PCR Được phát minh bởi Kary Mullis Là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại một gen hay một đoạn DNA. Ứng dụng : nghiên cứu sinh học và y học như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene và xác định huyết thống…
PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) NGUYỄN HƯNG PCR • Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Karl Mullis cộng phát minh năm 1985 Thực chất phương pháp tạo dòng in vitro khơng cần diện tế bào • Ngày nay, PCR dùng phổ biến lĩnh vực sinh học Thành phần phản ứng PCR Primer (mồi) DNA mẫu MgCl2 dNTP Enzyme Thành phần khác Enzyme dùng phản ứng PCR Có nhiều enzym khác chọn tùy mục đích sử dụng: Taq DNA polymerase (Thermus aquaticus) Stoffel DNA polymerase Vent/DeepVent DNA polymerase (Thermococcus litoralis) Pfu DNA polymerase (Pyrococcus furiosus) Tth DNA polymerase UITma DNA polymerase Thiết bị dụng cụ cho phản ứng PCR Ống eppendorf “ thành mỏng” đầu típ có phin lọc Chu trình nhiệt phản ứng PCR Chu kỳ Chu kỳ Chu kỳ Chu kỳ ……30 chu kỳ (Thường 40 chu kỳ) Những hạn chế phương pháp PCR Giới hạn kích thước trình tự cần khuếch đại Sai sót DNA polymerase trình tổng hợp Ngoại nhiễm cao Phụ thuộc lớn thao tác Thiết bị đắt tiền MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PCR •RT-PCR •Inverse PCR •Nested PCR/semi nested PCR •Multiplex PCR •AP-PCR •3’/5’ RACE PCR •In situ PCR •Real- time PCR •Recombinant PCR RT-PCR Reverse transcriptase ( Enzyme phiên mã ngược) Enzyme sử dụng phổ biến nhất: AMV- RT ( Avian Myeloblastosis Virus) : bền vững, chịu nhiệt tốt ( -> 55oC MMLV –RT ( Moloney Murin Leukaemia Virus) : hoạt tính RNase H thấp Nested PCR/semi nested PCR Sử dụng cặp mồi “ ngoài” mồi/1 cặp mồi “ trong” để tăng tính đặc hiệu độ nhạy phản ứng PCR Multiplex PCR Sử dụng nhiều cặp mồi phản ứng PCR để phát đồng thời nhiều trình tự DNA tác nhân hay nhiều tác nhân Inverse PCR ( PCR “đảo”) AP-PCR ( Arbitrary Primed PCR)/ RAPD ( Random Amplified polymorphic DNA) Sử dụng tổ hợp primer “ ngẫu nhiên” để xác định “ dấu ấn di truyền” loài 3’/5’ RACE ( Rapid Amplification of cDNA Ends) Nhân hai đầu mút 5’ 3’ trình tự exon với mồi đặc hiệu mồi “chung” In situ PCR Thực phản ứng PCR mô / tế bào In situ PCR In situ RT - PCR Recombinant PCR ( PCR tái tổ hợp) ... đắt tiền MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PCR •RT -PCR •Inverse PCR •Nested PCR/ semi nested PCR •Multiplex PCR •AP -PCR •3’/5’ RACE PCR •In situ PCR •Real- time PCR •Recombinant PCR RT -PCR Reverse transcriptase.. .PCR • Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Karl Mullis cộng phát minh năm 1985 Thực chất phương pháp tạo dòng in vitro khơng cần diện tế bào • Ngày nay, PCR dùng phổ biến... 5’ 3’ trình tự exon với mồi đặc hiệu mồi “chung” In situ PCR Thực phản ứng PCR mô / tế bào In situ PCR In situ RT - PCR Recombinant PCR ( PCR tái tổ hợp)