NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA TINH DẦU CÂY MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour.) Pers.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRỊNH THỊ PHI LY NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA TINH DẦU CÂY MÀNG TANG Litsea cubeba Lour.. BỘ G

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRỊNH THỊ PHI LY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH

SINH HỌC CỦA TINH DẦU CÂY MÀNG TANG

(Litsea cubeba (Lour.) Pers.)

LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

(NGÀNH KHOA HỌC KỸ THUẬT)

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 3/2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRỊNH THỊ PHI LY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH

SINH HỌC CỦA TINH DẦU CÂY MÀNG TANG

(Litsea cubeba (Lour.) Pers.)

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

i

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CỦA TINH DẦU CÂY MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour.) Pers.)

Trường Đại học Nông Lâm TPHCM

3 Phản biện 1: TS VƯƠNG ĐÌNH TUẤN

Phân viện Khoa học Lâm nghiệp Nam Bộ

4 Phản biện 2: TS LÊ QUANG LUÂN

Trung tâm Hạt nhân TPHCM

5 Ủy viên: PGS.TS TRẦN CÔNG LUẬN

Trung tâm Sâm và Dược liệu TPHCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

HIỆU TRƯỞNG

iii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi

Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Ký tên

Trịnh Thị Phi Ly

iv

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến:

Quí Thầy Cô trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tận tâm hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập

Thầy Trần Công Luận đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này

Em Trương Thị Bích Liễu, Trần Thị Quỳnh Diệp và Trần Hiếu Nhân đã tham gia thực hiện đề tài

Phòng Tài nguyên Dược liệu – Viện Dược liệu và công ty cổ phần Y Dược Phẩm Vimedimex đã giúp đỡ chúng tôi trong quá trình thu thập mẫu Màng tang

Bộ môn Vi sinh – Kí sinh, khoa Dược, đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh đã cung cấp chủng vi sinh vật

Các quý Thầy cô của Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường đã

hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Bộ môn Công nghệ Hóa học đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài Quí Nhà trường, Bộ môn Công nghệ Sinh học và Phòng Sau đại học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa học

Gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, chia sẻ và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

v

TÓM TẮT

Đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh

dầu cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) được thực hiện tại Viện nghiên

cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh; Trung tâm Sâm và Dược liệu thành phố Hồ Chí Minh Mục tiêu của đề tài là đánh giá hàm lượng tinh dầu, một số hợp chất chính, hoạt tính chống oxy hóa và kháng vi sinh vật của tinh dầu cây Màng tang thu thập ở Việt Nam

Tinh dầu lá Màng tang dao động trong khoảng lớn từ 0,47% đến 11,85%, mẫu lá thu thập ở rừng phòng hộ Đa Nhim có hàm lượng tinh dầu cao nhất (11,85%) Quả Màng tang chứa hàm lượng tinh dầu khá cao (6,06 – 10,38%) Tinh dầu Màng tang chứa từ 15 đến 25 cấu tử chiếm 93,45 – 99,98% thành phần tinh dầu, các chất chủ yếu là monoterpen, sesquiterpen hiện diện với hàm lượng thấp

Thành phần chính trong tinh dầu lá Màng tang thu thập từ vườn quốc gia Tam Đảo, Cúc Phương và đèo Đá Đẽo là cineol (43,34 – 48,94%) và terpineol (20,49 – 28,15%) Tinh dầu mẫu lá thu thập từ khu vực Tây Nguyên chứa chủ yếu

là sabinen (6,66 – 41,84%) và pinen (11,71 – 18,11%) Quả thu thập ở Quảng Sơn (Đăk Nông) có thành phần chính là citral (45,89%) và citronellal (34,65%) trong khi

đó quả thu thập ở núi Ngọc Linh (Kon Tum) giàu citronellal (70,6%) và limonen (11,7%)

Tinh dầu quả Màng tang có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn tinh dầu lá, cao nhất là quả thu thập ở núi Ngọc Linh với nồng độ ức chế 50% gốc DPPH là 0,89 µl/ml

Tinh dầu Màng tang có khả năng kháng 3 chủng: E coli ATCC 2592 (MIC 1,25 – 10 µl/ml), S aureus ATCC 25923 (MIC 0,25 – 10 µl/ml) và C albicans ATCC 10231 (MIC 0,13 – 1 µl/ml) Trong đó, tinh dầu lá Màng tang kháng E coli ATCC 2592 mạnh hơn quả, tinh dầu quả Màng tang kháng S aureus ATCC 25923

và C albicans ATCC 10231 mạnh hơn lá.

antimicrobial activity of the essential oils of Litsea cubeba (Lour.) Pers collected

from Vietnam

The results showed that the essential oils content of L cubeba leaves were in the wide range of 0.47 – 11.85%, L cubeba leaves from Da Nhim forest (Lam Dong province) had the highest oil content (11.85%) The essential oils content of L cubeba fruits were high (6.06 – 10.38%)

GC-MS analysis of the L cubeba essential oils were resulted in

determination 15 – 25 different compounds, representing 93.45 – 99.98% of total oil The monoterpenes was predominant portion of the essential oils, sesquiterpenes was much lower The major components in the leaf essential oils from Tam Dao (Vinh Phuc province), Cuc Phuong (Ninh Binh province) national park and Da Deo hill (Quang Binh province) included cineole (43.34 – 48.94%) and terpineole (20.49 – 28.15%) Sabinene (6.66 – 41.84%) and pinene (11.71 – 18.11%) were the main compounds in the leaf essential oils from Vietnam highland region The major constituents in the fruit essential oil from Quang Sơn (Đak Nong province) were citral (45.89%) and citronellal (34.65%), while fruit essential oil from Ngoc Linh mountain (Kon Tum province) contained citronellal (70.6%) as the main compound

The antioxidant activity of essential oils from L cubeba fruits was higher than L cubeba leaves, fruit essential oil from Ngoc Linh mountain (Kon Tum

province) was shown the strongest DPPH free-radical scavenging activity (IC50 = 0.89 µl/ml)

vii

Antimicrobial activity of L cubeba essential oil was found on three strains:

E coli ATCC 2592 (MIC 1.25 – 10 µl/ml), S aureus ATCC 25923 (MIC 0.25 – 10 µl/ml) và C albicans ATCC 10231 (MIC 0.13 – 1 µl/ml) Leaf essential oils were the most effective against E coli ATCC 2592, while fruit essential oils exhibited marked against S aureus ATCC 25923 and C albicans ATCC 10231 These results support the notion that L cubeba essential oils may have a role as pharmaceuticals

and preservatives

viii

MỤC LỤC

CHƯƠNG TRANG

Trang tựa

Trang Chuẩn Y i

Lý lịch cá nhân ii

Lời cam đoan iii

Lời cảm ơn iv

Tóm tắt v

Summary vi

Mục lục viii

Danh sách từ viết tắt xi

Danh sách các hình xii

Danh sách các bảng xiii

1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và yêu cầu 2

1.2.1 Mục tiêu 2

1.2.2 Yêu cầu 2

2 TỔNG QUAN 3

2.1 Tổng quan về cây Màng tang 3

2.1.1 Phân loại 3

2.1.2 Đặc điểm sinh học 3

2.1.2.1 Đặc điểm thực vật học 3

2.1.2.2 Điều kiện sinh trưởng và phân bố 4

2.1.3 Công dụng 4

2.2 Tổng quan về tinh dầu 5

2.2.1 Trạng thái tự nhiên và quá trình tích lũy 5

2.2.2 Hoạt tính sinh học 5

ix

2.2.3 Ứng dụng 7

2.2.4 Chiết xuất tinh dầu 8

2.2.4.1 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 8

2.2.4.2 Phương pháp ly trích bằng dung môi dễ bay hơi 9

2.2.4.3 Phương pháp hấp thụ 10

2.2.4.4 Phương pháp ép 11

2.2.4.5 Ly trích dưới sự hỗ trợ của vi sóng 11

2.2.4.6 Phương pháp sử dụng dung môi dioxyt carbon 11

2.2.5 Thành phần hóa học và tính chất hóa lý của tinh dầu 12

2.2.6 Xác định thành phần hóa học 12

2.2.6.1 Sắc ký khí 12

2.2.6.2 Sắc ký khí ghép khối phổ 14

2.3 Tinh dầu Màng tang 14

2.3.1 Tình hình sản xuất 14

2.3.2 Thành phần hóa học tinh dầu Màng tang 15

2.3.3 Hoạt tính sinh học của tinh dầu Màng tang 16

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 18

3.1.1 Thời gian 18

3.1.2 Địa điểm 18

3.2 Vật liệu 18

3.2.1 Mẫu thí nghiệm 18

3.2.2 Chủng vi sinh vật 18

3.2.3 Hóa chất 18

3.2.4 Thiết bị và dụng cụ 19

3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 19

3.3.1 Xác định độ ẩm nguyên liệu 19

3.3.2 Ly trích tinh dầu Màng tang 21

3.3.3 Xác định thành phần tinh dầu 22

3.3.4 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng thử nghiệm DPPH 23

x

3.3.4.1 Nguyên tắc của phương pháp 23

3.3.4.2 Tiến hành 23

3.3.5 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu Màng tang 24

3.3.5.1 Phương pháp khuếch tán trên thạch 25

3.3.5.2 Phương pháp pha loãng 27

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Kết quả thu thập mẫu 29

4.2 Hàm lượng tinh dầu Màng tang 31

4.3 Thành phần hóa học tinh dầu lá Màng tang 33

4.4 Hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu Màng tang 41

4.4.1 Kết quả sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu tinh dầu 41

4.4.2 Kết quả IC50 42

4.5 Hoạt tính kháng khuẩn và nấm của tinh dầu Màng tang 43

4.5.1 Khả năng kháng E coli ATCC 2592 44

4.5.2 Khả năng kháng S aureus ATCC 25923 46

4.5.3 Khả năng kháng C albicans ATCC 10231 48

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51

5.1 Kết luận 51

5.2 Đề nghị 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC 56

DMSO: dimethyl sulfoxide

MIC: nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration) CFU: đơn vị khuẩn lạc (Colony – Forming Unit)

MeOH: methanol

TSA: Tryptic Soy Agar

xii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Lá Màng tang (Thu thập ở Lâm Đồng) 3

Hình 2.2 Sơ đồ hệ thống sắc ký khí 13

Hình 3.1 Bộ dụng cụ xác định độ ẩm 20

Hình 3.2 Hệ thống chưng cất Clevenger 21

Hình 3.3 Phương trình phản ứng bắt gốc tự do DPPH 23

Hình 3.4 Các bước tiến hành phương pháp khuếch tán trên thạch 26

Hình 4.1 Hình ảnh một số mẫu đã thu thập 31

Hình 4.2 Sắc ký đồ phân tích thành phần hóa học tinh dầu lá Màng tang thu thập rừng phòng hộ Đa Nhim (Lâm Đồng) 38

Hình 4.3 Sắc ký đồ phân tích thành phần hóa học tinh dầu lá Màng tang thu thập ở đèo Đá Đẽo (Quảng Bình) 39

Hình 4.4 Sắc ký đồ phân tích thành phần hóa học tinh dầu quả Màng tang thu thập ở núi Ngọc Linh (Kon Tum) 40

Hình 4.5 Hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu quả Màng tang 41

Hình 4.6 Hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu lá Màng tang 42

Hình 4.7 Hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu đối chiếu 42

Hình 4.8 Hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu thử qua giá trị IC50 43

Hình 4.9 Vòng kháng E coli của các mẫu tinh dầu và đối chứng 45

Hình 4.10 Vòng kháng S aureus của các mẫu tinh dầu và đối chứng 48

Hình 4.11 Vòng kháng C albicans của các mẫu tinh dầu 50

Hình 4.12 Kết quả xác định MIC của mẫu thử (Đ) bằng phương pháp pha loãng 50

xiii

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần phản ứng bắt gốc tự do DPPH 24

Bảng 3.2 Thành phần các ống thử nghiệm xác định MIC 28

Bảng 4.1 Thông tin các mẫu đã thu thập 29

Bảng 4.2 Mô tả thực vật các mẫu đã thu thập 30

Bảng 4.3 Hàm lƣợng tinh dầu Màng tang 32

Bảng 4.4 Thành phần hóa học tinh dầu lá và quả Màng tang (%) 34

Bảng 4.5 Thành phần chính của tinh dầu Màng tang 36

Bảng 4.6 Hoạt tính kháng E coli của tinh dầu Màng tang .44

Bảng 4.7 Hoạt tính kháng S aureus của tinh dầu Màng tang 47

Bảng 4.8 Hoạt tính kháng C albicans của tinh dầu Màng tang 49

1

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới có các điều kiện thiên nhiên (nhiệt độ,

độ ẩm, ánh sáng, đất đai thổ nhưỡng, v.v…) thích hợp cho nhiều loài thực vật có giá trị tồn tại và phát triển Trong đó, các loài cây chứa tinh dầu đóng vai trò quan trọng trong đời sống con người Đặc điểm của tinh dầu là có mùi thơm dễ chịu, không gây hại cho môi trường và dễ phân hủy, nhiều loại tinh dầu còn có hoạt sinh học như khả năng chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế tế bào ung thư, v.v Do đó, tinh dầu được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: hương liệu – mỹ phẩm, thực phẩm, y dược và nông nghiệp (Ernest, 1922)

Các cây chứa tinh dầu hiện diện trong gần 300 họ, trong đó có 87 họ có giá

trị kinh tế (Lê Ngọc Thạch, 2003) Màng tang Litsea cubeba (Lour.) Pers thuộc họ

Long não (Lauraceae) đã được biết đến là họ tinh dầu được ứng dụng nhiều trong

công nghệ sản xuất nước hoa và gia vị Ở một số vùng miền núi nước ta, đồng bào dùng cây Màng tang làm thuốc chữa bệnh nhức đầu, đau dạ dày, chữa phong thấp, đau nhức xương,.v.v (Võ Văn Chi, 1997) Một vài nghiên cứu gần đây chứng minh rằng tinh dầu Màng tang có hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm, kháng vi khuẩn, kháng nấm và chống lại một số côn trùng Hơn thế nữa, tinh dầu Màng tang là một nguồn chiết xuất citral rất dồi dào, quả Màng tang dẫn đầu danh sách các nguyên liệu cung cấp citral cho công nghiệp, hàm lượng citral trong tinh dầu thường tới 80% Citral (C10H16O) là một chất thơm, được sử dụng trong kỹ nghệ hương liệu và dùng để tổng hợp vitamin A Ngoài ra, citral còn có khả năng kháng khuẩn mạnh và

có tác dụng dẫn dụ côn trùng (Wang và Liu, 2010)

Trên thế giới, cây Màng tang phân bố giới hạn tập trung ở phía Nam Trung Quốc, Nhật Bản và khu vực Nam Á Ở nước ta, Màng tang phân bố rộng trên các

2

rừng núi cao vùng Tây Bắc, miền Trung và khu vực Tây Nguyên (Võ Văn Chi, 1997), tuy nhiên phần lớn là mọc hoang dại nên việc khai thác, sản xuất và sử dụng còn nhiều hạn chế Những nghiên cứu về cây Màng tang trên thế giới bị giới hạn bởi qui mô và đặc điểm phân bố Ở Việt Nam, nguồn nguyên liệu này chưa được khảo sát, đánh giá và quan tâm đúng mức Cây Màng tang phân bố ở những vùng có điều kiện sinh thái khác nhau thường có hàm lượng tinh dầu, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học khác nhau Hiện nay, ở nước ta chưa có một khảo sát, nghiên cứu nào đầy đủ về tinh dầu Màng tang thu thập từ các vùng miền địa lý khác nhau

Vì những lý do đó, được sự đồng ý của Bộ môn Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Nông Lâm TP HCM, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Trần Công

Luận chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính

sinh học của tinh dầu cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.)” nhằm đánh

giá đặc điểm cũng như tiềm năng của nguồn nguyên liệu này tại một số địa phương

ở Việt Nam để góp phần giải quyết những khó khăn và hạn chế nêu trên

1.2 Mục tiêu và yêu cầu

3

Chương 2 TỔNG QUAN

2.1 Tổng quan về cây Màng tang

2.1.1 Phân loại

Theo Võ Văn Chi (1997), cây Màng tang được phân loại như sau:

Giới: Plantae (Thực vật)

Bộ: Laurales (Long não hay Nguyệt quế)

Họ: Lauraceae (Long não hay Nguyệt quế)

Chi: Litsea (Bời lời)

Loài: Litsea cubeba (Lour.) Pers

Cây Màng tang còn có tên Tất trừng già, Sơn kê tiêu, Giẻ hương, Khương mộc, Đậu xị khương

4

Hoa nhỏ màu vàng nhạt, mọc ở nách lá thành chùm gồm nhiều tán đơn có cuống chung, mỗi tán có 4 – 6 hoa đơn tính Quả mọng hình cầu hoặc hình trứng, khi chín màu đen giống như quả hồ tiêu, mùi rất thơm Hoa có vào từ tháng 1 đến tháng 3, quả từ tháng 4 đến tháng 6 (Võ Văn Chi, 1997)

2.1.2.2 Điều kiện sinh trưởng và phân bố

Cây Màng tang phân bố tự nhiên trong một vùng rộng lớn từ miền đông dãy Himalaya đến miền nam Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Thái Lan, Mianma, Malaysia, Indonesia Ở các tỉnh miền nam Trung Quốc, đảo Đài Loan và Nhật Bản Màng tang được trồng thành những dải rừng gần như thuần loại để tạo nguồn tinh dầu (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2006)

Ở nước ta, Màng tang mọc hoang ở vùng rừng núi cao trong các savan cây bụi như Lào Cai, Hà Giang, Tuyên Quang, Lạng Sơn, Yên Bái, Sơn La, Lai Châu, Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên Huế, Quảng Trị, Gia Lai, Kon Tum, Lâm Đồng, Đăk Nông và Khánh Hòa (Võ Văn Chi, 1997)

2.1.3 Công dụng

Ở một số vùng miền núi nước ta, đồng bào đã dùng cây Màng tang làm thuốc chữa bệnh như: rễ dùng trị ngoại cảm, nhức đầu, đau nhức xương, chữa phong thấp, đau ngang thắt lưng, đắp các chỗ sưng tấy do va đập, đau dạ dày, chữa đầy hơi, sản hậu ứ trệ bụng đau, kinh nguyện không đều Lá Màng tang dùng để trị rắn cắn, chữa viêm da có mủ, mụn nhọt và sưng vú…Quả Màng tang dùng chữa các bệnh về tiêu hóa như đau dạ dày, đầy bụng, khó tiêu Ở nhiều nước Đông Nam Á người ta còn dùng các bộ phận khác nhau của cây để chữa rất nhiều thứ bệnh (Võ Văn Chi, 1997)

Ở một số địa phương Java, quả Màng tang được dùng ăn tươi như một loại rau hoặc gia vị thay hạt tiêu Hoa Màng tang có thể dùng ướp chè Ở Trung Quốc cây Màng tang được trồng để chắn gió cho các nương chè Lá Màng tang có thể dùng làm thức ăn cho dê và một số gia súc (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2006)

5

Màng tang được tìm thấy ở Thái Lan, tất cả các bộ phận của Màng tang được

sử dụng làm thuốc, có thể trị liệt, chống co thắt, lợi tiểu và chữa các bệnh dạ dày (Liu và ctv, 2007)

2.2 Tổng quan về tinh dầu

2.2.1 Trạng thái tự nhiên và quá trình tích lũy

Tinh dầu là một hỗn hợp nhiều chất dễ bay hơi, có mùi đặc trưng tùy thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu cung cấp tinh dầu Tinh dầu phần lớn có nguồn gốc từ thực vật, chỉ có một số ít có nguồn gốc từ động vật (cầy hương, chồn hôi), thường ở thể lỏng ở nhiệt độ phòng, bay hơi hoàn toàn mà không bị phân hủy

Trong thiên nhiên, rất nhiều tinh dầu ở trạng thái tự do, chỉ có một số ít ở trạng thái tiềm tàng Ở trạng thái tiềm tàng, tinh dầu không có sẵn trong nguyên liệu

mà chỉ xuất hiện trong những điều kiện nhất định trước khi tiến hành ly trích, ví dụ như để lên men trong trường hợp điều chế tinh dầu thiên niên kiện, tinh dầu hạt cải

bẹ xanh Còn ở trạng thái tự do, tinh dầu hiện diện sẵn trong nguyên liệu có thể thu trực tiếp dưới những điều kiện ly trích bình thường (Lê Ngọc Thạch, 2003)

Trong thực vật, tinh dầu được tạo ra và tích lũy trong các mô Hình dạng các

mô này thay đổi tùy theo vị trí của chúng trong cây Những mô này có thể hiện diện

ở tất cả các bộ phận của cây như: rễ, thân, lá, hoa và quả Tinh dầu ở mỗi bộ phận trên cùng một cây có thể giống nhau hoặc khác nhau về hàm lượng tinh dầu và thành phần hóa học Đôi khi chỉ có một bộ phận trong cây chứa tinh dầu mà thôi Ví

dụ tinh dầu Hương bài (Vertiveria zizanoides) chỉ có trong rễ cây, cây Hồ tiêu (Piper nigrum L.) tinh dầu chủ yếu trong vỏ trái, tinh dầu Thảo quả tìm thấy có ở

trong hạt

2.2.2 Hoạt tính sinh học

Thời xưa người ta đã biết dùng tinh dầu để chữa bệnh cho người và gia súc hoặc dùng để ngăn chặn sự hư hỏng của thức ăn Trong khảo cổ, người ta nhận thấy

tinh dầu được sử dụng trong việc bảo quản các xác ướp

Ở Trung Quốc, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng tinh dầu tỏi ức chế sự peroxid hóa lipid, một số tinh dầu khác cũng có hoạt tính chống oxy hóa Các tinh

6

dầu này đều chứa dẫn xuất phenol, những hợp chất này bắt lấy gốc tự do không cho phản ứng peroxid hóa xảy ra, bảo vệ các lipid Những tinh dầu có chứa các dẫn xuất phenol như Hương nhu, Đinh hương, Húng, Cỏ xạ hương,…ngoài khả năng chống oxy hóa trong thực phẩm, còn có khả năng tiêu diệt vi khuẩn cao hơn các tinh dầu phi phenol khác (Lê Ngọc Thạch, 2003)

Tinh dầu Nhục đậu khấu có chứa limonen ức chế rất hiệu quả vi khuẩn

Propionbacterium acne Vi khuẩn này gây bệnh viêm cơ, các vết phát ban màu

xanh lợt đỏ thấy trên da đầu, bàn tay dẫn đến sưng nặng kết hợp bệnh ung thư bên

trong Tinh dầu Limnophila gratissima có khả năng kháng khuẩn mạnh tương tự như streptomycin và chloramphenicol đối với một số vi khuẩn như Bacillus cereus, Echerichia coli, Staphylococcus aureus và Pseudomonas aerugenosa (Lê Ngọc

Thạch, 2003)

Theo nghiên cứu của nhiểu tác giả, các hợp chất cấu hình cis có hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn cấu hình trans và nhóm định chức hydroxy trong alcol và phenol là những nhóm có hoạt tính kháng khuẩn quan trọng Ngoài ra, trong một số báo cáo vào năm 2003 cho thấy tinh dầu có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư hoặc

có hoạt tính kháng HIV trong điều kiện in vitro (Lê Ngọc Thạch, 2003)

Tinh dầu cũng có hoạt tính diệt nấm, hoạt tính này đôi khi được nghiên cứu chung với hoạt tính kháng khuẩn và được gọi chung là hoạt tính kháng vi sinh vật Tinh dầu có hoạt tính diệt nấm ngay ở nồng độ rất thấp Ví dụ tinh dầu Kinh giới

tây (Elsholtzia cristat) với nồng độ 1 – 10 µl/ml đã làm giảm sự phát triển của 5 loài nấm sợi nhỏ (Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceus, Aspergillus parasiticus và Trichoderma viride) 89% so với mẫu đối chứng Tinh

dầu Sả chanh, ức chế hoàn toàn sự phát triển của hầu hết các loại nấm, chống lại

nấm gây độc và làm hư thối thức ăn Tinh dầu Húng quế (Ocimum basilicum) có thể

ức chế được sự phát triển của 22 loài nấm độc, ở nồng độ 0,15% (Lê Ngọc Thạch, 2003)

Một số tinh dầu có hoạt tính diệt côn trùng, biểu hiện dưới nhiều dạng: dẫn

dụ côn trùng đến và sa vào bẫy, tiêu diệt trực tiếp như một chất độc đối với côn

độ an toàn thực phẩm, đồng thời cũng mong muốn sử dụng các loại thực phẩm tự nhiên Tinh dầu đã và đang được các nhà khoa học khuyến khích đưa vào các loại thực phẩm để hạn chế những nguy hại do vi sinh vật cũng như sự oxy hóa gây ra

Tinh dầu là loại dược phẩm được sử dụng nhiều nhất trong các y học cổ truyền Nhờ có chứa tinh dầu mà một số thảo dược có mùi thơm đặc trưng Tinh dầu

có nhiều tác dụng khác nhau Có loại tác dụng lên hệ thần kinh trung ương, có loại kích thích dịch tiêu hóa Người ta dùng dung dịch ethanol – nước ngâm với các vị thuốc có tinh dầu để xoa chống bệnh thấp khớp Chúng tác dụng bằng cách tăng sự dồn máu tại các vùng xử lý Một số loại tinh dầu như tinh dầu Râu mèo kích thích

sự tiết nước tiểu, người ta dùng để trị bệnh phù thủng Mỗi tinh dầu có thành phần hóa học và cấu phần chính khác nhau nên có khả năng trị bệnh khác nhau

Tinh dầu Bạc hà có hàm lượng menthol cao Menthol có tác dụng kích thích ngọn dây thần kinh gây cảm giác lạnh, giảm đau tại chỗ Tinh dầu Hương nhu là nguồn cung cấp eugenol Trong y học, eugenol dùng làm thuốc sát trùng, thuốc giảm đau, chất để trám răng tạm thời Tinh dầu Tỏi có tác dụng giảm cholesterol toàn phần và tự do, ngoài ra còn dùng để trị ho có đờm, ăn Tỏi thường xuyên có thể ngừa được bệnh ung thư Tinh dầu Tràm trà có hàm lượng terpinen-4-ol khá cao có thể dùng để chữa nhức mỏi, đau đầu, cảm lạnh Ngoài ra, Tràm trà còn dùng làm thuốc trừ sâu và mỹ phẩm Việc nghiên cứu khả năng trị bệnh của tinh dầu vẫn đang được quan tâm nghiên cứu (Lê Ngọc Thạch, 2003)

Nhiều sản phẩm thiên nhiên có nguồn gốc thực vật có thể dùng như thuốc trừ sâu hoặc thuốc kiềm hãm sự phát triển của sâu bọ đã được biết đến Ngày nay người

ta thường có xu hướng sử dụng các thuốc trừ sâu có độc tính thấp đối với con

8

người, vật nuôi và nhanh chóng bị phân hủy sau khi sử dụng nên những thuốc sát trùng có nguồn gốc thực vật như tinh dầu đang được lưu tâm nghiên cứu sử dụng

2.2.4 Chiết xuất tinh dầu

Tùy thuộc vào tính chất nguyên liệu và các tính chất của tinh dầu mà sử dụng

các phương pháp tách chiết khác nhau Dù bằng phương pháp nào người ta phải dựa

vào một số tính chất quan trọng của tinh dầu như:

- Tính bay hơi của tinh dầu

- Tính hòa tan trong trong hơi nước của tinh dầu

- Tính bay hơi theo hơi nước của tinh dầu ở các điều kiện nhiệt độ thích hợp

- Tính hòa tan trong dung môi hữu cơ bay hơi và không bay hơi của tinh dầu

Sản phẩm tinh dầu thu được phải đạt một số yêu cầu sau:

- Tinh dầu thu được có hương vị tự nhiên của nguyên liệu ban đầu

- Quy trình kỹ thuật và phương pháp ly trích tinh dầu nhằm khai thác hết tinh

dầu trong nguyên liệu với chi phí đầu tư thấp nhất

2.2.4.1 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

Nguyên liệu được cắt nhỏ (trong sản xuất lớn có thể để nguyên) được cho vào nồi cất, sau đó sục luồng hơi nước qua nguyên liệu hoặc có thể cho nước trực tiếp vào bình chứa nguyên liệu rồi đun sôi Hơi nước và hơi tinh dầu được dẫn qua một ống sinh hàn làm lạnh sẽ ngưng tụ và rơi xuống một ống hứng Nếu tinh dầu có tỷ trọng nhẹ hơn nước sẽ nằm phía trên mặt nước, tinh dầu có tỷ trọng nặng hơn nước

sẽ ở lớp dưới của dịch nước (Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, 1999)

Sau khi tách tinh dầu ra khỏi lớp nước, dịch nước có thể còn lẫn một ít tinh dầu được cho trở lại nồi cất để tận thu tinh dầu Dịch nước sau cùng của quá trình chiết sẽ được chiết kiệt tinh dầu bằng cách cho thêm vào một ít muối để tăng tỷ trọng của nước, lớp tinh dầu sẽ nổi lên mặt nhiều hơn hoặc có thể dùng dung môi kém phân cực để lắc sau đó bốc hơi dung môi

Phương pháp chưng cất hơi nước là phương pháp cổ điển nhưng cho đến nay vẫn còn thông dụng để chưng cất tinh dầu trong phòng thí nghiệm cũng như trong sản xuất công nghiệp vì thiết bị đơn giản, ít tốn kém dung môi

 Đối với tinh dầu có chứa alcol ở dạng ester, trước khi cất phải kiềm hóa để chuyển về dạng tự do

2.2.4.2 Phương pháp ly trích bằng dung môi dễ bay hơi

Phương pháp này thường được áp dụng để chiết tinh dầu trong một số hoa (hoa lài, hoa cam, hoa hồng,…) Dung môi dùng trong phương pháp này đạt được những yêu cầu sau:

- Hòa tan hoàn toàn và nhanh chóng các cấu phần có mùi thơm trong nguyên

liệu

- Hòa tan kém các hợp chất khác như sáp, nhựa dầu có trong nguyên liệu

- Không có tác dụng hóa học với tinh dầu

- Không biến chất khi sử dụng lại nhiều lần

- Hoàn toàn tinh khiết, không có mùi lạ, không độc, không ăn mòn thiết bị,

không tạo hỗn hợp nổ với không khí và có độ nhớt kém

- Điểm sôi của dung môi thấp hơn điểm sôi của cấu tử dễ bay hơi nhất trong

tinh dầu

Nguyên liệu được ngâm vào dung môi trong bình chứa và được xáo trộn đều trong suốt thời gian ly trích Giữ cho hoa chìm trong dung môi từ 12 – 48 giờ, ngâm như vậy từ 10 – 15 đợt hoa cho một lượt dung môi Sau khi quá trình tẩm trích kết thúc, dung dịch ly trích sẽ được tách nước ra khỏi dung dịch rồi làm khan bằng

Na2SO4 và lọc Loại bỏ dung môi ra khỏi sản phẩm bằng phương pháp chưng cất dưới áp suất thấp (cô quay chân không) Sau khi thu hồi hoàn toàn dung môi, sản phẩm thu được gồm có tinh dầu và một số chất khác như nhựa, sáp, chất béo nên cần phải tách riêng tinh dầu ra Cho ethanol tinh khiết vào hỗn hợp sản phẩm và

10

khuấy đều ở nhiệt độ phòng trong vài ngày Tinh dầu hòa tan vào ethanol cùng với một ít nhựa và chất béo, sau đó làm lạnh dung dịch ethanol ở 10o

C – 15oC và lọc Ở nhiệt độ này nhựa và chất béo hòa tan vào ethanol sẽ đông đặc lại, chỉ còn lại tinh dầu hòa tan trong ethanol Loại dung môi dưới áp suất kém sẽ thu được tinh dầu tuyệt đối (Lê Ngọc Thạch, 2003)

2.2.4.3 Phương pháp hấp thụ

Phương pháp này áp dụng với các loại hoa có khả năng đặc biệt là vẫn tạo được tinh dầu sau khi thu hái khỏi cây như hoa lài, hoa huệ Người ta dùng chất béo động vật hay thực vật (ngày nay còn dùng thêm vaselin và parafin tinh khiết) hấp thụ những hợp chất dễ bay hơi, do đó hương thơm do hoa tiết sẽ được chất béo hấp thụ sau khi cho hoa tiếp xúc với các chất béo trong một khoảng thời gian nhất định

Dùng nhiều khay gỗ hình chữ nhật sâu 8 cm, rộng 60 cm, dài 100 cm Khoảng giữa chiều cao của khay có lắp một miếng kính phẳng Chất béo được trát vào cả hai bên mặt kính, lớp này dày khoảng 1 cm, khi chồng các khay lên với nhau

sẽ tạo thành một hộp kín, đáy và trần là hai lớp chất béo Để gia tăng bề mặt hấp thụ người ta tạo nhiều vạch trên bề mặt lớp này Hoa tươi, sạch, ráo nước được rải đều lên Sau đó các khay được chồng lên nhau và để yên Lớp chất béo dưới đáy tiếp xúc với hoa thì hấp thụ trực tiếp tinh dầu từ hoa, còn lớp trần thì chỉ hấp thu những chất dễ bay hơi bốc lên từ lớp trên của hoa Sau đó hoa cũ được lấy ra và xếp hoa mới vào Hoa được thay liên tục cho đến khi lớp mỡ bão hòa tinh dầu Lớp chất béo bão hòa tinh dầu được gọi là sáp hoa Để thu tinh dầu tinh khiết, sáp hoa được khuấy trộn đều với ethanol ở nhiệt độ phòng, dung dịch ethanol được lấy ra và ethanol mới được thay vào cho đên khi phần chất béo không còn mùi thơm nữa Làm lạnh dịch ly trích ở -15oC và lọc bỏ chất kết tinh Loại dung môi dưới áp suất thấp thu được tinh dầu tuyệt đối (Lê Ngọc Thạch, 2003)

+ Ưu điểm: Phương pháp này cho hiệu suất ly trích cao đối với những loại hoa sau khi thu hái còn tạo thêm tinh dầu

Tinh dầu được thu ở phương pháp ép có mùi thơm dễ chịu hơn phương pháp

ép cất kéo hơi nước, song nhược điểm của phương pháp này chính là tinh dầu không được chiết kiệt, thường bị vẫn đục vì còn lẫn các chất nhày, các mô và tạp chất khác do đó thường phải tinh chế lại (Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, 1999)

2.2.4.5 Ly trích dưới sự hỗ trợ của vi sóng

Dưới tác dụng của vi sóng, nước trong các tế bào thực vật bị nóng lên, áp suất bên trong tăng đột ngột làm các mô chứa tinh dầu bị vỡ ra Tinh dầu thoát ra bên ngoài, lôi cuối theo hơi nước sang hệ thống ngưng tụ hoặc hòa tan vào dung môi hữu cơ đang bao phủ ngoài nguyên liệu (Lê Ngọc Thạch, 2003)

Mức độ chịu ảnh hưởng vi sóng của các loại mô tinh dầu không giống nhau

do kiến tạo của các loại mô khác nhau, ngay cả khi nguyên liệu được làm nhỏ Kết quả này được phản ánh qua thời gian ly trích

Ngoài việc nước bị tác dụng nhanh chóng, các cấu phần phân cực hiện diện trong tinh dầu cũng bị ảnh hưởng bởi vi sóng Ngược lại các cấu phần hydrocarbon

ít chịu ảnh hưởng của vi sóng (độ phân cực kém) nên sự ly trích chúng giống như trong sự chưng cất hơi nước bình thường nhưng với vận tốc nhanh hơn rất nhiều vì nước được đun nóng nhanh bởi vi sóng (Lê Ngọc Thạch, 2003)

2.2.4.6 Phương pháp sử dụng dung môi dioxyt carbon

Hiện nay dioxyt carbon lỏng được sử dụng như một dung môi dùng để ly trích tinh dầu Phương pháp này có lợi điểm là cô lập sản phẩm rất dễ dàng vì dung môi CO2 khi ở áp suất thường sẽ bốc hơi nhanh chóng để lại tinh dầu tinh khiết Trong nhiều trường hợp tinh dầu sản xuất theo phương pháp này cho hiệu suất chiết suất và chất lượng cao CO2 được hóa lỏng trong những thiết bị đặc biệt có thể điều

2.2.5 Thành phần hóa học và tính chất hóa lý của tinh dầu

Thành phần các hợp chất trong tinh dầu rất phong phú và phức tạp Dựa vào cấu trúc hóa học có thể chia các hợp chất trong tinh dầu thành những nhóm chính như sau: monoterpen, sesquiterpen, các dẫn chất có nhân thơm và các hợp chất chứa

N và S Trong đó momoterpen và sesquiterpen là hai nhóm chiếm thành phần chủ yếu trong tinh dầu (Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, 1999)

Tinh dầu có các tính chất hóa lý như sau:

- Đa số tinh dầu ở trạng thái lỏng và dễ bay hơi ở nhiệt độ thường (trừ một số

ít ở trạng thái rắn: menthol, camphor, vanillin,…)

- Tinh dầu thường không có màu hoặc màu vàng nhạt (trừ dẫn chất azulin có

màu xanh)

- Có mùi thơm đặc biệt

- Không tan hoặc tan ít trong nước, tan trong dung môi hữu cơ

- Đại đa số tinh dầu có tỷ trọng nhỏ hơn nước

- Tinh dầu dễ bị oxy hóa

2.2.6 Xác định thành phần hóa học

2.2.6.1 Sắc ký khí

Ngày nay sắc ký khí (Gas Chromatography – GC) đã trở thành một trong những phương pháp quan trọng để tách, xác định cấu trúc, nghiên cứu các thông số hóa lý như hệ số hoạt độ, nhiệt hóa hơi, hệ số khuếch tán phân tử, động học xúc tác, v.v… Sắc ký khí là công cụ được ứng dụng rất mạnh mẽ trong nhiều ngành khoa học: hóa sinh, sinh học, y học, dược học, hóa học lâm sang, nghiên cứu xúc tác, hóa học môi trường, v.v…Sắc ký khí là kỹ thuật phân tích hiệu quả với độ phân giải cao, có thể giúp khảo sát một mẫu chất có trọng lượng vài miligram và đôi khi chỉ

Trên sắc đồ nhận được, sẽ có các tín hiệu ứng với các cấu tử được tách gọi là pic (peak) Thời gian lưu của pic là đại lượng đặc trưng (định tính) cho chất cần tách Diện tích của píc cơ sở định lượng cho từng chất trong hỗn hợp cần nghiên

cứu (Phạm Hùng Việt, 2005)

Hình 2.2: Sơ đồ hệ thống sắc ký khí

14

2.2.6.2 Sắc ký khí ghép khối phổ

Một trong những phương tiện hữu ích giúp các nhà hóa học xác định cấu trúc hóa học của hợp chất cần khảo sát là máy sắc ký khí ghép khối phổ, thường được gọi là GC-MS Hệ máy GC-MS có thể khảo sát một đơn chất hay hỗn hợp Các cấu

tử được tách khỏi cột sắc ký sẽ lần lượt được đưa vào nguồn ion của máy khối phổ Nguyên tắc của khối phổ là các phân tử đã được ion hóa sẽ được phân thành các mảnh có cấu trúc khác nhau có thể tách bằng tỷ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) của chúng trên cơ sở từ trường hoặc điện trường Bộ phận máy tính của khối phổ so sánh các dữ kiện vừa thu được với các số liệu phổ chuẩn đang chứa sẵn trong thư viện của máy để đề nghị cấu trúc hóa học của hợp chất khảo sát (đơn chất hoặc hỗn hợp) Máy in ra một bảng danh sách những hợp chất có khả năng giống với chất khảo sát, mỗi hợp chất đề nghị này đều có ghi kèm theo độ tương hợp (compatibility) Độ tương hợp càng lớn, trên 90% cấu trúc của hợp chất khảo sát càng có khả năng là chất mà máy đề nghị Kinh nghiệm về thành phần hóa học và kiến thức về phổ khối lượng quyết định rất lớn độ chính xác của kết quả định danh Đầu dò phổ khối lượng có độ nhạy cao, khoảng 10-6

– 10-9 g, do đó có thể xác định được những cấu phần có hàm lượng thấp mà các phương pháp khác không thể thực hiện được Sắc ký khối phổ có khả năng định danh cao, khả năng dò tìm nhanh,

lượng mẫu sử dụng ít (Phạm Hùng Việt, 2005)

2.3 Tinh dầu Màng tang

2.3.1 Tình hình sản xuất

Trên thế giới, Trung Quốc là nước sản xuất nhiều tinh dầu Màng tang nhất, mỗi năm khoảng 2000 tấn

Ở nước ta, Màng tang tuy phân bố rộng, nhưng sản lượng tinh dầu còn rất thấp Việc khai thác, mua bán và sử dụng còn manh mún nên hiệu quả chưa cao Trong những năm từ 1960 – 1963, chỉ riêng 2 tỉnh Yên Bái và Lào Cai, các doanh nghiệp đã thu mua được từ 500 – 600 tấn quả Màng tang tươi (có khả năng chưng cất được 6,5 – 10 tấn tinh dầu) Riêng huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai trong thời gian này mỗi năm mua khoảng 300 – 500 tấn quả Các tỉnh khác như Hà Giang, Tuyên

Hiện nay, giá mua bán tinh dầu Màng tang trên thị trường tương đối thấp

Tinh dầu Màng tang thường được thay thế bởi tinh dầu Sả chanh (Cymbopogon citratus)

2.3.2 Thành phần hóa học tinh dầu Màng tang

Tinh dầu chưng cất từ quả và lá Màng tang là nguồn cung cấp citral dồi dào, (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2006)

Theo Đỗ Tất Lợi (2004), quả Màng tang chứa 2 – 6% tinh dầu, một số địa phương tới 10 – 15% Tinh dầu quả màu vàng nhạt, tỷ trọng ở 15o

C là 0,8925 – 0,9068, chiết suất ở 20o

C là 1,4785 – 1,4864 Thành phần chủ yếu của tinh dầu quả Màng tang gồm 70 – 90% citral và methylheptenon Vỏ rễ Màng tang chứa 0,2 – 1,2% tinh dầu, tỷ trọng ở 15oC là 0,860 – 0,905, chiết suất ở 20oC là 1,4772, thành phần chủ yếu của tinh dầu vỏ rễ gồm citral (10%) và citronellol (8 – 12%) Lá Màng tang chứa 0,2 – 0,4% tinh dầu, tỷ trọng ở 15oC là 0,899 – 0,904, chiết suất ở 20oC là 1,4688, thành phần chủ yếu của tinh dầu lá gồm 20 – 35% cineol, các hợp chất aldehyd khoảng 6 – 22%, hợp chất alcol 20 – 25%

Thành phần chính của tinh dầu quả Màng tang là citral (55 – 70%), methylheptenon (20%), camphor và limonen (Lê Ngọc Thạch, 2003)

Wang và Liu (2010) đã ly trích tinh dầu từ các bộ phận khác nhau của cây Màng tang thu thập ở miền Nam Trung Quốc bằng phương pháp chưng cất hơi nước và phân tích thành phần tinh dầu trên hệ thống sắc ký khí (GC) và sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) Kết quả cho thấy hàm lượng tinh dầu trong hoa cao nhất 3,1%, kế đến là trong quả 2,1% và rễ 1,3% Các monoterpen chứa oxy là thành phần

16

chính trong quả và rễ trong khi đó monoterpen hydrocarbon là thành phần chính trong các bộ phận khác Thành phần chính trong tinh dầu rễ Màng tang: citral B (21,53%), citronellal (8,57%), linalool (7,45%), isopulegol (6,05%) và β-phellandren (5,24%) Thành phần chính trong tinh dầu hoa Màng tang là β-terpinen (33,17%), cineol (13,68%), α-pinen (7,51%), and β-pinen (7,25%) Thành phần chính trong tinh dầu quả Màng tang là citral B (63,75%) và limonen (7,38%)

Bighelli và ctv (2005) đã nghiên cứu tinh dầu từ lá Màng tang thu thập từ 6 tỉnh ở Việt Nam: Ba Vì, Lạng Sơn, Thái Nguyên, Thanh Hóa, Yên Bái và Điện Biên Kết quả cho thấy hàm lượng tinh dầu (trên nguyên liệu khô) dao động từ 0,3 – 6,6%, thành phần chính của tinh dầu lá Màng tang là cineol, sabinen và linalool Tinh dầu thân Màng tang gồm 40 – 44 chất, chất chính là citronellol (11,9 – 20,4%) Citronellol (41%) được báo cáo gần đây là thành phần chính của tinh dầu chiết xuất từ vỏ thân cây Màng tang ở vùng Đông Bắc Ấn Độ (Nath và ctv, 1996)

2.3.3 Hoạt tính sinh học của tinh dầu Màng tang

Một vài nghiên cứu chứng minh rằng tinh dầu Màng tang có hoạt tính sinh học như chống oxy hóa, kháng vi sinh vật và kháng viêm Sự đa dạng trong thành phần hóa học của tinh dầu, đặc biệt là của dịch chiết các loại dược liệu đã được quan sát dựa vào nguồn gốc, điều kiện môi trường và thời kỳ phát triển của nguồn nguyên liệu thu thập Hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu được cho là dựa vào các thành phần chính, mặc dù tác động của một chất chiếm hàm lượng thấp trong hỗn hợp đã được cân nhắc Vì vậy, hoạt tính kháng vi sinh vật, chống oxy hóa và các hoạt tính sinh học khác có thể thay đổi khác nhau dựa vào sự đa dạng trong thành phần hóa học của tinh dầu

Theo nghiên cứu của Yu và ctv (2007): ở nồng độ 200 và 300 µg/ml, tinh dầu quả Màng tang có hoạt tính chống lại nấm mốc mạnh nhất, kế tiếp là tinh dầu thân và lá Màng tang Phân tích thành phần hóa học tinh dầu Màng tang cho thấy citral (geranial và neral) và lemonen là hợp chất chính trong tinh dầu quả và thân Màng tang Trong các chất trên, geraniol có hoạt tính kháng nấm mạnh nhất với

nồng độ ức chế tối thiểu là 88, 256 và 275 µg/ml đối với Penicillium citrinum,

17

Trichoderma viride và Aspergillus niger Các thành phần chính của tinh dầu Màng

tang cũng có tiềm năng trở thành thuốc diệt côn trùng thực vật

Wang và Liu (2010) đã xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Màng tang thu thập ở miền Nam Trung Quốc bằng thử nghiệm khuếch tán trên đĩa thạch

và phương pháp pha loãng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Kết quả cho

thấy, tinh dầu Màng tang có khả năng kháng 6 loại vi khuẩn: Bacillus subtilis ATCC 6501, Enterococcus faecalis ATCC 15753, Escherichia coli ATCC 25922, Monilia albicans ATCC 64548, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27852 và Staphylococcus aureus ATCC 25923 Đường kính vòng kháng khuẩn dao động từ

10,1 – 35 mm, nồng độ ức chế tối thiểu từ 100 – 1000 µg/ml So sánh với chất chuẩn kháng sinh levofloxacin, tinh dầu Màng tang có hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn

Theo Liu và ctv (2007), tinh dầu Màng tang có đặc tính kháng nấm, chống

lại một số nấm gây bệnh như: Alternaria alternate, Aspergillus niger, Candida albicans, Fusarium spp và Helminthosporium spp

Ko và ctv (2009) đã thu thập quả Màng tang ở Chiang Mai, Thái Lan (19°54’N, 99°2’E), tiến hành trích ly tinh dầu và khảo sát độc tính đối với hai loại

mọt là Sitophilus zeamais và Tribolium castaneum Kết quả cho thấy, tinh dầu Màng tang có độc tính với S zeamais (LC50= 92,46 µl/l) và T castaneum (LC50 = 549,57 µl/l)

18

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.2 Vật liệu

3.2.1 Mẫu thí nghiệm

Lá và quả Màng tang sau khi thu hái được phơi khô trong phòng râm khoảng

10 ngày, xay nhuyễn trước khi tiến hành các thí nghiệm

 Các môi trường thử nghiệm vi sinh

 Ampicillin, norfloxacin, ketoconazol (Merck)

3.2.4 Thiết bị và dụng cụ

 Máy sắc ký khí khối phổ HP 5890II (Mỹ)

 Cân điện tử BP 210S – Sartorius AG Gottingen (Đức)

 Bộ chưng cất hơi nước Clevenger (Việt Nam)

 Máy cô quay chân không Buchi Rotavapor R – 200 (Đức)

 Bồn siêu âm Power sonic 510 Hwashin (Hàn Quốc)

 Tủ mát Darling (Việt Nam)

 Tủ sấy Memmert (Đức)

 Micropippete Nichipet (Nhật)

 Máy vortex (Đức)

 Máy xay mẫu Philip (Mỹ)

 Nhiệt kế (Việt Nam)

 Các dụng cụ thủy tinh: bình cầu 100ml, đĩa petri, ống nghiệm, bình nón, ống đong, bình định mức, pipet

3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Xác định độ ẩm nguyên liệu

Thông thường, độ ẩm của nguyên liệu được xác định bằng phương pháp sấy Tuy nhiên, đối với một số nguyên liệu (dược liệu) chứa tinh dầu, khi sấy cả nước và tinh dầu cùng bay hơi dẫn tới không xác định được chính xác lượng nước của nguyên liệu Đối với những nguyên liệu dạng này, người ta sử dụng phương pháp chưng cất với dung môi để xác định độ ẩm

20

Khi chưng cất nguyên liệu

với một dung môi không tan trong

nước nhưng tạo với nước thành

một hỗn hợp có điểm sôi nhất

định Tại điểm sôi này nước và

dung môi đều bốc hơi Khi gặp

lạnh ở ống sinh hàn, hơi nước và

hơi dung môi ngưng tụ lại và rơi

xuống ống hứng, nước tách ra khỏi

dung môi Nước nặng hơn dung

môi nên chìm xuống phần dưới của

Khi lớp nước và toluen đã được phân tách hoàn toàn, đọc thể tích nước trong ống hứng

Độ ẩm nguyên liệu được tính theo công thức sau:

X = (100 × v) / m

X: độ ẩm nguyên liệu(%)

v: thể tích nước trong ống hứng (ml)

Hình 3.1: Bộ dụng cụ xác định độ ẩm

21

m: khối lượng nguyên liệu đem thử (g).== dvfdsfdf

Thí nghiệm lặp lại 3 lần, kết quả lấy giá trị trung bình

3.3.2 Ly trích tinh dầu Màng tang

Tinh dầu Màng tang được ly trích bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn theo hơi nước Việc tách tinh dầu ra khỏi nguyên liệu dựa trên nguyên tắc: nước và tinh dầu là hai chất lỏng bay hơi không tan với nhau nhưng tạo thành một hỗn hợp có điểm sôi nhất định Tại điểm sôi này, nước và tinh dầu đều bay hơi và ngưng tụ vào ống hứng tinh dầu Nước và tinh dầu trở thành hai pha tách biệt, tinh dầu Màng tang nhẹ hơn nước nên ở phía trên Xác định lượng tinh dầu tách ra khỏi hỗn hợp ngưng

tụ sẽ biết được lượng tinh dầu có trong nguyên liệu Trong phòng thí nghiệm, tinh dầu được chưng cất bằng bộ dụng cụ Clevenger

Tiến hành:

Cân khoảng 50 – 100 g

mẫu đã xay nhuyễn cho vào bình

cầu, bổ sung nước cất vào

khoảng nửa bình và đưa vào hệ

thống chưng cất (hệ thống chưng

cất bao gồm bình cầu, ống hứng

tinh dầu và ống sinh hàn) Khi

hỗn hợp này sôi, hơi nước và

tinh dầu bay lên qua ống sinh

hàn sẽ ngưng tụ và rơi xuống ống

hứng Tiến hành chưng cất cho

đến khi lượng tinh dầu trong ống

hứng không còn tăng nữa Tinh dầu nhẹ hơn nước sẽ ở lớp trên, nước ở lớp dưới Dùng n-hexan hòa tan tinh dầu và đưa vào bình chiết để thấy rõ sự phân tách giữa nước và tinh dầu Thu lấy lớp trên gồm tinh dầu và n-hexan, cô cạn ở áp suất thấp nhiệt độ khoảng 50oC để thu được tinh dầu tinh khiết

Hình 3.2: Hệ thống chưng cất Clevenger

22

Hàm lượng tinh dầu trong nguyên liệu được tính theo công thức sau:

C = (100 × a) / m C: hàm lượng tinh dầu (%)

a: khối lượng tinh dầu trong ống hứng (g)

m: khối lượng nguyên liệu đem thử (g).==

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả lấy giá trị trung bình

Các mẫu nguyên liệu có độ ẩm khác nhau, do đó để so sánh hàm lượng tinh dầu trong các mẫu cần tính toán quy về hàm lượng tinh dầu trên khối lượng nguyên liệu khô tuyệt đối (100% vật chất khô)

3.3.3 Xác định thành phần tinh dầu

Tinh dầu lá Màng tang được phân tích thành phần trên hệ thống sắc kí khí Agilent 5890II GC ghép với đầu dò khối phổ 5971 MSD

Điều kiện trên GC:

 Nhiệt độ buồng tiêm mẫu là 220oC, thể tích mẫu tiêm là 1µl

 Chế độ tiêm mẫu: chia dòng (split), tỉ lệ chia dòng 1:10

 Khí mang là He, tốc độ dòng 1,2 ml/phút

 Cô ̣t: ZB – 5MS: 30 m × 250 µm × 0,25 µm

 Chương trình nhiệt độ: nhiệt độ đầu 60o

C (giữ trong 1 phút) tăng 2oC/phút đến

100oC (giữ trong 2 phút), tiếp tục tăng 8oC/phút đến 220oC (giữ trong 5 phút) Thời gian phân tích 1 mẫu là 43 phút

Điều kiện trên MS:

 Chế độ full scan (scan mode)

 Năng lượng chùm electron 70 eV

23

3.3.4 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng thử nghiệm DPPH

3.3.4.1 Nguyên tắc của phương pháp

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là gốc tự do ổn định và có màu tím đặc trưng

Thử nghiệm DPPH dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các mẫu nghiên cứu Các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa sẽ làm giảm cường độ màu của DPPH, gốc DPPH (màu tím đậm) bị khử thành sản phẩm có màu vàng nhạt Sự làm giảm màu tím đặc trưng của DPPH là do gốc tự do DPPH đã kết hợp với một nguyên tử H của chất nghiên cứu để tạo thành DPPH dạng phân tử Xác định khả năng này bằng cách đo mật độ quang ở bước sóng có độ hấp thu cực đại là

λmax = 517 nm

Hình 3.3: Phương trình phản ứng bắt gốc tự do DPPH 3.3.4.2 Tiến hành

Pha dung dịch DPPH có nồng độ 0,1 mM trong methanol, dung dịch này không bền, chỉ dùng trong khoảng 24 giờ sau khi pha

24

Chuẩn bị dung dịch tinh dầu:

Tinh dầu lá Màng tang được pha loãng trong methanol với dãy nồng độ: 100; 50; 25; 12,5; 5 µl/ml Tinh dầu quả Màng tang được chuẩn bị trong methanol với dãy nồng độ nhỏ hơn nhiều lần so với lá

Chuẩn bị mẫu đối chiếu:

Mẫu đối chiếu sử dụng trong thử nghiệm này là trolox và vitamin C (là những chất chống oxy hóa rất mạnh)

Trolox (C14H18O4) là dạng đồng phân tan trong nước của vitamin E Pha trolox trong ethanol với dãy nồng độ 0,3; 0,2; 0,1; 0,05; 0,01; 0,005 mg/ml

Pha vitamin C (C6H8O6) trong methanol với dãy nồng độ là 0,3; 0,2; 0,1; 0,05; 0,01 mg/ml

30 phút Đo độ hấp thu của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 517 nm

Ở mỗi nồng độ, phản ứng được lặp lại 6 lần, kết quả lấy giá trị trung bình

Hoạt tính chống oxy hóa (%) = 100 × (1 ─ A/A o )

A : độ hấp thu của mẫu thử

Ao : độ hấp thu của mẫu đối chứng

Khả năng chống oxy hóa được đánh giá qua IC50, là nồng độ mẫu thử có khả năng làm giảm 50% gốc tự do DPPH

3.3.5 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu Màng tang

Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu Màng tang bằng 2 phương pháp: phương pháp khuếch tán trên thạch của Kirby – Bauer và phương pháp pha loãng

25

Các chủng vi sinh vật thử nghiệm là: Escherichia coli ATCC 2592, Staphylococcus aureus ATCC 25923 và Candida albicans ATCC 10231

3.3.5.1 Phương pháp khuếch tán trên thạch

Phương pháp khuếch tán trên thạch được thực hiện nhằm xác định sự nhạy cảm của vi sinh vật đối với các mẫu thử nghiệm Tinh dầu Màng tang được tẩm vào các đĩa giấy tiệt trùng với hàm lượng nhất định Khi được đặt lên bề mặt môi trường thạch đĩa, tinh dầu sẽ khuếch tán ra xung quanh và ngăn cản không cho vi sinh vật phát triển tạo nên vòng kháng (trường hợp vi sinh vật bị tác động bởi loại chất được thử)

Vi sinh vật được tăng sinh bằng cách lắc trong 24 giờ (đối với vi khuẩn) hoặc

48 giờ (đối với nấm C albicans) Dịch tăng sinh được xác định nồng độ bằng

phương pháp đếm trên môi trường thạch đĩa (xem phụ lục 2) Từ dịch tăng sinh này, pha loãng bằng môi trường đã tiệt trùng để được nồng độ 106 CFU/ml

(đối với vi khuẩn) và 48 giờ (đối với C albicans)

 Đọc kết quả bằng cách quan sát đĩa petri, vi khuẩn hoặc nấm mọc lên khắp

bề mặt thạch và làm đục bề mặt Nếu xung quanh đĩa giấy có vòng trong suốt thì đó là vòng kháng khuẩn hoặc kháng nấm