M., Peter S., et al (2018), "A Comparison Between Rheological Properties of Intra-articular Hyaluronic Acid Preparations and Reported Human Synovial Fluid", Advances in therapy, pp.1-8 20 Naila E.K., Amélie B., Nicolas H., et al (2015), "Effect of liposomes on rheological and syringeability properties of hyaluronic acid hydrogels intended for local injection of drugs", International journal of pharmaceutics, 487, pp.187-196 21 Nigel C.P., Thomas D., Graham K., et al (1979), "Liposome-incorporated corticosteroids II Therapeutic activity in experimental arthritis", Annals of the rheumatic diseases, 38, pp.553 22 Peter G., Diego G (2002), "Potential mechanism of action of intra-articular hyaluronan therapy in osteoarthritis: are the effects molecular weight dependent?", Seminars in arthritis and rheumatism, 32, pp.10-37 23 Schwendener R., Lagocki P., Rahman Y (1984), "The effects of charge and size on the interaction of unilamellar liposomes with macrophages", Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 772, pp.93-101 24 Altman R., Manjoo A., Fierlinger, et al (2015), "The mechanism of action for hyaluronic acid treatment in the osteoarthritic knee: a systematic review", BMC musculoskeletal disorders, 16, pp.321 25 Scott Hr E., Martin C., Gerard S., et al (2007), "Biodistribution and clearance of intra-articular liposomes in a large animal model using a radiographic marker", Journal of liposome research, 17, pp.249-261 26 Selcan T., Suna E., Asuman Y.O., et al (2005), "Scintigraphic imaging of radiolabelled drug delivery systems in rabbits with arthritis", International journal of pharmaceutics, 296, pp.34-43 27 Vibeke S., Robert K., John I (2007), "Biologic therapies in rheumatology: lessons learned, future directions", Nature Reviews Drug Discovery, 6, pp.75 28 Foong W., Green K (1993), "Treatment of Antigen‐induced Arthritis in Rabbits with Liposome‐entrapped Methotrexate Injected Intra‐articularly", Journal of pharmacy and pharmacology, 45, pp.204-209 29 Foong W., Green G (1988), "Retention and distribution of liposome‐entrapped [3H] methotrexate injected into normal or arthritic rabbit joints", Journal of pharmacy and pharmacology, 40, pp.464-468 30 Williams A., Camilleri J., Goodfellow R., et al (1996), "A single intra-articular injection of liposomally conjugated methotrexate suppresses joint inflammation in rat antigen-induced arthritis", Rheumatology, 35, pp.719-724 ... gel HA Nhiều nghiên cứu liposome có khả làm thay đổi đặc tính lưu biến gel HA tương tác vật lý Nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài Nghiên cứu bào chế hydrogel acid hyaluronic chứa liposome với... đầu nghiên cứu bào chế hydrogel HA chứa liposome với số nội dung sau đây: - Bào chế hệ liposome khơng PEG hố liposome PEG hố (khơng chứa dược chất) với kích thước tỷ lệ thành phần khác - Bào chế. .. bị, dụng cụ bào chế, kiểm nghiệm khác 2.2 Đối tượng nghiên cứu - Liposome trắng - Liposome PEG hóa - Gel HA - Gel HA chứa liposome 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp bào chế liposome Thành