ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NHÂN NUÔI VÀ ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN ĐẾN TUYẾN TRÙNG KÍ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG

Với mục đích nghiên cứu ảnh hưởng của các môi trường nhân nuôi đến khả năng sinh sản của tuyến trùng kí sinh gây bệnh côn trùng và thử nghiệm các nhiệt độ bảo quản nhằm tìm ra điều kiện

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KÍ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG

Họ và tên sinh viên: LƯU CHÚC BẢO Ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT

Niên khóa: 2006 - 2010

Tháng 8 năm 2010

ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NHÂN NUÔI VÀ ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN ĐẾN TUYẾN TRÙNG

KÍ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG

Tác giả LƯU CHÚC BẢO

Luận văn được đệ trình để hoàn tất yêu cầu cấp bằng kỹ sư nông nghiệp ngành

BẢO VỆ THỰC VẬT

Giảng viên hướng dẫn

TS LÊ ĐÌNH ĐÔN

TP HCM, Tháng 08 năm 2010

LỜI CẢM ƠN

Thành kính khắc ghi ơn sinh thành, dưỡng dục của cha mẹ và anh chị - điểm tựa

tinh thần vững chắc cho con Cảm ơn gia đình đã luôn tin tưởng, yêu thương và tạo

mọi điều kiện tốt cho con trong học tập

Xin gởi lời tri ân sâu sắc đến Thầy Lê Đình Đôn, Thầy Nguyễn Ngọc Hùng đã

tận tình hướng dẫn, chỉ dạy và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập, hoàn thành

khóa luận

Xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM, ban Chủ Nhiệm

Khoa Nông học, cùng toàn thể qúy thầy cô đã tận tình dạy dỗ, giúp đỡ tôi trong suốt

thời gian học tập ở trường

Các thầy cô, anh chị trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tận tình giúp đỡ,

tao điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài

Các cô chú nông dân đã tạo điều kiện để tôi thực hiện đề tài được thuận lợi

Các anh chị, các bạn trong và ngoài lớp đã tận tình giúp đỡ, động viên tôi

trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tp Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2010

Lưu Chúc Bảo

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Ảnh hưởng của môi trường nhân nuôi và điều kiện bảo quản đến tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng” được thực hiện tại vườn rau xã Tân Phú Trung huyện Củ Chi và phòng thí nghiệm Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM

Với mục đích nghiên cứu ảnh hưởng của các môi trường nhân nuôi đến khả năng sinh sản của tuyến trùng kí sinh gây bệnh côn trùng và thử nghiệm các nhiệt độ bảo quản nhằm tìm ra điều kiện tối ưu cho việc bảo quản tuyến trùng mà không làm giảm hiệu lực diệt sâu

Đề tài bao gồm hai nội dung chính: khảo sát khả năng sinh sản của tuyến trùng

kí sinh gây bệnh côn trùng trên 4 môi trường đặc và thử nghiệm bảo quản tuyến trùng

ở 4 điều kiện nhiệt độ: nhiệt độ phòng (30 – 320C), 250C, 100C và 50C Năng suất cao nhất là 34.518 và 29.830 EPNs/10 cá thể cái ban đầu thu được ở môi trường 3 và môi trường 2 sau 8 ngày nuôi, trong khi ở môi trường 1 và môi trường 4 chỉ đạt được 19.940 và 10.764 EPNs/10 cá thể cái ban đầu Sau 6 ngày theo dõi thấy xuất hiện cá thể cái mang trứng mới Nhiệt độ tối ưu để bảo quản tuyến trùng là 100C Độc lực của

tuyến trùng ở các nhiệt độ bảo quản trên nhộng sâu xanh (Helicoverpa amigera) có sự

khác biệt rõ rệt, các tuyến trùng bảo quản ở 100C có độc lực mạnh hơn so với các tuyến trùng bảo quản ở nhiệt độ phòng, 250C và 50C Sau thời gian bảo quản 5 ngày, khả năng kí sinh gây bệnh là 88,9% Ở ngày 25 sau bảo quản, khả năng này vẫn còn nhưng bị giảm đi đáng kể (chỉ còn 11,1%)

MỤC LỤC

Trang tựa i

Lời cảm tạ ii

Tóm tắt iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt vii

Danh sách các bảng viii

Danh sách các hình ix

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu, yêu cầu, nội dung 3

1.2.1 Mục đích 3

1.2.2 Yêu cầu 3

1.2.3 Nội dung 3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Ưu thế của biện pháp phòng trừ sinh học trong nông nghiệp và đời sống 4

2.2 Khả năng và triển vọng sản phẩm thương mại hóa tuyến trùng 5

2.3 Tổng quan tuyến trùng kí sinh gây bệnh côn trùng 6

2.3.1 Đặc điểm sinh học và vòng đời của EPNs 6

2.3.2 Vi khuẩn cộng sinh 8

2.3.3 Mối quan hệ giữa EPNs và vi khuẩn cộng sinh 10

2.4 Sự phân bố, phổ kí chủ, sự cạnh tranh và tồn tại của EPNs trong tự nhiên 11

2.4.1 Sự phân bố 11

2.4.2 Phổ kí chủ 13

2.4.3 Sự cạnh tranh và tồn tại 14

2.5 Công nghệ sản xuất EPNs 15

2.5.1 Công nghệ nhân nuôi in vivo 16

2.5.1 Công nghệ nhân nuôi in vitro 17

2.6 Bảo quản tuyến trùng 19

2.7 Tình hình nghiên cứu về EPNs trên thế giới 21

2.8 Tình hình nghiên cứu về EPNs ở Việt Nam 24

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 27

3.2 Phương pháp thu thập mẫu tuyến trùng sử dụng nhộng sâu xanh làm mồi 27

3.2.1 Thời gian và địa điểm 27

3.2.2 Vật liệu nghiên cứu 27

3.2.3 Các bước tiến hành 27

3.2.4 Xử lý mẫu số liệu 28

3.3 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nhân nuôi đến sự sinh sản của tuyến trùng kí sinh gây bệnh côn trùng 29

3.3.1 Thời gian và địa điểm 29

3.3.2 Vật liệu và thí nghiệm 29

3.3.3 Phương pháp khử trùng tuyến trùng 29

3.3.4 Phân biệt tuyến trùng đực và cái 29

3.3.5 Công thức môi trường 31

3.3.6 Cách tiến hành 32

3.3.7 Phương pháp thu hoạch tuyến trùng 32

3.4 Khảo sát mật độ tuyến trùng EPN trong một vòng đời 33

3.5 Khảo sát khả năng tồn trữ EPNs ở các điều kiện nhiệt độ 34

3.5.1 Thời gian và địa điểm 34

3.5.2 Vật liệu thí nghiệm 34

3.5.3 Cách tiến hành 34

3.6 Khảo sát khả năng gây bệnh của EPNs đối với nhộng sâu xanh 34

3.6.1 Thời gian và địa điểm 34

3.6.2 Vật liệu thí nghiệm 35

3.6.3 Bố trí thí nghiệm 35

3.6.4 Cách tiến hành 35

3.6.5 Phương pháp thu hoạch mẫu tuyến trùng 36

3.7 Phương pháp xử lý số liệu 36

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

4.1 Đánh giá sự xuất hiện của EPNs trên nhộng sâu xanh ở vùng rau Củ Chi 37

4.2 Mô tả hình thái của EPNs bẫy được ở vùng rau Củ Chi, TP.HCM 38 

4.3 Khảo sát sự sinh sản của EPNs trên các môi trường nhân tạo 42

4.4 Khảo sát mật số của EPNs trong một vòng đời 45

4.5 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến tuyến trùng EPN 46

4.6 Khảo sát độc tính của EPN sau bảo quản trên nhộng sâu xanh 47

4.7 Thảo luận kết quả 48

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51

5.1 Kết luận 51

5.2 Đề nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC 55

Phụ lục 1 Giá nguyên vật liệu 55

Phụ lục 2 Số lượng EPNs trên 4 môi trường nhân nuôi trong thời gian từ 1 – 16 ngày 56

Phụ lục 3 Số lượng EPNs/vòng đời trên 4 môi trường 64

Phụ lục 4 Số lượng EPNs ở 4 nhiệt độ bảo quản tại các thời điểm 5 NSBQ, 10 NSBQ, 15 NSBQ, 20 NSBQ và 25 NSBQ 68

Phụ lục 5 Số NBKS do tuyến trùng EPN sau bảo quản xâm nhiễm 73

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Vòng đời của tuyến trùng kí sinh gây bệnh côn trùng 9

Hình 2.2 Bẫy nước thu IJs từ xác chết côn trùng 17

Hình 2.3 Sơ đồ công nghệ sản xuất in vivo và in vitro chế phẩm EPN 19

Hình 3.1 Liếp rau cải ngọt đặt bẫy và cách đặt bẫy tại Củ Chi 28

Hình 3.2 Các bộ phân của tuyến trùng cái giống heterorhabditid 30

Hình 3.3 Bộ phận đuôi của tuyến trùng đực giống heterorhabditid 30

Hình 3.4 Cơ thể tuyến trùng cái giống heterorhabditid 33

Hình 3.5 Toàn cảnh thí nghiệm 35 Hình 4.1 Thu nhộng sau đặt bẫy 38

Hình 4.2 Ấu trùng cảm nhiễm của giống Heterorhaditis (40X) 39

Hình 4.3 Các bộ phận của tuyến trùng đực giống Heterorhabditis 40

Hình 4.4 Các bộ phận của tuyến trùng cái giống Heterorhabditis 41

Hình 4.5 EPNs trên các môi trường ở ngày thứ 8 sau nuôi 44

Hình 4.6 Mẫu nhộng thu được sau khi chủng EPNs ở 5 NSBQ 48

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 4.1 Số nhộng bị EPNs ký sinh trong tháng 3 tại vườn rau huyện Củ Chi 37

Bảng 4.2 Số lượng EPNs trên 4 loại môi trường từ ngày 2 đến 8 sau khi cấy 42

Bảng 4.3 Số lượng EPNs trên 4 loại môi trường từ ngày 10 đến 16 sau khi cấy 42

Bảng 4.4 Số lượng EPN trong một vòng đời/tuyến trùng cái 45

Bảng 4.5 Số lượng EPNs trên 4 nhiệt độ bảo quản tại các thời điểm 5 NSC, 10 NSC,

Bảng 4.6 Tỷ lệ NBKS do tuyến trùng EPN sau bảo quản xâm nhiễm 47

Chương 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Trong xu thế phát triển toàn cầu, việc sản xuất và tiêu thụ rau trên thế giới cũng như nhu cầu trong nước ngày càng gia tăng nhanh, nhất là khi đời sống càng cao, dư thừa lương thực thực phẩm thì người ta càng có xu hướng sử dụng thực vật xanh nhiều hơn nhằm đảm bảo sức khỏe nâng cao tuổi thọ Vì vậy việc mở rộng diện tích sản xuất

để đáp ứng đủ nhu cầu tiêu thụ là điều cần thiết, bên cạnh đó vấn đề về an toàn thực phẩm của nông sản phẩm ngày càng được chú trọng hơn Tuy nhiên, chính sự gia tăng nhanh về diện tích cũng như tính chuyên canh hóa ngày càng cao đã làm phát sinh thêm nhiều dịch hại như sâu bệnh, cỏ dại đặc biệt sâu hại là một trong những đối tượng gây hại nghiêm trọng đối với cây trồng

Để giảm thiệt hại do dịch hại, con người đã áp dụng nhiều biện pháp phòng trừ, nổi trội hơn cả là biện pháp hóa học, với độc tính cao, hiệu lực trừ sâu có tác động mạnh và nhanh của thuốc trừ sâu đã phần nào hạn chế những dịch hại trên Tuy nhiên

do tâm lý lo sợ mất mùa và sự thiếu hiểu biết, người dân đã sử dụng thuốc một cách liên tục, tràn lan thiếu khoa học, thiếu hợp lý, đặc biệt là dùng các loại thuốc cấm hoặc không rõ nguồn gốc, đã để lại nhiều hậu quả nghiêm trọng: làm tăng tính kháng thuốc của sâu hại, tiêu diệt một số thiên địch của sâu, ảnh hưởng tới hệ vi sinh vật có ích trong đất, làm môi trường bị ô nhiễm nặng nề, phá hủy nghiêm trọng thế cân bằng trong hệ sinh thái nông nghiệp Để lại dư lượng thuốc trong cây trồng cũng như trong đất Gây ra ngộ độc thực phẩm ảnh hưởng đến sức khoẻ con người và môi trường sống

Trong những thập niên gần đây, để hạn chế những hậu quả do biện pháp hóa học mang lại, các biện pháp sinh học ngày càng được đề cao, ứng dụng rộng rãi và dần

trở thành công cụ chủ đạo của ngành Bảo Vệ Thực Vật, góp phần thực tiễn cho vấn đề sản xuất rau an toàn, hướng tới một nền nông nghiệp bền vững Những tác nhân sinh học đó là: các côn trùng thiên địch (bọ xít ăn mồi, ong kí sinh); nấm gây bệnh côn

trùng (như Beauveria, Metarhizium, Paecilomycetes, Cephalosporium, Verticillium,

Aspergilus, Penicillium, Sorosporell) đã được nhiều nước trên thế giới nghiên cứu và

áp dụng thành công Vi khuẩn gây bệnh côn trùng: vi khuẩn Bacillus popilae, Bacillus

thuringiensis (Bt) để kiểm soát sâu tơ Virus gây bệnh côn trùng: virus đa diện nhân

(NPV), virus hạt (GV), virus đa diện tế bào chất (CPV) Hiện nay tuyến trùng ký sinh gây hại côn trùng đã và đang là đối tượng nghiên cứu của nhiều nước để sản xuất ra các chế phẩm sinh học nhằm hạn chế các loài sâu hại như sâu xanh, sâu keo da láng, sâu đục thân hại táo, đào, cây có múi, dế nhũi và chấu chấu phá hại cỏ trên các sân gôn Ngoài những ứng dụng trong nông nghiệp, EPNs còn được nghiên cứu và ứng dụng trong

Xenorhadus nematophilus cộng sinh với Steinernema feltidae Đến nay, người ta đã

biết không chỉ vi khuẩn cộng sinh với EPNs có tính kháng khuẩn mà những độc tố do chúng sinh ra trong quá trình trao đổi chất cũng có khả năng diệt khuẩn, chống loét và diệt sâu

Tầm quan trọng của tuyến trùng kí sinh gây bệnh côn trùng ngày càng được quan tâm và nghiên cứu, với nhiều ứng dụng trong nông nghiệp và y học Đặc biệt, sự xuất hiện của thuốc sinh học tuyến trùng trong phòng trừ sâu hại, góp phần đưa sản xuất nông nghiệp theo hướng bền vững sinh thái Để góp phần nâng cao hiệu lực, hạ giá thành sản phẩm, đòi hỏi phải nhân sinh khối tuyến trùng ký sinh gây hại côn trùng với qui mô lớn, nghiên cứu môi trường nhân nuôi thích hợp nhằm đánh giá khả năng phát triển của tuyến trùng này trên các loại môi trường khác nhau là việc rất quan trọng và cần thiết Bên cạnh đó, việc bảo quản và tồn trữ nguồn tuyến trùng cũng là một vấn đề quan trọng trong sản xuất Với thời gian sử dụng lâu dài, hiệu lực cao, dễ bảo quản, đóng gói và vận chuyển là những điều kiện tiên quyết cho khả năng phát triển công nghệ và triển vọng thương mại hóa sản phẩm sinh học tuyến trùng Trên thực tế đó, đề tài nghiên cứu “Ảnh hưởng của môi trường nhân nuôi và điều kiện bảo quản đến tuyến trùng kí sinh gây bệnh côn trùng” đã được thực hiện

Nghiên cứu điều kiện bảo quản tuyến trùng thích hợp nhằm hoàn thành quá trình sản xuất chế phẩm

1.2.2 Yêu cầu

So sánh khả năng sinh sản của tuyến trùng kí sinh gây bệnh côn trùng trên các môi trường nhân nuôi nhân tạo Đồng thời xác định rõ thời gian cho lượng tuyến trùng nhiều nhất, và thời điểm suy giảm số lượng

Xác định nhiệt độ thích hợp nhằm kéo dài thời gian bảo quản mà không làm mất đi hoạt tính của tuyến trùng kí sinh gây bệnh côn trùng

1.2.3 Nội dung đề tài

Nhân nuôi tuyến trùng EPN trên 4 môi trường Xác định môi trường mà tuyến trùng sinh sản nhiều nhất

Xác định thời gian của một vòng đời loài Heterorhabditis spp Xác định mật số

của tuyến trùng trong một vòng đời do một tuyến trùng cái sinh sản

Thử nghiệm bảo quản tuyến trùng ở 4 nhiệt độ Đánh giá tỷ lệ sống/chết của EPN và khả năng gây nhiễm vào nhộng sâu xanh trong đất Từ đó xác định nhiệt độ thích hợp cho bảo quản tuyến trùng

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Ưu thế của biện pháp phòng trừ sinh học trong nông nghiệp và đời sống

Khi đời sống con người càng được nâng cao thì vấn đề sức khỏe càng được quan tâm nhiều hơn Trong đó vấn đề lương thực thực phẩm rất được xem trọng Việc

sử dụng phân bón, thuốc trừ sâu hóa học trong nông nghiệp tuy mang lại hiệu quả kinh

tế cao, song việc lạm dụng quá nhiều lại gây ra các hậu quả nghiêm trọng Không chỉ làm cho đất bị thoái hóa, dinh dưỡng mất cân đối mà còn ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm, ô nhiễm môi trường do tồn dư hóa chất, đặt biệt gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng, làm mất cân bằng hệ sinh thái và tiêu diệt nhiều kẻ thù

tự nhiên của sâu hại dẫn đến sự bùng phát một số dịch hại không báo trước Cho nên các nhà khoa học luôn khuyến cáo sử dụng các biện pháp phòng trừ sinh học (PTSH) nhằm đưa nền nông nghiệp phát triển theo hướng sinh thái bền vững

Phòng trừ sinh học có thể được định nghĩa đơn giản là việc sử dụng các kẻ thù

tự nhiên nhằm giảm thiệt hại do dịch hại gây ra Với mục đích đó, các chế phẩm sinh học được sản xuất ngày càng nhiều và được nhiều người tiêu dùng biết đến Các chế phẩm này mang lại nhiều lợi ích to lớn như: không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người, vật nuôi, cây trồng; không gây ô nhiễm môi trường sinh thái; có tác dụng cân bằng hệ sinh thái (vi sinh vật, dinh dưỡng) trong môi trường đất nói riêng và môi trường nói chung; ứng dụng các chế phẩm sinh học không làm hại kết cấu đất, không làm chai đất, thoái hóa đất mà còn góp phần tăng độ phì nhiêu của đất; có tác dụng đồng hóa các chất dinh dưỡng, góp phần tăng năng suất và chất lượng nông sản phẩm; có tác dụng tiêu diệt côn trùng gây hại, giảm thiểu bệnh hại, tăng khả năng đề kháng bệnh của cây trồng mà không làm ảnh hưởng đến môi trường như các lọai thuốc BVTV có nguồn gốc hóa học khác; có khả năng phân hủy, chuyển hóa các chất hữu cơ

nhiều hơn Các loài tuyến trùng này đều thuộc hai giống Steinernema (Steinernematidae) và Heterorhabditis (Heterorhabtidae) Khả năng ký sinh và gây

bệnh này thực chất là một tổ hợp liên kết của tuyến trùng và vi khuẩn (thuộc hai giống

Xenorhabdus và Photorhabdus), trong đó tuyến trùng có vai trò mang vi khuẩn vào

trong cơ thể côn trùng và vi khuẩn sản sinh độc tố để giết chết côn trùng (http://www.dostbinhdinh.org.vn)

EPNs là thiên địch tự nhiên của côn trùng có khả năng kí sinh bắt buột, với phổ

kí chủ rộng, và có thể tự tìm kiếm kí chủ Đặc biệt nó cho kết quả tốt về kiểm soát nhiều sâu hại trong đất và sâu đục thân mà khó có thể kiểm soát được bằng phương pháp hóa học mà còn có đặc tính an toàn, không độc, giá thành thấp Các thuốc trừ sâu gây ô nhiễm nghiêm trọng và làm tăng khả năng kháng thuốc của sâu hại, tuyến trùng như là một thiên địch tự nhiên của nguồn sinh học với những tiềm năng to lớn đã thu hút sự quan tâm rộng rãi trong lĩnh vực kiểm soát sinh học quốc tế (Cong 1999;

Kaya và cs 1993 – trích dẫn bởi Hao De-jun, 2001)

2.2 Khả năng và triển vọng thương mại hóa sản phẩm sinh học tuyến trùng

Trong các biện pháp sinh học áp dụng hiện này, tuyến trùng kí sinh gây bệnh côn trùng đã và đang được nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam, quan tâm

và phát triển mạnh mẽ Bởi vì, nhóm tuyến trùng EPN có rất nhiều đặc tính ưu việt như: có khả năng kí sinh và gây bệnh cho nhiều loại sâu hại khác nhau; an toàn cho người, động vật và thực vật; khả năng sinh sản mạnh và đặt biệt chúng còn tương hợp được với nhiều loại thuốc trừ sâu hóa học và các tác nhân sinh học khác; ấu trùng cảm nhiễm có thể tồn tại lâu trong đất trong thời gian chờ vật chủ, chỉ cần phun thuốc EPN một lần cho cả quá trình; có khả năng tìm kiếm vật chủ; sâu hại không có khả năng kháng với thuốc sinh học EPNs

Một trong những ưu thế quan trọng của tuyến trùng là có thể nhân nuôi sinh

khối bằng công nghệ in vivo và in vitro EPN rất dễ dàng nhân nuôi trong phòng thí nghiệm bằng ấu trùng bướm sáp lớn (Galleria mellonella) Trong in vitro, hiện nay

người ta sử dụng 2 phương pháp: nhân nuôi trong môi trường đặc với nguyên liệu là ruột gia súc, gia cầm: với phương pháp này có thể thu được tối đa 30,58 ×105 ấu trùng cảm nhiễm cho 1 bình nhân nuôi dung tích 250 ml; nhân nuôi trong môi trường lỏng bằng thiết bị lên men tự động: phương pháp này cho phép sản xuất EPN tới dung tích

8 ×104 lít với năng suất 1,5 × 105 ấu trùng trong 1ml dung dịch Phương pháp này hiện đang được ứng dụng rộng rãi trong các nhà máy sản xuất thuốc trừ sâu sinh học ở Đức, Nhật Bản, Trung Quốc và Mỹ (http://www.saga.vn) Chính điều này đã phát triển khả năng thương mại hóa thuốc sinh học EPN

Theo số liệu thống kê trên thế giới đến năm 2000 đã có 7 loài tuyến trùng giống

Steinernema và Heterorhabditis được thương mại hóa Ví dụ, ở Mỹ đã có nhiều công

ty công nghệ sinh học sản xuất thuốc sinh học tuyến trừng để phòng trừ một số loại sâu hại ở ngô, mía, bông, thuốc lá, cây ăn quả và cây cảnh hoa kiểng Hay Trung Quốc,

thuốc sinh học tuyến trùng được sản xuất với qui mô lớn để phòng trừ một số sâu hại quan trọng như sâu qua đông hại cây đào với quy mô hàng vạn hecta, bọ hung hại mía,

và sâu đục thân hại một số cây bóng mát trong thành phố (Nguyễn Ngọc Châu, 2008) EPN còn được dùng phòng trừ dòi đục thân su hào ở Bỉ, Hà Lan và Đức, sâu đục thân

cọ ở Ả-rập Xê-út, và càng ngày càng có nhiều quốc gia nghiên cứu ứng dụng EPN trong phòng trừ nhiều loài sâu hại khác nhau

Hiện nay trên thế giới có khoảng 100 công ty sản xuất thuốc sinh học tuyến trùng cung cấp cho PTSH sâu hại (Nguyễn Ngọc Châu, 2008) Nhiều loại chế phẩm sinh học EPN được sử dụng rộng rãi như Biosafe, biostar-3 hay biostar-5, Greenlife SY-5, Biotodes A11, Biotodes H06

2.3 Tổng quan tuyến trùng kí sinh gây bệnh côn trùng

2.3.1 Đặc điểm sinh học và vòng đời của EPNs

Hiện nay trên thế giới đã định danh được 69 loài EPNs trong đó có 54 loài

thuộc Steinernema, chỉ có 1 loài thuộc giống Neosteinernema và 14 loài thuộc giống

Heterorhabditis Ở Việt Nam đã xác định được 26 loài, trong đó có 24 loài thuộc

giống Steinernematid và 2 loài thuộc giống Heterorhabditis(Nguyễn Ngọc Châu, 2008)

Trong bảng phân loại truyền thống để định danh tuyến trùng chủ yếu dựa vào các hình thái đặc trưng như: Chiều dài cơ thể, khoảng cách từ đỉnh đầu đến lỗ bài tiết, đặc điểm gai giao cấu, gai đệm của con đực và một số đặc điểm điển hình khác Theo Hao De-jun và ctv (2001), trong nhiều năm qua nhiều nghiên cứu về hệ thống EPNs bị hạn chế, bao gồm những tiêu chuẩn về mô tả loài, đề nghị sửa đổi tên, làm sáng tỏ mối phát sinh loài trong ngành tuyến trùng dựa vào đặc điểm phân tử và đưa ra khóa phân loại tuyến trùng mới, đó là những thay đổi mang lại sự ổn định và phát triển của hệ thống EPNs Số lượng tuyến trùng tìm ra được gần đây đã làm tăng thêm nhiều ý nghĩa về lĩnh vực nghiên cứu tuyến trùng EPNs của thập niên qua

Theo Gaugle (2006), EPNs (Entomopathogenic nematodes) là những động vật không xương sống, thuộc ngành giun tròn (Nematoda), thường được gọi là

“roundworms” EPNs có khả năng ký sinh gây chết côn trùng đặc biêt côn trùng sống trong môi trường đất (do đó được gọi là tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng), đúng như tên gọi chúng chỉ gây bệnh cho côn trùng, vô hại với con người, cây trồng và vật nuôi EPNs sống bên trong cơ thể vật chủ nên được gọi là “nội ký sinh”

(trích dẫn Phạm Thị Mến, 2009)

EPNs gồm 2 giống Steinernematid và Heterorhabditid từ lâu đã được ghi nhân như một tác nhân kiểm soát côn trùng có hiệu quả, và đã thu hút sự quan tâm đáng kể như là một loại thuốc trừ sâu sinh học Tuyến trùng được chứng minh là tác nhân kiểm soát tiềm năng của một số côn trùng gây hại (Nuchanart, Suebsak và Jariya, 1999) Ấu trùng cảm nhiễm (IJ) tuổi 3 và ấu trùng cảm nhiễm tuổi lớn (DJ) xâm nhập vào côn trùng vật chủ trong môi trường đất IJs, chỉ có giai đoạn này xuất hiện bên ngoài côn trùng, được bao bọc trong lớp cuticle của giai đoạn tuổi 2, mà lớp mà dễ bị mất đối với Steinernematid, nhưng vẫn tồn tại ở Heterorhabditid cho đến trước hay sau khi xâm

nhập vào vật chủ Trong IJs, vi khuẩn cộng sinh, loài Xenorhabdus và Photorhabdus,

chứa trong túi ở ruột trước của Steinernematid và trong ống ruột với Heterorhabditid

IJ tấn công vào vật chủ qua lỗ hở tự nhiên (miệng, hậu môn, lỗ thở) hoặc những chỗ mỏng của màng cuticle vật chủ (thường chỉ có Heterorhabditid) và xâm nhập vào

Sự khác biệt chính giữa 2 giống Steinernematid và Heterorhabditid là loài

Steinernema thì phân tính, trong khi loài Heterorhabditis thế hệ 1 lưỡng tính, nhưng

phân tính ở thế hệ thứ 2 Do đó, Steinernematid yêu cầu một IJ đực và cái xâm nhiễm vào côn trùng vật chủ để sinh sản con cái, trong khi Heterorhabditid chỉ cần một IJ xâm nhập vào vật chủ vì con trưởng thành lưỡng tính tự thụ tinh Tuy nhiên, theo

Griffin và cs (2001) đã tìm thấy một loài Steinernema không được mô tả từ Indonesia

mà phần lớn là lưỡng tính tự thụ tinh với một tần số thấp con đực (1 – 6% số lượng) (Hazir và cs, 2004)

Còn tuyến trùng Neosteinernema cũng tương tự như vòng đời của Steinernema

chỉ khác một điểm là loài này chỉ có một thế hệ (chỉ có vòng đời ngắn) và tuyến trùng

mẹ không đẻ trứng, tất cả trứng nở bên trong thân mình con mẹ và sinh trưởng cho đến khi trở thành ấu trùng cảm nhiễm Ấu trùng cảm nhiễm sẽ chui ra khỏi thân mình tuyến trùng mẹ phân tán vào môi trường xung quanh để tìm ký chủ mới (http://thnlscantho-2.page.tl)

2.3.2 Vi khuẩn cộng sinh

Vi khuẩn cộng sinh liên kết với Steinernema thì thuộc giống Xenorhabdus, trong khi VKCS phát sáng liên kết với Heterorhabditis thì thuộc giống Photorhabdus

Cả hai loài này đều là vi khuẩn gram âm, kị khí không bắt buộc, không tạo bào tử và

có dạng hình que Thuộc họ Enterobacteriaceae, trong giống Xenorhabdus có 5 loài cộng sinh với Steinernema, trong khi giống Photorhabdus có 3 loài cộng sinh với giống Heterorhabditis Loài Photorhabdus luminescens có 5 loài phụ, loài

Photorhabdus asymbiotica không cộng sinh với tuyến trùng

(trích dẫn bởi Hazir và cs, 2004)

sự ngộ độc máu hay nhiễm trùng máu, điều này phụ thuộc vào tính nhạy của côn trùng

và dòng VKCS Vài giống Xenorhabdus và Photorhabdus rất độc hại: phun ít hơn

10 tế bào vi khuẩn vào trong xoang máu có thể đủ để giết chết những côn trùng nhạy

cảm như G mellonella hay Manduca sexta Khi nhân nuôi trong môi trường lỏng, cả

hai giống VKCS này tiết ra độc tố trừ sâu rất độc hại vào trong môi trường Khi vi khuẩn đi vào trong pha ổn định của chu kì sinh trưởng, chúng tiết ra lipase, protease và vài loại chất kháng khuẩn, kháng nấm và kháng sinh

Sự khác nhau cơ bản giữa hai giống vi khuẩn Xenorhabdus và Photorhabdus là phần lớn Photorhabdus thì có khả năng tạo sáng huỳnh quang và có phản ứng Catalase dương tính, trong khi Xenorhabdus thì không có khả năng tạo sáng huỳnh quang và có phản ứng Catalase âm tính Cả Xenorhabdus và Photorhabdus xuất hiện hai biến thể

kiểu hình Những tế bào phase I thì lớn hơn tế bào phase II, và sản sinh lượng enzyme ngoại bào, độc tố, chất kháng sinh đặc trưng nhiều hơn phase II Tuy nhiên DJ của tuyến trùng đóng gói và vận chuyển chỉ những tế bào phase I Tế bào phase I được bảo quản trong túi đặc biệt ở ruột trước của Steinernematid, trong khi Heterorhabditid không có túi đặc biệt nhưng lưu trữ VKCS ở phía trước Vai trò của tế bào phase II ở VKCS thì không rõ ràng, như là những cơ chế phân tử chịu trách nhiệm cho hiện tượng này

Không có báo cáo nào về sự phân lập Xenorhabdus và Photorhabdus từ đất và

nó thường được giả thuyết rằng vi khuẩn này không thể tồn tại trong đất nơi mà thiếu tuyến trùng liên kết với chúng Morgan và cs (1997) đã phóng thích dòng

X nematophila và P.luminescens vào trong mô hình thu nhỏ đất không vô trùng, và họ

nhận thấy rằng tế bào được phóng thích giảm xuống dưới giới hạn được biết trong

vòng 7 ngày Bleakley và Chen (1999) đã báo cáo rằng P luminescens có thể sinh

trưởng và sống lâu hơn quá 30 ngày khi được phân lập trong đất khử trùng mà sự bổ sung dinh dưỡng được thêm vào (trích dẫn bởi Burnell và Stock, 2000)

2.3.3 Mối quan hệ giữa EPNs và vi khuẩn cộng sinh

Một loài tuyến trùng được liên kết riêng biệt với một loài VKCS, nhưng loài vi

khuẩn này có thể kết hợp với nhiều loài tuyến trùng Ví dụ như S feltiae liên kết với

X bovenii, nhưng loài vi khuẩn này cũng có thể liên kêt với S kraussei Akhurst và

Boemare (1990) đã phát biểu rằng tuyến trùng sinh sản tốt nhất xảy ra với vật cộng sinh tự nhiên của chúng, nhưng trong vài trường hợp, tuyến trùng có thể với loài vi khuẩn khác Giữa tuyến trùng và vi khuẩn có mối quan hệ tương hỗ với nhau Tuyến trùng thì phụ thuộc vào vi khuẩn để giết chết nhanh chóng côn trùng kí chủ của nó

Tầm quan trọng của mối liên kết cộng sinh trong quá trình gây bệnh được nhận thấy rõ

ràng trong phức hợp S glaseri/X poinarii Khi ấu trùng của G mellonella được phun với S glaseri hay 1150 tế bào của X poinarii thuần thì ấu trùng côn trùng sống lâu hơn Song, phun hỗn hợp 115 X poinarii và 1 DJ của S glaseri giết được 75 % ấu

trùng Vi khuẩn còn gia tăng môi trường cho sự phát triển của tuyến trùng bằng cách sinh ra kháng sinh tiêu diệt vi sinh vật cạnh tranh Biến đổi mô vật chủ thành nguông thức ăn và cung cấp một nguồn thức ăn phong phú cho tuyến trùng Vi khuẩn cần tuyến trùng để bảo vệ khỏi môi trường bên ngoài, xâm nhập vào bên trong xoang máu vật chủ và ức chế các protein kháng khuẩn của vật chủ (trích dẫn Hazir và cs, 2004)

2.4 Sự phân bố, phổ kí chủ, sự cạnh tranh và tồn tại của EPNs trong tự nhiên 2.4.1 Sự phân bố

EPNs rất phổ biến trong những loại đất trồng trọt và bỏ hoang, nhìn chung chúng có ở hầu hết các vùng trên thế giới (Hominick, 2002 – trích dẫn Phan Thị Hồng

nghi với điều kiện môi trường nơi chúng và vật chủ tồn tại Vì vậy, sự phân bố thường rải rác thay đổi theo không gian và thời gian, tùy thuộc vào từng loài, môi trường sống,

sự di chuyển của tuyến trùng cảm nhiễm hoặc sự di chuyển của ký chủ bị lây nhiễm Ở vùng ôn đới tuyến trùng EPN có tỷ lệ hiện diện cao hơn vùng nhiệt đới Và các hệ sinh thái rừng tự nhiên bao giờ cũng có tỷ lệ hiện diện tuyến trùng EPN cao hơn hẳn so với

hệ sinh thái hay các sinh cảnh khác Theo điều tra trong gần 70 loài EPN (54 loài

thuộc Steinernemadid và 14 loài thuộc Heterorhabditid) được phát hiện và mô tả, thì

có 6 loài có diện phân bố tương đối rộng Ba loài thuộc giống Steinernema là

S glaseri, S feltiae, S carpocapsae và 3 loài thuộc giống Heterorhabditis là

H bacteriophora, H indica và H megidis Sáu loài này được tìm thấy nhiều ở nhiều

vùng khí hậu ôn đới, nhiệt đới và cận nhiệt đới của Châu Á, Châu Âu và Châu Mỹ

Một số loài khác chỉ phân bố ở vùng ôn đới như S intermedium, S kraussei,

S weiseri, S silvaticum, S affine và H downesi (Nguyễn Ngọc Châu, 2008)

Từ năm 1997 cho đến nay, ở Việt Nam đã tiến hành điều tra, phân lập và thu

được 64 chủng tuyến trùng EPN, trong đó có 15 chủng Heterorhabditis và 49 chủng

Steinernema Và đã xác định được 26 loài tuyến trùng, trong đó có 24 loài thuộc

steinernematid và 2 loài thuộc heterorhabditid.  Theo Phan Kế Long (2006), ở Việt

Nam hầu như tất cả các chủng EPNs phân lập được đều từ các sinh cảnh tự nhiên, còn tại các khu vực canh tác nông nghiệp gần như không tồn tại hoặc rất ít gặp Trong khi

đó ở Canada thì kết quả điều tra có phần ngược lại, EPN có mặt ở khắp mọi nơi Điều này có thể được lí giải do việc sử dụng nhiều phân bón vô cơ và hóa chất bảo vệ thực vật không những tiêu diệt côn trùng có hại mà còn có thể tiêu diệt cả tuyến trùng có ích Tỷ lệ hiện diện của EPNs trong đất cũng là dấu hiệu cho thấy môi trường sinh thái tốt và ổn định Tỷ lệ hiện diện càng cao cũng có nghĩa là sự đa dạng của EPNs càng lớn và môi trường sinh thái càng tốt (Nguyễn Ngọc Châu, 2008) Theo Nguyễn Thị Thùy Trang (2008), qua các lần điều tra nhận thấy ở cả 3 vùng trồng rau tại Hóc Môn,

Củ Chi, Bình Chánh TP Hồ Chí Minh đều có sự hiện diện của EPNs trong đất

Theo một số nghiên cứu điều tra trước đây, có ý kiến cho rằng giống Steinernematid thường phân bố ở các vùng ôn đới Nhưng với những phát hiện gần

đây ý kiến này đã bị bác bỏ Những loài mới được mô tả gần đây như: S scapterisci từ Uruguay, S cubanum ở Cuba, S abbasi từ Oman, S thermophilum từ Ấn Độ Gần đây nhất là những loài được phát hiện từ Việt Nam và Trung Quốc như: S aciari,

S.akhursti và S beddin, S hebeiense, S leizhouense (Nguyen và cs, 2006), đều được

phát hiện từ vùng nhiệt đới Cũng trái với nhận định rằng giống Heterorhabditid thường phân bố ở các vùng nhiệt đới, thì thời gian gần đây đã có khá nhiều đại diện của giống này được phân lập ở một số vùng ôn đới và hàn đới như Ireland, Scotland và

xứ Wale Hàng loạt phát hiện mới trên đây về sự hiện diện của EPN tại các vùng khác nhau của thế giới cho thấy: sự thích nghi của tuyến trùng EPN với các điều kiện khí hậu tùy thuộc vào loài nhiều hơn là vào giống (Nguyễn Ngọc Châu, 2008)

2.4.2 Phổ kí chủ

Hoạt động kí sinh gây bệnh của các loài tuyến trùng thuộc giống Steinernematid và Heterorhabditid đã được chứng minh gây bất lợi cho phổ rộng côn trùng gây hại trong môi trường sống khác nhau Hỗn hợp tuyến trùng – vi khuẩn giết chết côn trùng nhanh chóng mà không cần hình thành mối quan hệ mật thiết, thích nghi cao, mối quan hệ kí chủ - kí sinh đặc trưng cho sự liên kết tuyến trùng – côn trùng Tỷ lệ tử vong nhanh cho phép tuyến trùng mở rộng phổ kí chủ hầu như ở tất cả

các bộ côn trùng, một phổ hoạt động tốt vượt xa bất kì tác nhân nấm gây bệnh côn

trùng nào Những kiểm tra trong phòng thí nghiêm, S carpocapsaae đã tấn công hơn

250 loài của hơn 75 họ trong bộ côn trùng (Divya và Sankar, 2009) Theo Lacey và ctv

(2001), phổ ký chủ của tuyến trùng EPNs gồm: Bọ hung (Popilliila japonica), bọ hung đen (Alissonotum impressicolle), sâu đục trái táo (Carposina niponensis), sâu hại rễ mía (Mahanaarva fimbriolata), sâu xanh (Spodoptera exigua), ấu trùng đục gốc nho (Otiorhynchus sulcatus), sâu đục thân chuối (Cosmopolites sordidus), sâu đục thân táo, đào, nhãn và vải (Carposina niponensis), sâu đục thân và cành cà phê (Hypothenemus

hampei), sâu đục thân ngô (Helicopverpa zea), sâu đục thân và củ khoai lang (Cylas formicarius), sâu đục thân cây bóng mát ở thành phố (Holcocerus insularis), sâu ăn lá

(Spodoptera littoralis và Spodoptera exigua), dòi đục lá (Liriomyza sp.), mối hại đê điều kho tàng (Reticulitemes sp.) và côn trùng y học ấu trùng muỗi sốt rét (Culax

pipiens), ấu trùng muỗi sốt xuất huyết (Aedes aegypti) và loài ve bét (Boophilus

annulatus) (trích dẫn Ngô Thị Thu Hằng, 2009)

Trong phòng thí nghiệm, hầu hết EPNs xâm nhiễm các loài côn trùng khác nhau ở nơi tiếp xúc với vật chủ, điều kiện môi trường tối ưu, và không bị ngăn cản bởi tác động môi trường bên ngoài đến quá trình xâm nhiễm Ngoài đồng ruộng, EPNs tấn công vào phổ kí chủ hẹp hơn so với trong phòng thí nghiệm, thêm vào đó tính an toàn của chúng như những tác nhân kiểm soát sinh học Bởi vì tuyến trùng này thích nghi trong môi trường đất, kí chủ chính là côn trùng sống trong đất Việc phân lập

loài/giống tuyến trùng mới thì thường được sử dụng ấu trùng bướm sáp lớn, Galleria

mellonella, và do đó, phổ kí chủ được biết đến của tuyến trùng đều thiên về những côn

trùng thuộc bộ cánh vẩy Tuy nhiên, vài loài tuyến trùng đã được phân lập từ xác kí

chủ ngoài đồng ruộng thì có phổ kí chủ giới hạn như S kushidai và S scarabaei thích

nghi với ấu trùng bọ hung S scapterisci thích nghi với dế dũi và tấn công kém với

Xenorhabdus dòng UY61 và S scapterisci dễ dàng tấn công G mellonella

(Hazir và cs, 2004)

Giới hạn chủ yếu về phổ ký chủ của EPNs là hoạt động tìm kiếm ký chủ của IJs EPNs có hoạt động tìm kiếm côn trùng ký chủ để xâm nhiễm khác nhau, chịu ảnh

hưởng bởi các yếu tố trong môi trường cũng như khả năng phân bố sâu trong đất và ký chủ ưa thích IJs sử dụng những cách thức tìm kiếm khác nhau để định vị và xâm

nhiễm vào ký chủ Ví dụ như Steinernema carpocapsae thì sử dụng chiến thuật nằm

phục kích và chờ vật chủ đi qua, thường được gọi là “ambusher”, nó đứng thẳng bằng đuôi theo phương thẳng góc gần bề mặt đất và bám vào khi vật chủ ngang qua Do đó,

S carpocapsae có xu hướng hiệu quả nhất đối với những loài côn trùng di chuyển sát

mặt đất (http://www.nysaes.cornell.edu) Hay như S.glaseri và H bacteriophora chọn

chiến thuật tìm kiếm săn mồi, thường được gọi là “cruiser” Những phương thức tìm kiếm con mồi giữa các loài tuyến trùng có những biến đổi lớn, tùy vào những hoàn cảnh khác nhau trong quá trình tình kiếm vật chủ Chẳng hạn săn mồi kiểu phục kích

như S carpocapsae gây độc cho những côn trùng sống trên mặt đất, trong khi việc săn mồi theo kiểu ngẫu nhiên, bất ngờ giống như H bacteriophora gây độc cho những côn

trùng sống sâu trong đất (trích dẫn Phạm Thị Mến, 2009)

2.4.3 Sự cạnh tranh và tồn tại

Theo Kaya và Koppenhofer (1996), bên trong cơ thể vật chủ, giữa các chủng EPNs luôn diễn ra sự cạnh tranh cùng loài và cạnh tranh khác loài Sự cạnh tranh cùng loài diễn ra khi số lượng IJ xâm nhiễm vào một vật chủ vượt quá nguồn thức ăn có sẵn

Sự cạnh tranh khác loài diễn ra khi các loài khác nhau cạnh tranh để giành nguồn thức

ăn, môi trường sống từ đó làm giảm sự thích nghi cũng như tính đa dạng của các loài tuyến trùng và có thể gây ra sự biến mất của một loài trong vật chủ đó Điều này lí giải

vì sao trong một xác ký chủ không thể tìm thấy cùng lúc 2 giống Steinernematid và Heterorhabditid Theo Grewal và cs (1997), để tránh sự cạnh tranh này, tuyến trùng cảm nhiễm của một số loài có khả năng xem xét loại ký chủ trước khi xâm nhập vào

Những tuyến trùng cảm nhiễm của S carpocapsae bị đẩy lùi bởi những loài xâm nhập

được 24 giờ bằng mùi đặc trưng được tạo bởi vi khuẩn cộng sinh của loài đó (http://en.wikipedia.org)

Bên cạnh đó, sự tồn tại của EPNs còn bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như ẩm độ, nhiệt độ của đất, áp suất thẩm thấu, cơ cấu đất, bức xạ mặt trời và tia tử ngoại (UV) Chẳng hạn như điều kiện độ ẩm đất, đây là yếu tố quyết định khả năng tiếp cận, di chuyển và khả năng xâm nhiễm của tuyến trùng IJs có thể tồn tại trong điều kiện ẩm

độ thấp bằng cách làm giảm quá trình trao đổi chất hoặc bằng cách ở trong xác chết của ký chủ cho đến khi ẩm độ đất được cải thiện Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng tìm kiếm và xâm nhiễm vào vật chủ Cấu trúc đất ảnh hưởng đến sự tồn tại của IJs, đất sét có cấu trúc chặt nên tuyến trùng tồn tại kém do mức oxy trong đất sét ít, khi đất bão hòa hay hàm lượng chất hữu cơ trong đất cao thì oxy trong đất cũng giảm Vì vậy, tính chất vật lý của đất như loại đất thịt pha cát (có độ rỗng và độ tơi xốp) sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho tuyến trùng di chuyển hơn các loại đất có kết cấu chặt như đất sét Tuyến trùng cũng rất nhạy cảm với tia UV Tia UV có thể giết chết tuyến trùng trong khoảng một thời gian ngắn Tia UV ảnh hưởng nhiều nhất khi tuyến trùng được ứng dụng như thuốc trừ sâu sinh học Để giảm tối thiểu ảnh hưởng trực tiếp của tia UV bằng cách đưa IJs ra cánh đồng vào buổi sáng sớm hay buổi chiều tối hoặc tưới nước làm đất ẩm trước khi đưa IJs vào đất (trích dẫn Ngô Thị Thu Hằng, 2009)

2.5 Công nghệ sản xuất EPNs

Các công nghệ nhân nuôi, sản xuất tuyến trùng EPN được nghiên cứu, bổ sung ngày càng hoàn thiện nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng các chế phẩm của EPNs hiện nay Song, để phát triển và nhân nuôi thành công cần phải xem xét nhiều yếu tố, đặt biệt có 3 vấn đề quan trọng: 1) điều kiện và nhân lực đã có cho việc nhân nuôi, sản xuất EPN và khả năng đáp ứng các yêu cầu của mô hình công nghệ lựa chọn; 2) bao nhiêu loại tuyến trùng EPN được yêu cầu nhân nuôi?; 3) loại tuyến trùng chuẩn bị sử dụng cho nhân nuôi đã được bảo quản trong thời gian bao lâu trước khi sử dụng (Nguyễn Ngọc Châu, 2008)

Hiện nay, trên thế giới đã phát triển hai hệ thống công nghệ nhân nuôi sản xuất

tuyến trùng là nhân nuôi in vivo và nhân nuôi in vitro Trong đó, sản xuất theo in vivo thì cần nguồn vật liệu tự nhiên (côn trùng sống làm giá thể), còn công nghệ in vitro

được nhân nuôi bằng vật liệu nhân tạo

2.5.1 Công nghệ nhân nuôi in vivo

Do khả năng xâm nhiễm và sinh sản của các chủng EPNs trong vật chủ côn trùng, đặt biệt là do có phổ kí chủ rộng, nên có thể sử dụng nhiều loại côn trùng để làm vật liệu nhân nuôi, sản xuất tuyến trùng Trong đó ấu trùng bướm sáp lớn

(Galleria mellonella) được coi là vật liệu nhân nuôi lý tưởng nhất, vì chúng khá mẫn

cảm với hầu hết các loài và chủng tuyến trùng EPN

Về cơ bản trong phương pháp này gồm 4 bước chính: i) nhân nuôi sản xuất vật chủ côn trùng; ii) gây nhiễm IJs vào vật chủ và ủ trong vòng 12 – 14 ngày; iii) thu hoạch tuyến trùng bằng phương pháp “ White trap” (bẫy nước); iv) phối chế và bảo quản Cấu trúc bẫy White gồm 1 hộp petri lớn (150 x 25 mm) ở bên ngoài, bên trong là một nắp của hộp petri nhỏ (60 x 15 mm) đặt lật úp xuống, bên trên để một miếng giấy lọc, bìa của giấy được bẻ cong xuống (hình 2.2) Sắp xếp côn trùng đã bị nhiễm tuyến trùng lên trên giấy lọc Sau khi xếp xong, thêm nước vào đĩa petri lớn sao cho mép giấy tiếp xúc với nước và trở nên ẩm Giữ đĩa trong bóng tối Sau 5 – 10 ngày, IJs sẽ bắt đầu phát tán ra khỏi vật chủ và di chuyển vào nước trong đĩa petri Thu hoạch tuyến trùng IJ bằng cách đổ nước có tuyến trùng từ hộp petri vào một chai (flask), chờ cho tuyến trùng lắng xuống đáy, từ từ đổ nước bên trên ra Làm như thế khoảng 3 - 4 lần thì đem tuyến trùng trữ lạnh (http://thnlscantho-2.page.tl)

Tuy nhiên ngoài yếu tố mẫn cảm với vật chủ của EPNs, trọng lượng của côn trùng thì sản lượng IJ thu được còn phụ thuộc vào chủng loài tuyến trùng và mật độ gây nhiễm ban đầu Thông thường sản lượng của loài tuyến trùng tỉ lệ nghịch với kích thước cơ thể Các chủng loài tuyến trùng EPN có kích thước IJ nhỏ như hầu hết các

loài Heterorhabditis thì sản lượng lớn và ngược lại kích thước IJ lớn như ở hầu hết các loài Steinernema thì sản lượng thường nhỏ Công nghệ nhân nuôi in vivo khá đơn

giản, có thể áp dụng cho quy mô sản xuất nhỏ như hộ gia đình, trang trại hay đơn vị sản xuất nhỏ Nhưng công nghệ này có nhược điểm là năng suất thấp, chất lượng không ổn định và đặc biệt tốn nhiều công lao động nên giá thành cao (Nguyễn Ngọc Châu, 2008)

Hình 2.2: Bẫy nước thu IJs từ xác chết côn trùng (theo Khuong B Nguyen, 2005)

2.5.2 Công nghệ nhân nuôi in vitro

Công nghệ in vivo chỉ thích hợp trong sản xuất nhỏ hay quy mô phòng thí

nghiệm nên khó có thể đáp ứng nhu cầu thương mại hóa chế phẩm tuyến trùng Vì vậy

công nghệ nhân nuôi in vitro chính là chìa khóa khắc phục những hạn chế trong sản xuất in vivo Quy trình sản xuất chế phẩm sinh học tuyến trùng gồm 5 giai đoạn chủ yếu:

i) phân lập vi khuẩn cộng sinh (VKCS) từ xoang máu của ấu trùng bướm sáp lớn đã gây nhiễm EPN chuyển sang môi trường nhân nuôi sơ cấp để tuyển chọn khuẩn lạc chuẩn (pha I); ii) nhân nuôi thứ cấp VKCS trong môi trường để tạo sinh khối lớn; iii) gây nhiễm EPN vào môi trường nhân tạo đã tạo sinh khối VKCS; iv) nhân ủ tổ hợp

(Nguyễn Ngọc Châu, 2008)

Sự sinh trưởng và phát triển của tuyến trùng EPN ngoài việc phụ thuộc vào yếu

tố dinh dưỡng của môi trường, thì còn bị ảnh hưởng bởi điều kiện nhân nuôi và phát

triển của VKCS (Xenorhabdus spp và Photorhabdus spp.) với chúng Các loài VKCS

này cung cấp thêm protein cho môi trường nhân nuôi, tạo nguồn thức ăn cho tuyến trùng sử dụng nên góp phần làm tăng sản lượng trong sản xuất sinh khối Vì vậy trước khi chủng tuyến trùng vào môi trường nuôi cấy nên tiến hành gây nhiễm vi khuẩn vào môi trường trước Ủ 2 – 3 ngày ở 250C cho vi khuẩn phát triển rồi mới gây nhiễm

tuyến trùng và nhân nuôi tổ hợp Một môi trường chuẩn để khởi đầu cần chứa nguồn carbon (như đường hoặc glyxerol), một số protein có nguồn gốc động vật hoặc thực vật, dịch chiết men (yeast extract) và nguồn lipid từ động vật hoặc thực vật (Nuchanart, Suebsak và Jariya, 1999) Theo Ehlers (2001) việc cải tiến môi trường và điều chỉnh sao cho phù hợp với từng loài khác nhau sẽ làm tăng sản lượng sản xuất (trích dẫn Phan Thị Hồng Thủy, 2009) Lượng EPNs chủng vào môi trường cũng quyết định năng suất của IJs Heterorhabditid đỏi hỏi lượng chủng tăng gấp 10 lần so với Steinernematid để có được năng suất cao hơn Lượng chủng tối ưu là 107 IJs/chai

và 106 IJs/chai cho Heterorhabditid và Steinernematid (http://books.google.com.vn)

Sản xuất sinh khối của EPNs được mở rộng từ sản xuất môi trường rắn trên quy

mô lớn đầu tiên bởi Glaser và cs (1940) Ông là người đầu tiên phát triển quy trình

nhân nuôi thuần cho S glaseri, và sau đó là S carpocapsae Dutky và cs (1964) chỉ ra

“phức hợp tuyến trùng – vi khuẩn” mà chúng được duy trì trên pepton-glucose agar và thận heo và tìm thấy một môi trường với sự kết hợp vi khuẩn có thể hỗ trợ sinh sản

cho dòng S carpocapsae DD136 Bedding (1984) đã phát triển phương pháp nhân

nuôi môi trường bán đặc qua đó tuyến trùng được nuôi trên protein động vật và lipid trộn với bột xốp polyether polyurethane để tăng diện tích thông khí (Nuchanart, Suebsak và Jariya, 1999) Cuối cùng là phương pháp lên men lỏng trong sản xuất

in vitro của Freidman (1990) Hiện nay, tuyến trùng được nhân nuôi tổ hợp bằng môi

trường rắn được tiến triển bởi Bedding (1981, 1984) hoặc phương pháp lên men lỏng Quy trình nhân nuôi trên môi trường rắn đã sản xuất thành công hai giống steinernematid và heterorhabditid, nhưng chi phí lao động cao làm giới hạn quy mô kinh tế Kĩ thuật này áp dụng ở hầu hết các nước có chi phí lao động rẻ Quy trình lên

men lỏng, có hiệu quả cao cho vài loài Steinernema nhưng không cao cho

Heterorhabdus thì phổ biến ở những nước nền kinh tế công nghiệp

(http://books.google.com.vn)

Hình 2.3: Sơ đồ công nghệ sản xuất in vivo và in vitro chế phẩm EPN

(theo Nguyễn Ngọc Châu, 2008)

2.6 Bảo quản tuyến trùng

Tầm quan trọng của tuyến trùng kí sinh gây bệnh côn trùng ngày càng được biết đến như một tác nhân phòng trừ sinh học Với mục đích cải thiện hiệu quả kiểm soát sinh học, các giống mới đang được phát triển thông qua phương pháp cổ điển hay

VẬT LIỆU BAN ĐẦU

IJSGÂY NHIỄM

G MELLONELLA

Last instar larvae

MÔI TRƯỜNG NHÂN NUÔI

Monoaxenic hoặc axenic

NHÂN Ủ 12 – 14 NGÀY ( IN VIVO )

chuyển gen Những yếu tố như ô nhiễm, mất đi các đặc tính di truyền nguyên thủy hoặc giảm khả năng kiểm soát sâu hại của các chủng mới đã làm cho việc phát triển các phương pháp bảo bảo tuyến trùng trở nên cần thiết

Sau khi thu hoạch và làm sạch, tuyến trùng được phối trộn với các chất giữ ẩm

và giữ lạnh liên tục để duy trì chất lượng của chúng trong thời gian dài Tùy thuộc vào

loài tuyến trùng mà nhiệt độ bảo quản khác nhau Như các chủng Steinernema có thể

được bảo quản tốt nhất ở nhiệt độ 4 – 100C trong 6 – 12 tháng mà không mất đi hoạt

tính Còn các chủng Heterorhabditis thường không để lâu được như vậy, chỉ từ 2 – 4

tháng ở 4 – 100C (Nguyễn Ngọc Châu, 2008)

Bảo quản lạnh trong nitơ lỏng đã được chứng minh như là một phương pháp bảo quản lâu dài cho EPNs Bảo quản trong nitơ lỏng có thể cản trở (chứ không ngăn chặn) thay đổi hay mất các đặc tính có lợi xảy ra trong quá trình cấy chuyền Việc bảo quản lạnh của tuyến trùng trong ni tơ lỏng được hoàn thành nhờ vào quá trình xử lý ngâm ủ trong chất chống đông (làm giảm tối thiểu sự hình thành tinh thể trong nội bào

và gian bào), được điều chỉnh một cách chính xác quy trình làm đông và tan đông (trích dẫn Bai và cs, 2004) Quy trình xử lý đông lạnh tuyến trùng của Curran và cs (1992); Nurgent và cs (1996) như sau: i) Xử lý ngâm ủ tuyến trùng trước đông lạnh trong glycerol: lấy một phần (10 – 100 ml) glycerol + một phần tương tự dung dịch Ringer chứa tuyến trùng, trộn đều và đổ ra một đĩa petri, để ở nhiệt độ phòng (230C) trong 24, 48 hoặc 72 giờ; ii) Tách tuyến trùng EPN khỏi glycerol: bằng cách lọc qua giấy lọc Whatman số 42 nhờ thiết bị hút chân không; iii) Rửa glycerol bằng methanol: dùng bình rửa có sẵn methanol 70 % đã được làm lạnh (-100C) để chuyển tuyến trùng vào týp 15 ml và để trong hộp đá 10 phút Sau 5 phút lắc đều ống týp và để tiếp 5 phút

để tuyến trùng lắng đọng xuống đáy týp; iv) Chuyển tuyến trùng vào bình ni tơ lỏng: tiếp tục lọc qua máy hút chân không và được rữa bằng methanol 70 % đã được làm lạnh Giấy lọc chứa IJs được cuộn lại và đặt vào ống týp đông lạnh 2 ml (đáy tròn, nắp roăng cao su) đã được làm lạnh sẵn ở -50C trong dung dịch muối NaCl, ghi số, tên chủng và sắp xếp các týp trong một hộp đông lạnh, rồi đặt nhanh cả hộp vào bình ni tơ lỏng (Nguyễn Ngọc Châu, 2008)

Theo kết quả nghiên cứu của Nomakholwa Faith Stokwe (2009), đã thành công

cho việc bảo quản lạnh IJs của Steinerneme khoisanae và Heterorhabditis zealandica

Với một chất chống đông, tuyến trùng được ủ trong glycerol 15 %, dimethyl sulfoxide

8 % hoặc ethylence glycol 8 % với thời gian ủ khác nhau, sau đó rửa bằng methanol 70%, trước khi đưa vào ni tơ lỏng Tỷ lệ sống sót của tuyến trùng bị ảnh hưởng đáng

kế bởi việc kéo dài giai đoạn xử lý ngâm ủ trong các chất chống đông khác nhau, trước khi ngâm chúng vào ni tơ lỏng Tỷ lệ sống sót trung bình cao nhất đối với

Steinerneme khoisanae là 69 % và 78 % cho Heterorhabditis zealandica sau khi ủ với

glycerol 15 % trong 4 ngày Sau 42 ngày bảo quản trong ni tơ lỏng, tuyến trùng có thể

xâm nhiễm thành công ấu trùng Galleria mellonella và hoàn thành vòng đời của nó

Ngoài phương pháp giữ lạnh tuyến trùng trong ni tơ lỏng, đã có nhiều nghiên cứu nhằm cải tiến quy trình bảo quản tuyến trùng Để cải thiện thời hạn sử dụng và tính chịu nhiệt thấp của tuyến trùng, những quy trình mới làm giảm sự trao đổi chất của IJs bằng kĩ thuật cố định hoặc giữ IJs ở tình trạng khô để tuyến trùng không hoạt động đã được phát triển Gồm có bảo quản trong than hoạt tính, chất tạo hình, alginate, vermicute, polyacrylamide và water dispersible granule Điều khó để đạt được công thức tối ưu cho tất cả các loài tuyến trùng là do chúng có yêu cầu khác nhau về ẩm độ

và lượng oxy Một trong những công thức tốt nhất là water dispersible granule được

phát triển cho giống steinernematid (như S carpocapsae và S feltiae), kết hợp kéo dài

thời gian bảo quản mà không cần giữ lạnh nhưng lại dễ dàng cho việc đóng gói và vận chuyển IJs được làm khô một phần trong water dispersible granule có thời hạn sử

dụng 5 – 6 tháng đối với S carpocapsae, 2 tháng cho S feltiae và 1 tháng cho

S riobrave ở 250C (Hazir và cs, 2004)

2.7 Tình hình nghiên cứu về EPNs trên thế giới

Hơn 800 năm về trước, tại Trung Quốc đã có tài liệu ghi lại những hiện tượng côn trùng gây bệnh bị trùng giết hại Một trong những ghi chép cổ (Gaoyou Zhouzhi)

có chép lại rằng " Năm 1196, hàng loạt châu chấu bị chết Có một loài sâu đã ăn hết não của chúng." Về sau, các nhà khoa học đã biết được, châu chấu, một loài côn trùng

có hại đã bị một loài tuyến trùng tiêu diệt Hiện nay, trên thế giới, ngày càng có nhiều các nghiên cứu về tuyến trùng ký sinh (http://vietbao.vn)

Trong nhiều thập kỷ chỉ có một giống của tuyến trùng kí sinh gây bệnh côn

trùng được Heterorhabditids Poinar, 1976 và thêm hai thập kỷ nửa trôi qua trước khi loài Neosteinernema Nguyen và Smart, 1994 được đưa ra (David J Hunt, 2007)

Theo điều tra của Constant và cs (1998) về sự xuất hiện của EPNs ở Guadeloupe đã ghi nhận: chủng Heterorhabditid thì phổ biến hơn Steinernematid

(lần lượt 97 % và 3 %) Trong đó có 2 loài Heterorhabditis được tìm thấy là H indica (88 %) và H bacteriophora (12 %) Loài Steinernema tìm được có thể là loài mới

đang được nghiên cứu Và các loài tuyến trùng này xuất hiện ở vùng biển (91,4 %), vùng đất thấp nhiệt đới (5,7 %) và vùng trung du (2,9 %) Không loài tuyến trùng nào được tìm thấy ở vùng núi Một điều tra khác về EPNs đã được thực hiện trên rừng gỗ sồi ở 4 vùng núi là Santa Rita, Santa Catalina, Pinaleno và Chiricahuas ở Tây Nam Arizona Trong 120 mẫu đất có 23,3 % mẫu có EPNs Trong số mẫu có EPNs thì có

tới 78,5 % mẫu thuộc loài Steinernema spp và 21,5 % là Heterorhabditis spp Kết hợp

cả phương pháp truyền thống là dựa vào đặc điểm hình thái cũng như phương pháp

phân tử để xác định tính đa dạng của những loài EPNs này Hai loài là S oregonense

và S riobrave đã được ghi nhận lần đầu tiên ở Arizona, thêm vào đó 3 loài

Steinernema và 3 loài Heterorhabditis spp không được mô tả trước đây cũng được

như: Allantone - matidae, Diplogasteridae, Heterorhabditidae, Mermithidae,

Neotylenchidae, Rhabditidae, Sphaerulariidae, Steinernematidae, và Tetradonematidae Những loài trùng ký sinh này có thể giết hại, làm mất khả năng

sinh sản hay làm biến đổi sự phát triển của vật chủ (sâu bệnh) (http://vietbao.vn) Vào

năm 1985, loài tuyến trùng giống Steinernema, một loài tuyến trùng ký sinh trên dế dũi (Gryllotalpa unispina), được mua từ Uruguay về Florida Loài tuyến trùng này được mô tả là một loài mới, Steinernematid scapterisci (Nguyen và Smart, 1990), xuất

hiện và trở thành yếu tố chủ yếu kìm hãm sự gia tăng loài dế dũi

(Gryllotalpa unispina) ở Nam Mỹ (http://entnemdept.ufl.edu)

Spodoptera litura Fabricius là loài côn trùng gây hại của vùng cận nhiệt đới

được tìm thấy ở Hàn Quốc, Nhật và Trung Quốc, gây hại cây họ đậu, họ thập tự và những cây trồng có giá trị kinh tế Park và cs (2001) đã thử nghiệm dùng EPNs

(Steinernema spp và Heterorhabditis spp.) chống lại Spodoptera litura Fabricius Kết quả cho thấy H bacteriophora HY cho tỷ lệ tử vong 100% sau 20 giờ xâm nhiễm đối với sâu khoang tuổi 2 Trong trường hợp tuổi 3 – 4, S carpocapsae PC,

H bacteriophora HY và S monticola CR đã cho tỷ lệ tử vong 100% sau 47 giờ xâm

nhiễm Trong trường hợp tuổi 5 – 6, S carpocapsae PC có hiệu quẩ cao hơn những

loài khác

Hypothenemus hampei Ferrari (Coleoptera: Scotylidae) là sâu hại chính của hạt

cà phê ở Brazil và các nước Nam Mĩ khác Việc phun tuyến trùng trên quả rụng có thể giảm bớt việc thu dọn, để mặc chúng tạo thành lớp màng Sự phát tán của các trưởng thành bị nhiễm có thể đưa tuyến trùng vào quần thể sâu hại Theo Waterhouse (1998)

chỉ có một ghi nhận về tuyến trùng tấn công H hampei trong điều kiện ngoài đồng ở

Ấn Độ, nhưng trong điều kiện phòng thí nghiệm, Alland và Moore (1989) đã đưa ra

loài Heterorhabditis spp có thể gây tỷ lệ chết cao cho cả trưởng thành và ấu trùng, và

ấu trùng xâm nhiễm được sản xuất từ trưởng thành và ấu trùng lớn Castillo và Marban-Mendoza (1996) đã trình bày điểm khác biệt sự tấn công của tám dòng tuyến

trùng đến ấu trùng H hampei và tìm được 3 dòng Heterorhabditis sp và một loài S

carpocapsae gây tỷ lệ chết cao ở ấu trùng

Vài loài sâu của ngài đêm như Agrotis spp., Spodoptera frugiperda, S exigua,

S litorallis gây ra những vấn đề quan trọng trong nông nghiệp, rau và các cây trồng

làm thức ăn cho gia súc, trên toàn thế giới Sâu ngài đêm nhạy cảm với một số giống

và loài EPN Kiểm soát Agrotis segetum bằng S feltiae trên rau diếp thì cũng tương đương với Endosulfan, dưới điều kiện ngoài đồng A ipsilon đã được quản lý hiệu quả với S carpocapsae trên sân gôn Ấu trùng và nhộng của sâu xám rất nhạy cảm với

EPN, và có thể được quản lý hiệu quả bằng tuyến trùng Richter và Fuxa (1990) đã ghi

nhận được tỷ lệ bị tấn công của S frugiperda bởi S carpocapsae trên ruộng ngô là

ở Quảng Đông và Bắc Kinh (trích dẫn Ngô Thị Thu Hằng, 2009)

2.8 Tình hình nghiên cứu về EPNs ở Việt Nam

Nghiên cứu tuyến trùng EPN ở Việt Nam đã được triển khai từ năm 1997 cho đến nay Tuy các nghiên cứu về tuyến trùng EPN ở Việt Nam chưa lâu nhưng đến nay

đã đạt được một số thành tựu cả về mặc nghiên cứu và ứng dụng nhóm tuyến trùng quan trọng này trong điều kiện Việt Nam

Tính từ năm 1997 đến nay, ở Việt Nam đã phân lập được 64 chủng tuyến trùng

EPN, trong đó có 15 chủng Heterorhabditis và 49 chủng Steinernema Trong đó đã xác định được 26 loài tuyến trùng, gồm có 24 loài thuộc giống Steinernema và 2 loài thuộc giống Heterorhabditis Trong 26 loài này có 9 loài thuộc giống Steinernema và hai loài thuộc giống Heterorhabditis đã được mô tả và công bố chính thức Như vậy

còn 15 loài chưa được công bố chính thức (Nguyễn Ngọc Châu, 2008)

Nhóm thiên địch này ở nước ta đến nay chỉ tìm thấy ở hệ sinh thái rừng tự nhiên và một vài chủng ở bãi cát ven biển, không tìm thấy ở hệ sinh thái nông nghiệp Các chủng này đang được bảo tồn và tuyển chọn các chủng đạt yêu cầu cho sản xuất thuốc sinh học tuyến trùng Các chủng được tuyển chọn làm vật liệu cho sản xuất thuốc sinh học tuyến trùng phải đạt các chỉ tiêu cơ bản: Sinh khối lớn trong nhân nuôi

invi tro, liều LC50 < 100 IJs, thời gian bảo quản ở nhiệt độ 18 – 200C > 60ngày

Cho đến nay ở Việt Nam còn chưa có một quy trình công nghệ nào hoàn chỉnh

để sản xuất các chế phẩm sinh học phòng trừ sâu hại, do đó chất lượng chế phẩm thấp

và không ổn định, hiệu quả phòng chống dịch hại chưa cao Quy trình sản xuất các chế

phẩm sinh học EPN bằng in vivo trên cơ sở vật liệu nhân nuôi là sâu tuổi 5 (Last instar larvae) của bướm sáp lớn (Galleria mellonella)

Từ năm 1999 – 2000, Viện Sinh Thái và Tài Nguyên Môi Trường đã chuyển giao cho sở nông nghiệp Ninh Thuận một pilot sản xuất chế phẩm EPN theo quy trình

in vivo phục vụ cho phòng trừ sâu hại nho, đã có kết quả bước đầu tốt Quy trình này

thích hợp cho quy mô sản xuất nông nghiệp nhỏ ở nước ta, có thể chuyển giao đến từng hộ xã viên

Đến nay Viện đã nghiên cứu thành công quy trình công nghệ in vitro trên môi trường đặc (chicken offal) và đang tiếp tục nghiên cứu cải tiến sản xuất trên các môi

trường mà nguyên liệu chủ yếu là các phụ phế phẩm lò mổ gia súc để giảm giá thành

sản phẩm Quy trình sản xuất in vitro yêu cầu đầu tư lớn hơn, có thể sản xuất

2500 – 3000 lit chế phẩm trong một năm có thể phòng trừ sinh học cho hàng trăm ha (http://www.dostbinhdinh.org.vn)

Các chế phẩm sinh học tuyến trùng được phát triển trên cơ sở 7 chủng tuyến trùng EPNs được đánh giá và tuyển chọn, đáp ứng được các tiêu chuẩn của thuốc sinh học tuyến trùng Trong số này có 6 chủng tuyến trùng bản địa và 1 chủng nhập nội Các chủng này đã được đưa vào sản xuất thử nghiệm quy mô lớn Trong số các chế phẩm sinh học tuyến trùng, có 5 chế phẩm được sản xuất từ 5 chủng tuyến trùng của

giống Steinernema được đặt tên là Biostar, từ Biostar – 1 đến Biostar – 5 và hai chế

phẩm sinh học còn lại được sản xuất từ 2 chủng tuyến trùng thuộc giống

Heterorhabditis (cùng loài H indica) được mang tên là NEMASTAR – 1 và

NEMASTAR – 2 Các chế phẩm Biostar và NEMASTAR đáp ứng được tiêu chuẩn của thuốc sinh học tuyến trùng như: Có phổ diệt sâu rộng có khả năng sinh sản tốt và

cho sinh khối cao, có thể sản xuất sinh khối lớn bằng công nghệ in vitro và in vivo, có

khả năng bảo quản lâu (từ 2 – 6 tháng) trong điều kiện bình thường, không cần bảo quản lạnh Đây là ưu thế của các chủng EPNs bản địa của Việt Nam (Nguyễn Ngọc Châu, 2008)

Kết quả thử nghiệm cho thấy những chế phẩm này có thể diệt được gần 30 loài sâu hại khác nhau Thử nghiệm trên quy mô 1 – 2 ha cho thấy các chế phẩm diệt được sâu keo da láng hại nho ở Ninh Thuận (tỷ lệ sâu chết là 70 %), sâu xám hại thuốc lá ở

Ba Vì (85 – 90 %), bọ hung đen hai mía ở Thanh Hoá (50 – 65 %) Hiện chúng tôi đã chuyển giao công nghệ sản xuất cho Ninh Thuận ở quy mô một xưởng sản xuất nhỏ và tiếp tục chuyển gia cho một số nơi khác (http://www.vietlinh.vn)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành từ ngày 02/2010 đến 06/2010 Tại: Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Học; Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, trường Đại Học Nông Lâm TP HCM; Vườn rau xã Tân Phú Trung, Củ Chi,

3.2.2 Vật liệu nghiên cứu

Nhộng sâu xanh (Helicoverpa armigera), que đánh dấu, chỉ buộc nhộng, kéo,

dao lọ nhỏ, đĩa petri, giấy thấm, panh gắp, nước cất, hộp nhựa, kính lúp soi nổi

3.2.3 Các bước tiến hành

Sử dụng nhộng sâu xanh làm mồi bẫy tuyến trùng, nhộng dùng để đặt bẫy được lấy ở 2 ngày sau khi sâu hóa nhộng để đảm bảo nhộng không bị vũ hóa khi lấy mẫu Chọn liếp rau (cải ngọt) thí nghiệm mà cây rau còn nhỏ để đảm bảo những ngày lấy nhộng cây rau không quá lớn gây khó khăn cho việc lấy mẫu Kích thướt liếp rau xà lách đặt nhộng thí nghiệm: 1,5 x 7 m Số nhộng đặt trên mỗi liếp = 30 con nhộng/liếp mỗi hàng rau theo chiều ngang đặt 2 que đánh dấu, các que trên các hàng được đặt so

le nhau, mỗi que đánh dấu là 1 điểm đặt nhộng, mỗi điểm cách que đánh dấu khoảng

10 cm Tiến hành đặt ngẫu nhiên trên 3 liếp rau, tổng nhộng thí nghiêm là 90 con

Trước khi đặt bẫy nhộng được buộc 2 vòng chỉ, buộc ở vị trí 1/3 chiều dài cơ thể nhộng tính từ đầu trở xuống, buộc chỉ vừa khít với cơ thể nhộng để đảm bảo nhộng

Hình 3.1: Liếp rau cải ngọt đặt bẫy và cách đặt bẫy tại Củ Chi

A) Cách đặt bẫy; B) Liếp rau đặt

3.2.4 Xử lý mẫu số liệu

Sau khi mang mẫu về kiểm tra mỗi con nhộng có dấu hiệu bị EPNs ký sinh dưới kính lúp soi nổi Tính phần trăm số nhộng bị ký sinh tại vùng điều tra theo công thức:

NBKS (%)= số NBKS + số NS + số NVH (nếu có) x 100số NBKS

Trong đó: NBKS: nhộng bị ký sinh; NS: nhộng sống; NVH: nhộng vũ hóa

Nhộng bị ký sinh được đặt vào đĩa petri 90 mm đã lót giấy lọc, tưới nước đủ

ẩm, cho thêm nhộng làm thức ăn để giữ nguồn, đặt các đĩa petri này vào túi nilon cột kín nắp giữ ở nhiệt độ phòng Chăm sóc mỗi ngày, cung cấp thêm nước cất khi thấy hơi khô, khi lượng tuyến trùng sinh sôi trong đĩa nhiều thì tiến hành tách ra nhiều đĩa, thay giấy lọc khi thấy giấy dơ

3.3 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nhân nuôi đến sự sinh sản của tuyến trùng kí sinh gây bệnh côn trùng

3.3.1 Thời gian và địa điểm

Thí nghiệm đã được tiến hành từ ngày 18/03/2010 đến ngày 07/04/2010 Tại phòng nuôi sâu, phòng thí nghiệm Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, Trường ĐHNL TP HCM

3.3.2 Vật liệu thí nghiệm

Dung dịch có chứa EPNs, đĩa petri 60 mm, giấy bạc, dây thun, môi trường nuôi cấy, pipet, cốc thủy tinh 50 ml, ray lọc tuyến trùng

Một số dụng cụ cần thiết khác: cân điện tử, các lọai cốc đong, ống đong, dụng

cụ vệ sinh (xà bông, cồn), nhiệt kế, ẩm kế, nồi hấp autoclave

3.3.3 Phương pháp khử trùng tuyến trùng

Phương pháp thu tuyến trùng cái: lọc tuyến trùng từ xác nhộng Để đảm bảo dung dịch tuyến trùng không bị tạp nhiễm trước khi chủng vào môi trường nhân nuôi nên khử trùng nhộng trong dung dịch mặn (1 % NaCl) khoảng 10 – 15 phút, tiến hành lọc tuyến trùng và rửa lại bằng nước cất đã tiệt trùng 2 – 3 lần Nhỏ một giọt dung dịch EPNs lên mặt kính đồng hồ, để dưới kính lúp soi nổi, dùng que mãnh vớt những con đực loại bỏ

3.3.4 Phân biệt tuyến trùng đực và cái

Theo kết quả nghiên cứu của Ngô Thị Thu Hằng (2009) đã xác định tuyến trùng

kí sinh gây bệnh côn trùng bẫy được ở vùng rau Củ Chi thuộc giống heterorhabditid,

với hai loài được phân biệt là Heterorhabditis sp.1 và Heterorhabditis sp.2

Dựa trên mô tả về của Ngô Thị Thu Hằng có thể phân biệt đực, cái trên các đặc điểm sau: phần thân giữa (hay gần giữa) của cá thể cái hơi thắc lại (ngay vị trí lỗ đẻ của tuyến trùng cái); có phần đuôi nhọn so với các đực

Hình 3.2: Các bộ phân của tuyến trùng cái giống heterorhabditid

A: phần thân giữa; B: phần đuôi

Hình 3.3: Bộ phận đuôi của tuyến trùng đực giống heterorhabditid

(Nguồn: Ngô Thị Thu Hằng, 2009)