GIÂM CÀNH IN VITRO VÀ TẠO MÔ SẸO CHO CÂY CHÈ Camellia sinensis (L.) O. Kuntze

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP GIÂM CÀNH IN VITRO VÀ TẠO MÔ SẸO CHO CÂY CHÈ Camellia sinensis (L.) O Kuntze Họ tên sinh viên: PHẠM VĂN HƯNG Ngành: NƠNG HỌC Niên Khóa: 2006 – 2010 TP Hồ Chí Minh, tháng 08/2010 i GIÂM CÀNH IN VITRO VÀ TẠO MÔ SẸO CHO CÂY CHÈ Camellia sinensis (L.) O Kuntze Tác giả PHẠM VĂN HƯNG Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp Kỹ sư ngành Nông học Giáo viên hướng dẫn: TS VÕ THÁI DÂN ThS NGUYỄN VŨ PHONG TP Hồ Chí Minh, tháng 08/2010 ii LỜI CẢM ƠN Con xin thành kính cơng ơn sinh thành, giáo dưỡng bố mẹ nuôi khôn lớn Anh chị em, người thân gia đình động viên tinh thần, hỗ trợ tạo điều kiện tốt cho học tập Chân thành cảm ơn: O Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Nơng học quan tâm giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập trường O Q thầy khoa Nơng học tận tình dạy bảo kiến thức quý báu suốt trình học tập O Thầy Lê Đình Đơn Tơ Thị Nhã Trầm tạo điều kiện giúp em thực tập môn Công nghệ Sinh học O Tập thể lớp Nông học 32 bạn bè giúp đỡ động viên thời gian học tập thực đề tài Em xin gởi lời tri ân sâu sắc đến thầy Võ Thái Dân thầy Nguyễn Vũ Phong tận tình hướng dẫn giúp đỡ em hồn thành khóa luận Tp HCM, tháng 08 năm 2010 PHẠM VĂN HƯNG iii TÓM TẮT Phạm Văn Hưng, 08/2010 “GIÂM CÀNH IN VITRO VÀ TẠO MÔ SẸO CHO CÂY CHÈ Camellia sinensis (L.) O Kuntze” Nhằm tìm chất khử tanin hom chè, hạn chế tanin mẫu cấy, phương pháp khử trùng, môi trường giâm cành thích hợp cho cành chè, đề tài tiến hành phòng ni cấy mơ, mơn Công nghệ Sinh học, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh từ tháng đến tháng năm 2010 Đề tài gồm hai nội dung: xác định phương pháp, chất khử trùng mẫu chè; phương pháp khử tannin mẫu vitamin C 100 mg/l ảnh hưởng nồng độ TDZ đến hình thành chồi hom chè với tổng cộng ba thí nghiệm: phương pháp khử trùng mẫu kháng sinh thuốc diệt nấm phổ rộng; xác định chất khử tanin mẫu chè ảnh hưởng nồng độ TDZ đến hình thành chồi hom chè; ảnh hưởng TDZ đến tạo chồi chè môi trường lỏng tĩnh Sau thí nghiệm thu kết sau: Vitamin C có hiệu khử tanin giâm cành chè in vitro, việc cấy chuyển môi trường tuần có hiệu hạn chế chết hoại mẫu tanin từ hom chè tiết Về khử trùng mẫu cấy, chưa tìm phương thức khử trùng mẫu tối ưu Nhưng bước đầu ghi nhận kết khử trùng mẫu thuốc trừ nấm Zincopper 50WP với liều lượng 5ml/10ml ngâm tiếng ngâm kháng sinh Tetracycline 250mg/l tiếng hiệu phương thức khử trùng mẫu dùng thí nghiệm Về mơi trường giâm cành: môi trường MS lỏng kết hợp với TDZ nồng độ 0,02 mg/l, 0,2 mg/l, 2mg/l không phù hợp giâm cành chè in vitro Sử dụng môi trường MS đặc kết hợp với TDZ nồng độ gồm 0,0 mg/l, 0,02 mg/l, 0.2 mg/l, mg/l thu tám hom chè sống nồng độ 0,2 mg/l; có bảy hom phát động mầm hom chưa phát động mầm iv Hom chè thí nghiệm chưa phát triển rễ hồn chỉnh môi trường giâm cành môi trường có NAA 10 µM/l IBA µM/l v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .ii TÓM TẮT iv DANH SÁCH CÁC BẢNG ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT x Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Yêu cầu 1.3 Giới hạn đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nguồn gốc 2.2 Phân loại 2.3 Giá trị chè 2.4 Tình hình sản xuất chè giới Việt Nam 2.4.1 Tình hình sản xuất chè giới 2.4.2 Tình hình sản xuất chè Việt Nam 2.5 Giới thiệu dòng chè TB14 2.6 Cơ sở giâm cành chè 2.6.1 Cơ sở hình thành callus rễ 2.6.2 Cơ sở hình thành chồi 2.7 Chất điều hòa sinh trưởng 2.7.1 Auxin 2.7.2 Cytokinin 2.8 Các nghiên cứu in vitro chè 2.8.1 Chất khử trùng mẫu 2.8.2 Môi trường vật liệu vô mẫu 10 2.8.3 Môi trường tạo chồi 11 vi 2.8.4 Môi trường tạo rễ 13 2.8.5 Hạn chế hoại mẫu 13 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Thời gian địa điểm thí nghiệm 15 3.2 Vật liệu thí nghiệm 15 3.2.1 Mẫu thí nghiệm 15 3.2.2 Môi trường nuôi cấy 15 3.2.3 Các chất khác 16 3.3 Phương pháp thí nghiệm 16 3.3.1 Tạo vật liệu thử nghiệm ban đầu 16 3.3.2 Nội dung Xác định phương pháp, chất khử trùng mẫu 18 3.3.3 Nội dung Xác định chất khử tanin mẫu chè ảnh hưởng nồng độ TDZ đến hình thành chồi hom chè 19 3.3.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng TDZ đến tạo chồi chè môi trường lỏng tĩnh 21 3.3.4 Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể khác đến hình thành chồi hom chè vị trí thật thứ 22 3.4 Xử lý số liệu 24 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Nội dung Xác định phương pháp, chất khử trùng mẫu 25 4.1.1 Thí nghiệm Phương pháp khử trùng mẫu kháng sinh thuốc diệt nấm phổ rộng 25 4.2 Nội dung Xác định chất khử tanin mẫu chè ảnh hưởng nồng độ TDZ đến hình thành chồi hom chè 28 4.3.1 Thí nghiệm 1: Thời gian khử tannin mẫu vitamin C 100mg/l ảnh hưởng nồng độ TDZ đến hình thành chồi hom chè 28 4.3 Nội dung Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể khác đến hình thành chồi hom chè vị trí thật thứ 34 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 5.1 Kết luận 36 5.2 Đề nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 vii PHỤ LỤC 41 viii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Biến động diện tích, suất sản lượng chè Việt Nam từ 2000 – 2007 Bảng 3.1 Thành phần môi trường MS 15 Bảng 3.2: Các nghiệm thức thí nghiệm khử trùng mẫu kháng sinh thuốc diệt nấm phổ rộng 19 Bảng 3.3 Các nghiệm thức thí nghiệm 20 Bảng 3.4 Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hưởng TDZ đến tạo chồi chè môi trường lỏng tĩnh 21 Bảng 3.5 Giá thể đất cát hấp vô trùng 23 Bảng 4.1 Tỷ lệ mẫu thành công sau khử trùng thí nghiệm nội dung 25 Bảng 4.2 Tỉ lệ thành công sau khử Tanin thí nghiệm nội dung 30 Bảng 4.3 Chiều cao chồi (cm), số lá/chồi hom chè NT8 31 Bảng 4.5 Tỷ lệ sống mẫu (%) cấy môi trường lỏng tĩnh 33 Bảng 4.6 Tỷ lệ sống mẫu (%) 34 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BA,BAP : N6 – benzyladenine, benzy amino purin FAO : Tổ chức nông lương giới (Food and Agriculture Organization) IBA : Indole-3-butyric acid LLL : Lần lặp lại M1 : Môi trường rắn M2 : Môi trường lỏng MS : Môi trường Murashige and Skoog (1962) MTN : Môi trường NAA : α – napthylacetic acid NG : Ngày giâm NT : Nghiệm thức TDZ : N-phenyl1-1,2,3-thiadiazol-5ylurea x 4.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng TDZ đến tạo chồi chè môi trường lỏng tĩnh Theo Huetteman Preece,(1993) chứng minh ảnh hưởng TDZ đến tái sinh chồi nhanh số loài thân gỗ Để khảo sát ảnh hưởng TDZ đến tạo chồi hom chè môi trương long tĩnh, thí nghiệm tiến hành thu kết sau bảng 4.4 Bảng 4.5 Tỷ lệ sống mẫu (%) cấy môi trường lỏng tĩnh NT Nồng độ TDZ (mg/l) Số mẫu Số mẫu sống sau 15 ngày giâm 0,02 36 0,2 36 36 Dựa vào kết bảng 4.5 cho thấy 15 ngày sau giâm cành tồn hom chè thí nghiệm 1, 2, chết hoàn toàn Hiện tượng xuất hom chè hom bị hóa nâu mơi trường bơng gòn bị hóa nâu hồn tồn, ngun nhân mô thực vật hom chè tiếp súc trưc tiếp với dung dịch môi trường làm úng hoại môi trường lỏng tĩnh thiếu oxi làm cho hom chè bị hóa nâu chết Qua đó, cho thấy giâm cành chè môi trường lỏng với thể tích 15ml mơi trường khơng phù hợp A B 33 Hình 4.4: hom chè cấy mơi trường lỏng tỉnh A: Hom chè sau cấy ngày B: Hom chè sau cấy 15 ngày 4.3 Nội dung Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể khác đến hình thành chồi hom chè vị trí thật thứ Với mục đích tìm kiếm khảo sát giá thể thích hợp để giâm cành chè vô trùng ảnh hưởng giá thể khác đến chất lượng cành giâm thí nghiệm tiến hành thu kết bảng 4.6 Bảng 4.6 Tỷ lệ sống mẫu (%) NT Giá thể Tổng số mẫu Số mẫu sống sau 15 ngày giâm Cát 30 Cát đất 30 Đất 30 Hình 4.5: hom chè cấy vào đất cát vô trùng A: Hom chè sau cấy ngày B: Hom chè sau cấy 15 ngày 34 Dựa vào kết bảng 4.6 cho thấy 15 ngày sau giâm cành toàn hom chè thí nghiệm 1, 2, chết hồn tồn Hiện tượng xuất hom chè hom bị hóa nâu đen, ngun nhân q trình bảo quản chăm sóc làm thiếu oxi làm cho hom chè chết hoại Qua đó, cho thấy giâm cành chè giá thể đất cát với phương pháp bảo quản chăm sóc đưa khơng phù hợp 35 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Thí nghiệm “Giâm càn invitro tạo mơ sẹo cho chè Camellia sinensis (L.) O Kuntze” qua trình tiến hành chưa thu kết mục tiêu đề bước đầu thu chè sống phương pháp giâm cành in vitro Qua đó, cho thấy tiếp tục tiến hành thí nghiệm giâm cành chè in vitro giai đoạn Bước đầu thu số kết sau: ™ Về phương pháp khử trùng: Chọn thuốc trừ nấm Zincopper 50WP với liều lượng 5ml/10ml ngâm tiếng ngâm kháng sinh Tetracycline 250mg/l tiếng làm phương pháp khử trùng ™ Về phương pháp khử tanin mẫu: Chon Vitamin C với nồng độ 250 mg/l ngâm tiếng ™ Về môi trường giâm cành: Môi trường MS lỏng kết hợp với TDZ nồng độ 0,02 mg/l, 0,2 mg/l, 2mg/l không phù hợp giâm cành chè in vitro Sử dụng môi trường MS đặc kết hợp với TDZ nồng độ gồm mg/l, 0.02 mg/l, 0.2 mg/l, mg/l Thu tám hom chè sống nồng độ 0,2 mg/l có bảy hom phát động mầm hom chưa phát động mầm Hom chè sống thí nghiệm chưa phát triển rễ hồn chỉnh mơi trường giâm cành mơi trường có NAA 10 µM/l IBA µM/l 36 5.2 Đề nghị Tiến hành khử tannin mẫu chè Vitamin C nồng độ thời gian khác để tìm chất khử trùng phù hợp thời gian khử trùng tối ưu Tiếp tục tiến hành khử trùng mẫu kép javen chất khử trùng khác với nồng độ thời gian khác để tìm chất khử trùng phù hợp thời gian khử trùng tối ưu Tiến hành kiểm soát cách ly sâu bệnh hại khu vực vườn chè lấy mẫu Thường xuyên theo dõi thí nghiệm cấy chuyển mơi trường mơi trường bị hóa nâu 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Bá Bổng, 1995 Nhân giống nuôi cấy mô (86 trang) Bùi Thùy Linh, 2008 Thực tập môn chọn giống trồng Bộ môn Di Truyền Giống, khoa Nông học, trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Dương Cơng Kiên, 2002 Nuôi cấy mô thực vật Nhà xuất Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh (199 trang) Đặng Thị Thanh Thúy, 2006 Nhân giống in vitro Giáng Hương Luận văn tốt nghiệp khoa Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Đỗ Ngọc Quỹ, Nguyễn Kim Phong, 1997 Cây chè Việt Nam Nhà xuất nông nghiệp Hà Nội Huỳnh Minh Tấn Nguyễn Quang Thạch, 1993 Chất điều hòa sinh trưởng trồng Nhà xuất Nơng Nghiệp Ngơ Đằng Phong, 2004 Trình bày viết luận văn tốt nghiệp Khoa Nông học, trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Nguyễ Đức Thiết, 2005 Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống chè (Camellia sinensis (L.) O Kuntze) Luận văn Thạc Sĩ Khoa Học Nơng Nghiệp Trần Hồi Khải, 2002 Thử tìm phương pháp khử tanin mẫu cấy xây dựng môi trường nuôi cấy mô trà Đánh giá sản lượng trà dựa lớp tế bào mô dậu Luận văn tốt nghiệp khoa học nông nghiệp, trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh 10 Nguyễn Văn Uyển ctv, 1993 Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác chọn giống trồng Nhà xuất nông nghiệp Hà Nội 11 Phạm thị Dịu, 2009 Thử nghiệm quy trình giâm cành chè in vitro Luận văn tốt nghiệp khoa Nông Học, trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh 12 Trần Thị Kim Liên, 2008 Nghiên cứu khả phát sinh chồi từ mắt ngủ phát hoa lan Hồ Điệp Luận văn tốt nghiệp khoa học nông nghiệp, trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh 13 Võ Thái Dân, 2004 Bài giảng chè Trường ĐH Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh 14 Vũ Ngọc Phượng, Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Minh Tuấn, Thái Xuân Du (2003).Bước đầu nghiên cứu nhân giống in vitro điều (Anacardium occidentale L.).Tuyển tập 38 Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc lần thứ 2, tổ chức Hà Nội Nxb KHKT, pp945-952 15 Vũ Văn Vụ, 2003 Sinh lý học thực vật Nhà xuất Giáo Dục 16 Carl A Huetteman & John E Preece, 1993 Plant Cell, Tissue and Organ Culture 33: pp 105 – 119, 1993 17 Chin-YiLu, 1993.The use of thidiazuron in tissue culture In vitro Cell Dev Biol 29P: pp 92- 96, 1993 18 Indra Sandal, Amita Bhattacharya Paramvir Singh Ahuja, 2001 An efficientliquidculture system for tea shoot proliferation Plant cell, tissue and Organ Culture 65: pp 75-80, 2001 17 Tapan K Mondal, Amita Bhattacharya, Malathi Laxmikumaran & Paramvir Singh Ahuja, 2004 Recent advances of tea (Camillia sinensis) biotechnology Plant Cell, Tissue and Organ Culture 76, pp 195-254 18 Tapan K Mondal, Amita Bhattacharya, Malathi Laxmikumaran & Paramvir Singh Ahuja, 1998 Micropropagation of tea using Thidiaruzon Plant Growth Regulation 26: pp 57 – 51, 1998 19 Yoriguki Nakamura, 1991 In vitro propagation Techniques of Tea Plants JARQ25, pp: 185 – 194, 1991 20 Chè Việt Nam cần chiến lược quốc tế cho thương hiệu truy cập ngày 17 tháng năm 2009 21 Đôi nét thị trường xuất chè giới Cập nhật ngày 17 tháng năm 2009 22 Nuôi cấy mô tế bào thực vật truy cập ngày tháng năm 2009 23 www.fao.org 24 Nguyễn Thanh Mai Nguyễn Sĩ Luân, 2005 Ảnh hưởng ABA môi trường nuôi cấy lên tái sinh chồi trực tiếp từ nuôi cấy mẫu chè Camellia sinensis L Truy cập ngày 14 tháng năm 2009 39 25 Phỏng dịch từ bài: 'Node culture' truy cập ngày 11 tháng năm 2009 40 PHỤ LỤC Phụ lục Số liệu thơ thí nghiệm Phương pháp khử trùng mẫu kháng sinh thuốc diệt nấm phổ rộng LLL NT Tetracycline Thuốc trừ nấm Số mẫu 100 Ban đầu 20 100 10 20 100 15 20 11 250 20 10 250 10 20 10 250 15 20 12 500 20 18 500 10 20 18 500 15 20 20 0 100 20 12 100 10 20 10 100 15 20 16 250 20 11 250 10 20 250 15 20 11 500 20 16 500 10 20 18 500 15 20 20 0 100 20 15 41 Chết hoại Nhiễm nấm Nhiễm khuẩn 10 Sống 100 10 20 12 100 15 20 4 12 250 20 250 10 20 250 15 20 14 500 20 15 500 10 20 15 500 15 20 20 0 Phụ lục Số liệu thơ thí nghiệm Nội dung Phương pháp khử tannin mẫu vitamin C 100mg/l LLL Nồng Thời độ Tổng NT gian khử TDZ số mẫu tannin (mg/l) 1 Mẫu Số mẫu sống ngày sau giâm cành sống 15 30 45 60 75 90 0 0 0 4 0 0 0 12 0 0 0 0.02 2 0 0 0.02 4 0 0 0 0.02 12 0 0 0 0.2 0 0 0 0.2 4 3 3 3 0.2 12 0 0 0 42 10 0 0 0 11 4 0 0 0 12 12 0 0 0 1 0 0 0 4 0 0 0 12 0 0 0 0.02 1 0 0 0.02 4 0 0 0 0.02 12 0 0 0 0.2 0 0 0.2 4 3 3 3 0.2 12 0 0 0 10 0 0 0 11 4 0 0 0 12 12 0 0 0 1 0 0 0 4 0 0 0 12 0 0 0 0.02 2 0 0 0.02 4 0 0 0 0.02 12 0 0 0 43 0.2 0 0 0 0.2 4 2 2 0 0.2 12 0 0 0 10 0 0 0 11 4 0 0 0 12 12 0 0 0 Bảng Chiều cao chồi (cm), số lá/chồi hom chè NT8 LLL Chỉ tiêu Chiều 15 0,25 Ngày sau giâm cành 30 45 60 75 0,8 1,4 1,7 2,5 90 3.7 0,2 0,7 1,3 1,9 2,4 3,5 0,3 0,8 1,5 1,8 2,5 3,6 0,2 0,7 1,3 1,7 2,5 3,5 0,3 0,7 1,3 1,7 2,5 3,5 0,35 0,8 1,5 1,9 2,6 0,3 0,8 1,4 1,7 2,4 3,5 0,3 0,7 1,3 1,8 2,4 3,6 0,2 0,8 1,3 1,7 2,4 3,6 10 0,3 0,7 1,5 1,8 2,4 3,4 11 0,3 0,7 1,3 1,7 2,5 3,5 Mẫu số cao chồi (cm) 44 1 6 4 5 6 10 11 0,2 0,8 1,4 1,7 2,4 3.7 0,2 0,7 1,3 1,8 2,4 3,5 0,3 0,8 1,5 1,8 2,5 3,6 0,2 0,7 1,3 1,7 2,4 3,5 0,2 0,7 1,3 1,8 2,3 3.5 0,2 0,6 1,5 1,9 2,6 3,7 0,3 0,7 1,4 1,7 2,4 3,5 1 6 Số lá/chồi Chiều cao chồi (cm) Số lá/chồi 45 4 5 6 0,25 0,8 1,4 1,7 2,5 3.7 Chiều 0,2 0,7 1,3 1,9 2,4 3,5 cao 0,3 0,8 1,5 1,8 2,5 3,6 chồi 0,2 0,7 1,3 1,7 2,5 3,5 (cm) 0,2 0,6 1,4 1,8 2,4 3,5 0,3 0,7 1,5 1,9 2,6 3,5 1 6 Số lá/chồi 4 5 6 46 Bảng 4.5 Tỷ lệ sống mẫu (%) cấy môi trường lỏng tĩnh LLL   Số mẫu Số mẫu sống sau 15 ngày giâm 36 36 36 36 36 36 36 36 36 0 0 0 0 (mg/l) 0,02 0,2 0,02 0,2 0,02 0,2 2 3   Nồng độ TDZ NT       Bảng 4.6 Tỷ lệ sống mẫu (%) hom chè giá thể khác LLL     NT Giá thể Tổng số mẫu Số mẫu sống sau 15 ngày giâm 3 Cát Cát đất Đất Cát Cát đất Đất Cát Cát đất Đất 30 30 30 30 30 30 30 30 30 0 0 0 0       47 ... khác nguồn gốc chè, quan điểm nhiều người chấp nhận là: chè khởi nguyên từ vùng Đông Nam Á, từ thung lung cao vùng Brahmaputra, Irrawaddy, Salween vùng sông Mekong thuộc ngã ba biên giới phân... lý nồng độ axin cytokinin 2.8 Các nghiên cứu in vitro chè 2.8.1 Chất khử trùng mẫu Theo Debergh Vanderschaeghe (1988), mẫu chè lấy trực tiếp từ đồng ruộng bị nhiễm bẩn nhiều nguồn khác tùy theo