Chương 5: PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) potx

Nguyên tắc của phương pháp PCR: DNA polymerase thực hiện tổng hợp mạch mới từ DNA mạch khuôn cần sự hiện diện của mồi chuyên biệt.. Mồi: đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với mộ

Chương 5 PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

1 Nguyên tắc của phương pháp PCR:

DNA polymerase thực hiện tổng hợp mạch mới từ DNA mạch khuôn

cần sự hiện diện của mồi chuyên biệt

Mồi: đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của

mạch khuôn

Nhiệt độ nóng chảy của mồi: Tm (ở nhiệt độ này, 50 % DNA mạch đôi

bị tách mạch thành mạch đơn) T m = 4(G + C) + 2(A + T) °C

Nếu cung cấp 2 mồi chuyên biệt (mồi xuôi và mồi ngược) bắt cặp bổ

sung với 2 đầu của một trình tự DNA, DNA polymerase sẽ xúc tác tổng hợp đoạn DNA nằm giữa 2 mồi

2 Phản ứng PCR:

 Thành phần phản ứng:

- DNA bản mẫu

- Mồi xuôi và mồi ngược

- dNTP (gồm 4 loại: dATP, dGTP, dTTP, dCTP)

- MgCl2

- Enzyme polymerase (Taq polymerase, Pfu…)

- Dung dịch đệm.

- Nước cất 2 lần (đã khử trùng)

Các bước của phản ứng:

Là một chuỗi nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

Bước 1: Biến tính (denaturation)

DNA được biến tính ở nhiệt độ cao, thường là 94 – 950C, trong thời gian 30s – 1 phút

Bước 2: Bắt cặp mồi (hybridization)

Nhiệt độ cần cho sự bắt cặp mồi với DNA mạch khuôn là T a

(Ta thấp hơn Tm khoảng 50C)

Bước 3: Kéo dài (elongation)

Nhiệt độ được tăng lên đến 720C, để DNA polymerase hoạt động kéo dài mạch

3 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR

- DNA sạch, lượng DNA sử dụng cho PCR có khuynh hướng giảm

(khoảng 100 ng)

- Giảm lượng mẫu  hạn chế sản phẩm “kí sinh”.

- PCR có thể thực hiện trên các mẫu không được bảo quản tốt.

 Enzyme :

- Enzyme polymerase đầu tiên chịu nhiệt được tách chiết từ

Thermus aquaticus là Taq polymerase.

- Enzyme Pfu DNA polymerase thu nhận từ vi khuẩn Pyroccus furiosus có khả năng chịu nhiệt cao hơn, có hoạt tính 3’-5’ exonuclease.

- Tth polymerase, tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng phiên mã ngược khi có RNA và Mn2+, khi có DNA và Mg2+ thì enzyme này thực hiện khuếch đại DNA.

 Mồi và nhiệt độ lai T a

- Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất, quyết định tính đặc hiệu của phản ứng.

- Khi thiết kế mồi cần chú ý: thành phần GC, khả năng bắt cặp bổ sung giữa “mồi xuôi” và “mồi ngược”, khả năng tạo cấu trúc “kẹp tóc”.

- Tm của 2 mồi không cách biệt quá xa.

- Mồi đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại và không bắt cặp với trình tự khác trên gen.

 Các thành phần khác của phản ứng:

- dNTP: thường sử dụng ở nồng độ là 20 -200 µM đối với mỗi loại.

- Mg 2+ : quá ít  hiệu quả nhân bản giảm

quá nhiều  tạo sản phẩm không đặc hiệu

 Số lượng chu kỳ: không vượt quá 40

4 Ứng dụng của phương pháp PCR

- Tạo số lượng lớn bản sao DNA  dòng hóa gene, giải trình tự, lập bản đồ di truyền, sản xuất mẫu dò…

- Biến đổi một trình tự DNA: thêm vị trí của enzyme cắt hạn chế,

gây tạo đột biến trên DNA, thêm trình tự promoter, trình tự gắn

của ribosome…

5 Hạn chế của phương pháp PCR

- Ngoại nhiễm:

Xử lí: Khử trùng khu vực thao tác

Việc thiết lập phản ứng PCR và phân tích sản phẩm được tiến hành ở các khu vực khác nhau.

- Nhân bản không đặc hiệu:

- Các sai sót do Taq polymerase

5 Các dạng khác của PCR:

- RT –PCR (reverse transcriptase –PCR): RNA  cDNA  DNA

- RT – PCR (Realtime PCR – PCR định lượng): xác định hàm lượng sản phẩm PCR tạo ra ở từng thời điểm

Nguyên tắc: xác định hàm lượng sản phẩm dựa trên tín hiệu huỳnh

quang

- PCR nested: sử dụng nhiều hơn một cặp mồi  thu nhận sản phẩm đặc hiệu hơn.