KHẢO SÁT ĐỘ TIN CẬY CỦA KÍT ELISA XÉT NGHIỆM KHÁNG THỂ KHÁNG PCV2 VÀ ĐÁP ỨNG CỦA HEO ĐỐI VỚI VẮCXIN PHÒNG HỘI CHỨNG GẦY CÒM TRÊN HEO SAU CAI SỮA (PMWS)

iv TÓM TẮT Đề tài “Khảo sát độ tin cậy của kít ELISA xét nghiệm kháng thể kháng PCV2 và đáp ứng của heo đối với vắc-xin phòng hội chứng gầy còm trên heo sau cai sữa PMWS” được thực hiện

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐẠO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

****************

NGUYỄN HOÀNG MỸ

KHẢO SÁT ĐỘ TIN CẬY CỦA KÍT ELISA XÉT NGHIỆM KHÁNG THỂ KHÁNG PCV2 VÀ ĐÁP ỨNG CỦA HEO ĐỐI VỚI VẮC-XIN PHÒNG HỘI CHỨNG GẦY CÒM TRÊN HEO

SAU CAI SỮA (PMWS)

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐẠO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

****************

NGUYỄN HOÀNG MỸ

KHẢO SÁT ĐỘ TIN CẬY CỦA KÍT ELISA XÉT NGHIỆM KHÁNG THỂ KHÁNG PCV2 VÀ ĐÁP ỨNG CỦA HEO ĐỐI VỚI VẮC-XIN PHÒNG HỘI CHỨNG GẦY CÒM TRÊN HEO

SAU CAI SỮA (PMWS)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN TẤT TOÀN

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 8/2011

KHẢO SÁT ĐỘ TIN CẬY CỦA KÍT ELISA XÉT NGHIỆM KHÁNG THỂ KHÁNG PCV2 VÀ ĐÁP ỨNG CỦA HEO ĐỐI VỚI VẮC-XIN PHÒNG HỘI CHỨNG GẦY CÒM TRÊN HEO SAU CAI SỮA (PMWS)

NGUYỄN HOÀNG MỸ

Hội đồng chấm luận văn

1 Chủ tịch: TS LÊ ĐÌNH ĐÔN

Trường Đại học Nông Lâm TP HCM

2 Thư ký: TS LÊ THỊ DIỆU TRANG

Viện CNSH và Môi trường, ĐH Nông Lâm TP HCM

3 Phản biện 1: PGS TS TRẦN ĐÌNH TỪ

Hội thú y Việt Nam

4 Phản biện 2: TS THÁI THỊ THỦY PHƯỢNG

Cục Thú y Văn phòng 2

5 Ủy viên: PGS TS TRẦN THỊ DÂN

Hội thú y Việt Nam

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

HIỆU TRƯỞNG

i

LÝ LỊCH CÁ NHÂN

Tôi tên là Nguyễn Hoàng Mỹ, sinh ngày 15 tháng 5 năm 1984, tại phường Quyết Thắng, thành phố Biên Hòa, tỉnh Đồng Nai Con ông Nguyễn Hoàng Năng và bà Nguyễn Thị Hường

Tốt nghiệp Trung học phổ thông tại Trường trung học phổ thông chuyên Lương Thế Vinh tỉnh Đồng Nai năm 2002

Tốt nghiệp Đại học ngành Sinh học, hệ đại học chính quy tại Đại học Khoa học

tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh năm 2007

Tháng 9 năm 2007 theo học Cao học ngành Công nghệ sinh học tại Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh

Từ tháng 9 năm 2008 đến tháng 4 năm 2011 làm việc tại Khoa Môi trường & Công nghệ sinh học, Đại học Kỹ thuật công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, chức vụ: Giảng viên

Từ tháng 5 năm 2011 đến nay làm việc tại Viện Khoa học công nghệ & Quản lý môi trường, Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, chức vụ: Giảng viên Tình trạng gia đình: Chồng Trần Bình Hậu, kết hôn năm 2010

Địa chỉ liên lạc: 108/5/4 Cách mạng Tháng 8, phường Quyết Thắng, thành phố Biên Hòa, tỉnh Đồng Nai

Điện thoại: 0613.843633 – 0988411701

ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Học viên thực hiện luận văn

Nguyễn Hoàng Mỹ

iii

LỜI CẢM TẠ

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn trân trọng đến tất cả các quý Thầy, Cô trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Chăn nuôi Thú y đã cho tôi nhiều kiến thức làm nền tảng, định hướng cho tôi trong thời gian học tập nghiên cứu tại trường; các Thầy, Cô Phòng Sau đại học, Ban giám hiệu Nhà trường đã tạo những điều kiện thuận lợi nhất cho tôi hoàn thành tốt khóa học

Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến Tiến sĩ Nguyễn Tất Toàn và Phó giáo sư – Tiến sĩ Trần Thị Dân đã dành rất nhiều thời gian và công sức hướng dẫn nghiên cứu, sửa chữa và giúp tôi hoàn thành luận văn Tôi cũng chân thành cảm ơn các Thầy Cô trong Hội đồng, các Thầy Cô phản biện đã tận tình chỉ dẫn, giúp tôi hoàn thiện luận văn được tốt hơn

Cuối cùng, tôi xin dành lời cảm ơn ba mẹ và gia đình, những người luôn bên cạnh ủng hộ, động viên tôi những lúc khó khăn nhất

Nguyễn Hoàng Mỹ

iv

TÓM TẮT

Đề tài “Khảo sát độ tin cậy của kít ELISA xét nghiệm kháng thể kháng PCV2 và đáp ứng của heo đối với vắc-xin phòng hội chứng gầy còm trên heo sau cai sữa (PMWS)” được thực hiện trong thời gian 2/2009-12/2009 với hai nội dung chính: (i) đánh giá độ tin cậy của bộ kít SERELISA® PCV2 Ab Mono Blocking (kỹ thuật ELISA) bằng cách tính hệ số biến động (CV) của hiệu giá kháng thể (HGKT) ở 5 mẫu lặp lại 3 lần, và hệ số biến động của 3 nhóm HGKT (cao, vừa và thấp) từ kết quả xác định HGKT kháng PCV2 trên 525 mẫu huyết thanh heo ở hai trại chăn nuôi công nghiệp tỉnh Bình Dương (trại A) và Đồng Nai (trại B); (ii) đánh giá đáp ứng của heo với vắc-xin Circumvent phòng PMWS thông qua các chỉ tiêu về HGKT, công thức bạch cầu vào các thời điểm tiêm văc-xin và thành phần các loại tế bào trong dịch phế quản – phổi heo vào thời điểm xuất chuồng

Kết quả cho thấy bộ kít có độ tin cậy đạt yêu cầu để xét nghiệm kháng thể kháng PCV2 trên các mẫu huyết thanh heo tại Việt Nam Hệ số biến động HGKT ở 3 lần lặp lại của 5 mẫu huyết thanh là 1,99% Hệ số biến động của 3 nhóm HGKT cao, vừa và thấp là 5,09% Các kết quả này nằm trong giới hạn cho phép (thấp hơn 10%) khi đánh giá độ tin cậy của quy trình ELISA

Kết quả đánh giá đáp ứng của heo đối với vắc-xin cho thấy HGKT cao và bắt đầu gia tăng vào giai đoạn sớm ngay sau khi tiêm mũi 2 HGKT cao nhất vào thời điểm

75 ngày tuổi đạt 4531 Eu ở trại A và 7585 Eu vào thời điểm 165 ngày tuổi ở trại B Tổng số bạch cầu ở trại A tăng cao nhất vào thời điểm 75 ngày tuổi, ở trại B là 42 ngày tuổi Trong đó, chủ yếu là tăng mạnh bạch cầu đơn nhân, giảm bạch cầu trung tính và bạch cầu lympho Kết quả khảo sát dịch phế quản – phổi vào thời điểm xuất chuồng cho thấy tế bào đơn nhân chiếm 64%, tế bào biểu mô chiếm 16% và tế bào lympho chiếm 8% Các kết quả này có sự khác biệt giữa lô đối chứng và lô thí nghiệm cho thấy heo được tiêm vắc-xin có đáp ứng miễn dịch nhanh và hiệu quả hơn so với heo không được tiêm ngừa

v

ABSTRACT

The project “Study the precision of ELISA kit for detecting anti-PCV2 antibodies and the responses to vaccine against post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in pig” was carried out during 2/2011 – 12/2011 in two parts: (i) detection

of anti-PCV2 antibodies in 525 pig-serum samples at two industrial farms in Binh Duong (fram A) and Dong Nai (farm B) by SERELISA® PCV2 Ab Mono Blocking kit (based on ELISA technique), from which, coefficient of variation (CV) of 5 samples in triplicate, and that of three titer groups - high, medium and low, were calculated to assess the kit’s reliability; (ii) evaluation of the pig responses to vaccine against PMWS based on antibody titers, white blood cell formula in the timing of vaccine administration and cell components in bronchoalveolar lavage fluid (BAL) at slaughter age

The study results demonstrated the kit were reliable to determine anti-PCV2 antibodies in pig serum in Vietnam Average CV of 5 samples in triplicate were 1.99% Average CV of high, medium and low titer groups were 5.09% These results were within permissible limits (less than 10%) of ELISA technique

The vaccine trials showed that antibody titers began to rise in the early days after the second dose The highest antibody titers reached 4531 Eu at 75 days old in farm

A and 7585 Eu at 165 days old in farm B The total number of white blood cell was highest in farm A at 75 days old, in farm B at 42 days old, due mainly to increase of monocytes and decrease of neutrophils and lymphocytes BAL results at slaughter age showed that monocytes accounted for 64%, epithelial cells 16% and lymphocytes 8% The differences in results between control lot and experimental lot demonstrated the immune responses of vaccinated pigs were quick and effective than the non-vaccinated pigs

vi

MỤC LỤC

TRANG Trang tựa

Trang chuẩn y

Lý lịch cá nhân i

Lời cam đoan ii

Lời cảm tạ iii

Tóm tắt iv

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt x

Danh sách các hình xii

Danh sách các biểu đồ xiii

Danh sách các sơ đồ xiv

Danh sách các bảng xv

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 2

1.3 Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN 2.1 Hội chứng gầy còm trên heo sau cai sữa 4

2.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh 4

2.1.2 Dấu hiệu lâm sàng 5

2.1.3 Bệnh tích 6

2.1.3.1 Bệnh tích đại thể 6

2.1.3.2 Bệnh tích vi thể 7

2.2 Porcine circovirus 8

2.2.1 Đặc điểm và cấu trúc của porcine circovirus 8

2.2.1.1 Đặc điểm 8

2.2.1.2 Cấu trúc 10

vii

2.2.2 PCV2 và hệ miễn dịch của heo 12

2.2.2.1 Ảnh hưởng của PCV2 lên các tế bào hệ miễn dịch 12

2.2.2.2 Đáp ứng miễn dịch ở heo bệnh PMWS 13

2.2.3 Sinh bệnh học 15

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát triển bệnh PMWS 17

2.3 Chẩn đoán bệnh PMWS và phát hiện PCV2 18

2.3.1 Chẩn đoán bệnh PMWS 18

2.3.2 Các phương pháp phát hiện PCV2 19

2.3.3 Phương pháp ELISA dùng trong phát hiện PCV2 20

2.3.3.1 Phương pháp ELISA 20

2.3.3.2 ELISA dùng trong phát hiện PCV2 23

2.3.3.3 Kít ELISA dùng trong đề tài 25

2.4 Kiểm soát – Điều trị - Phòng bệnh PMWS 26

2.4.1 Kiểm soát bệnh 26

2.4.2 Điều trị 26

2.4.3 Phòng bệnh 26

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 31

3.2 Nội dung nghiên cứu 31

3.3 Đối tượng nghiên cứu 32

3.4 Phương pháp tiến hành 32

3.4.1 Thí nghiệm tiêm vắc-xin 32

3.4.2 Khảo sát độ tin cậy của kít ELISA 33

3.4.2.1 Mục đích 33

3.4.2.2 Dụng cụ và hóa chất và mẫu khảo sát 33

3.4.2.3 Phương pháp thực hiện 34

3.4.2.4 Các chỉ tiêu theo dõi và công thức tính 37

3.4.3 Đánh giá hiệu giá kháng thể kháng PCV2 trên mẫu huyết thanh heo ở các thời điểm khác nhau sau khi tiêm phòng vắc-xin 37

viii

3.4.3.1 Mục đích 37

3.4.3.2 Dụng cụ và hóa chất 37

3.4.3.3 Phương pháp thực hiện 38

3.4.3.4 Các chỉ tiêu theo dõi 38

3.4.4 Khảo sát số lượng bạch cầu và lập công thức bạch cầu trong máu 38

3.4.4.1 Mục đích 38

3.4.4.2 Dụng cụ và hóa chất 38

3.4.4.3 Phương pháp thực hiện 38

3.4.4.4 Các chỉ tiêu theo dõi 39

3.4.5 Khảo sát tổng số và thành phần các loại tế bào trong dịch phế quản – phổi heo ở thời điểm xuất chuồng 39

3.4.5.1 Mục đích 39

3.4.5.2 Dụng cụ và hóa chất 39

3.4.5.3 Phương pháp tiến hành 40

3.4.5.4 Các chỉ tiêu theo dõi 41

3.5 Phương pháp thống kê và xử lý số liệu 41

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Độ tin cậy của kít ELISA 42

4.1.1 Hệ số biến động của quy trình 42

4.1.2 Hệ số biến động ở ba mức hiệu giá kháng thể 43

4.2 Đánh giá đáp ứng của heo đối với vắc-xin 48

4.2.1 Xác định hiệu giá kháng thể kháng PCV2 48

4.2.1.1 Tỷ lệ huyết thanh dương tính 48

4.2.1.2 Hiệu giá kháng thể kháng PCV2 với kít ELISA 49

4.2.2 Số lượng bạch cầu và lập công thức bạch cầu trong máu 53

4.2.2.1 Số lượng bạch cầu 53

4.2.2.2 Công thức bạch cầu 56

4.2.3 Tổng số và thành phần các loại tế bào trong dịch phế quản - phổi heo vào thời điểm xuất chuồng 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Hệ số biến động của 5 mẫu lặp lại

Phụ lục 2 Hệ số biến động của 3 nhóm hiệu giá kháng thể

Phụ lục 3 Hiệu giá kháng thể ở trại A

Phụ lục 4 Hiệu giá kháng thể ở trại B

CpG-ODN : Cytosine-phosphate-Guanine Oligodeoxynucleotide

CSF : Colony Stimulating Factor

CV : Coefficient of Variation

DNA : Deoxyribonucleic acid

ds DNA : double stranded Deoxyribonucleic acid

ĐC : Đối Chứng

EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

ELISA : Enzyme-Linked Immonosorbent Assay

Ig : Immunoglobulin

IHC : Immuno Histochemistry

IL : Interleukin

IFN : Interferon

IPMA : Immunoperoxidase Monolayer Assay

IFA : Indirect Fluorescent Antibody

ISH : In Situ Hybridization

kDa : kilo Dalton

MCP : Monocyte Chemotactic Protein

MDA : Maternally Derived Antibodies

nm : nanometer

OD : Optical Density

ORF : Open Reading Frame

xi

pb : pair base

PCR : Polymerase Chain Reaction

PCV : Porcine Circovirus

PCVAD : PCV Associated Disease

PDNS : Porcine Dermatitis & Nephropathy Syndrome PHA : Phytohaemagglutinin

xii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG

Hình 2.1 Những khu vực phát hiện có bệnh PMWS trên thế giới 4

Hình 2.2 Heo bệnh PMWS với biểu hiện gầy, khó thở và xuất hiện nốt hạch ở bẹn 5

Hình 2.3 Tế bào chứa thể vùi và tế bào đa nhân trên mẫu tế bào hạch bạch huyết heo bệnh PMWS 7

Hình 2.4 Porcine circovirus quan sát dưới kính hiển vi điện tử 9

Hình 2.5 Mô hình cấu trúc virion của PCV 10

Hình 2.6 Vị trí các khung đọc mở ORF của PCV 11

Hình 2.7 Sự thay đổi thành phần tế bào miễn dịch ở heo bệnh PMWS 14

Hình 2.8 Quá trình PCV2 phát triển trong tế bào 16

Hình 2.9 Các trường hợp đồng nhiễm với PCV2 ở Mỹ 18

Hình 2.10 Nguyên tắc phản ứng của phương pháp ELISA trực tiếp và ELISA gián tiếp 21

Hình 2.11 Nguyên tắc phản ứng của phương pháp ELISA gắn kẹp trực tiếp và ELISA gắn kẹp gián tiếp 22

Hình 4.1 Đĩa ELISA thực hiện trên 18 mẫu ở ba nhóm hiệu giá kháng thể trước khi cho dung dịch kết thúc và sau khi cho dung dịch kết thúc vào giếng47 Hình 4.2 Các loại tế bào trong dịch phế quản – phổi 63

xiii

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

BIỀU ĐỒ TRANG

Biểu đồ 4.1 Phân bố ba nhóm hiệu giá kháng thể cao, trung bình và thấp của

hai trại 45

Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ % các loại tế bào bạch cầu ở trại A 57

Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ % các loại tế bào bạch cầu ở trại B 57

Biểu đồ 4.4 Tổng số tế bào dịch phế quản – phổi 61

Biểu đồ 4.5 Tỷ lệ trung bình các loại tế bào dịch phế quản –phổi 63

xiv

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ

SƠ ĐỒ TRANG

Sơ đồ 3.1 Thời điểm lấy mẫu máu ở trại A và trại B 32

Sơ đồ 4.1 Hiệu giá kháng thể ở trại A 51

Sơ đồ 4.2 Hiệu giá kháng thể ở trại B 51

Sơ đồ 4.3 Số lượng bạch cầu ở trại A 55

Sơ đồ 4.4 Số lượng bạch cầu ở trại B 55

xv

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG

Bảng 2.1 Tỷ lệ bệnh tích ở heo bệnh PMWS 6

Bảng 2.2 Các dấu hiệu lâm sàng và bệnh tích quan sát trên heo bệnh PMWS 8

Bảng 2.3 Các loại vắc-xin phòng bệnh PMWS và liều dùng 28

Bảng 3.1 Số heo thí nghiệm và số mẫu khảo sát vào các thời điểm tại hai trại 33

Bảng 4.1 Hệ số biến động của 5 mẫu 42

Bảng 4.2 Phân bố ba nhóm hiệu giá kháng thể cao, trung bình và thấp của hai trại 45

Bảng 4.3 Kết quả hệ số biến động ở ba mức hiệu giá kháng thể 46

Bảng 4.4 Tỷ lệ huyết thanh dương tính ở hai trại 48

Bảng 4.5 Kết quả hiệu giá kháng thể ở trại A 50

Bảng 4.6 Kết quả hiệu giá kháng thể ở trại B 50

Bảng 4.7 Số lượng bạch cầu trại A và trại B 54

Bảng 4.8 Tỷ lệ các loại tế bào bạch cầu tại trại A 56

Bảng 4.9 Tỷ lệ các loại tế bào bạch cầu tại trại B 59

Bảng 4.10 Tổng số tế bào dịch phế quản – phổi 61

Bảng 4.11 Tỷ lệ các loại tế bào dịch phế quản – phổi 62

an toàn sinh học kết hợp với điều trị các bệnh phụ nhiễm trong giai đoạn sớm Chính vì vậy, công tác phòng bệnh là quan trọng trong kiểm soát bệnh PMWS (Chae, 2004)

Vắc-xin phòng PMWS lần đầu tiên được thử nghiệm tại Đức và Pháp năm 2004

là loại vắc-xin nhược độc Sau đó, vắc-xin tiểu đơn vị chứa protein ORF2 – tác nhân gây đáp ứng miễn dịch – của vi-rút được hoàn thiện và sử dụng rộng rãi tại Bắc Mỹ Trên những đàn heo được tiêm ngừa, hầu hết các nghiên cứu đều cho thấy

tỷ lệ nhiễm PCV2 cũng như tỷ lệ bệnh PMWS giảm đáng kể Đến nay, vắc-xin đã trở thành công cụ không thể thay thế trong việc kiểm soát bệnh do PCV2 gây ra (Opriessnig và ctv, 2007)

Đáp ứng của heo đối với vắc-xin được đánh giá qua hiệu giá kháng thể kháng PCV2 trong huyết thanh sau khi tiêm phòng Phương pháp phổ biến nhất có thể áp dụng trên quần thể lớn, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao là ELISA Tuy nhiên, quy trình ELISA đòi hỏi những nghiên cứu thống kê có độ tin cậy cao để có thể tối ưu hóa quy trình và cho kết quả định lượng chính xác nhất (Walker và ctv, 2000; Crowther, 2000) Hiệu quả của vắc-xin còn được đánh giá qua sự khác biệt về tỷ lệ

2

nhiễm PCV2 giữa nhóm heo có tiêm phòng và không có tiêm phòng Ngoài ra, nên theo dõi những thay đổi về thành phần và chức năng các tế bào của hệ miễn dịch, chủ yếu là đối với đại thực bào, bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân và lympho bào PCV2 tác động lên những tế bào này làm suy giảm hoạt động miễn dịch trong quá trình cơ thể chống lại vi-rút Do đó, các tác nhân khác cũng có cơ hội xâm nhiễm gây bệnh, nghiêm trọng nhất là các vi-rút, vi khuẩn tấn công hệ hô hấp của heo (Thacker, 2006; Segalés, 2009)

Ở Việt Nam, nghiên cứu của Lâm Thị Thu Hương và ctv (2005), Nguyễn Thị Thu Hồng và ctv (2006) đều phát hiện vi-rút PCV2 tại các trang trại chăn nuôi heo

ở Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh phụ cận Việc đánh giá hiệu quả tiêm vắc-xin phòng PCV2 trên nái và heo con sinh ra từ nái được tiêm vắc-xin cũng đã được các tác giả thực hiện tại trại chăn nuôi heo ở Đồng Nai Phương pháp đánh giá dựa trên các chỉ tiêu sinh lý máu, dấu hiệu lâm sàng, tỷ lệ nhiễm bệnh, tỷ lệ chết … Tuy nhiên, chưa có công trình nghiên cứu đánh giá hiệu quả tiêm vắc-xin phòng PCV2 trên heo con cũng như chưa có đánh giá về phương pháp ELISA xét nghiệm hiệu giá kháng thể kháng PCV2 trên các đàn heo tại Việt Nam

Nhằm góp phần phòng bệnh do PCV2 gây ra trên heo, được sự hướng dẫn của

TS Nguyễn Tất Toàn và PGS TS Trần Thị Dân, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Khảo sát độ tin cậy của kit ELISA xét nghiệm kháng thể kháng PCV2 và đáp ứng của heo đối với vắc-xin phòng hội chứng gầy còm trên heo sau cai sữa (PMWS)”

1.2 Mục tiêu

 Khảo sát độ tin cậy của kít ELISA xét nghiệm kháng thể kháng PCV2 từ

mẫu huyết thanh heo

 Đánh giá đáp ứng của heo khi tiêm vắc-xin phòng hội chứng gầy còm

1.3 Yêu cầu

 Khảo sát hệ số biến động khi sử dụng bộ kít trên cùng một mẫu

 Khảo sát hệ số biến động ở các mức hiệu giá kháng thể

3

 Xác định hiệu giá kháng thể từ mẫu huyết thanh heo ở các thời điểm khác nhau khi tiêm vắc-xin

 Xét nghiệm các chỉ tiêu sinh lý máu và lập công thức bạch cầu

 Khảo sát số lượng tế bào trong mẫu dịch phế quản - phổi heo ở thời điểm xuất chuồng

4

Chương 2 TỔNG QUAN

2.1 Hội chứng gầy còm trên heo sau cai sữa

2.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh

Hội chứng gầy còm trên heo sau cai sữa (PMWS - Post Weaning Multisystemic Wasting Syndrome) lần đầu tiên được ghi nhận trên những đàn heo ở Canada vào năm 1996 Sau đó, từ năm 1997 đến 2002, bệnh lần lượt được tìm thấy trên các đàn heo ở Châu Á, Mỹ, Châu Âu…(Chae, 2003)

Hình 2.1 Những khu vực phát hiện có bệnh PMWS trên thế giới từ năm 1997

đến năm 2002 (Nguồn: Chae, 2003) Bệnh thường xuất hiện trên heo giai đoạn sau cai sữa với các triệu chứng sút cân, vàng da và các bệnh lý liên quan đường hô hấp Nguyên nhân gây bệnh được xác định là do porcine circovirus type 2 PCV2 có khả năng sống trong cơ thể heo

5

mà không gây biểu hiện lâm sàng Khi kết hợp với các tác nhân gây bệnh khác hoặc các điều kiện chăn nuôi không thuận lợi, vi-rút mới gây bệnh với những biểu hiện phức tạp, tỷ lệ chết từ 4 đến 30%, đôi khi tăng đến 70% (Segalés và ctv, 2002; Chae, 2003)

Tại Việt Nam, tỉ lệ nhiễm PCV2 tương đối cao và tăng qua các năm Tỷ lệ huyết thanh dương tính chiếm 38,9% năm 2000 và 96,47% năm 2006 trên 1073 mẫu huyết thanh thu nhận được từ các trại heo 8 tỉnh thành phía Nam Hiện nay, PMWS

đã trở thành một bệnh có ảnh hưởng nghiêm trọng và là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất chăn nuôi heo ở nước ta (Nguyễn Tiến Hà, 2008)

2.1.2 Dấu hiệu lâm sàng

Bệnh PMWS thường xảy ra trên heo từ 5 – 12 tuần tuổi Các dấu hiệu lâm sàng thường thấy là tình trạng heo không tăng trọng, tiêu chảy, khó thở, xuất hiện những nốt hạch ở bẹn, có thể xuất hiện triệu chứng da vàng hoặc trắng bạch (Hình 2.2) Khoảng 2% heo bệnh có tình trạng hoại tử hạch lympho, đôi khi cũng gặp trường hợp bị teo nốt hạch ở tuyến ức (Fenaux và ctv, 2000; Tucker và ctv, 2006)

Hình 2.2 Heo bệnh PMWS với biểu hiện gầy, khó thở và xuất hiện nốt hạch ở

bẹn (Nguồn: Segalés, 2009) Các dấu hiệu gia tăng nhanh chóng trong một đến hai tuần Trong giai đoạn cấp tính, tỷ lệ heo chết có thể lên đến 38% ở các nhóm heo và duy trì trên 18% ở mức

6

toàn đàn trong 3 – 5 tháng Những trang trại có sự quản lý và chăm sóc tốt, heo vượt qua giai đoạn cấp tính nhưng có thể chuyển thành dạng mãn tính, thường tiếp nối ở giai đoạn cuối của heo nuôi thịt Khi đó, tỷ lệ chết ít hơn nhưng heo vẫn không tăng trọng và chỉ đạt khoảng 30 kg so với cân nặng 100 kg ở những heo bình

thường cùng lứa tuổi

Bệnh thường đi kèm với một số bệnh khác như hội chứng rối loạn sinh sản và

hô hấp (PRRS), hội chứng viêm da suy thận (PNDS), bệnh viêm màng phổi, bệnh

cúm heo … (Chae, 2003; Tucker và ctv, 2006; Segalés, 2009)

2.1.3 Bệnh tích

2.1.3.1 Bệnh tích đại thể

Những heo bệnh chết khi mổ khám sẽ có các dấu hiệu viêm phổi kẽ, phổi dính,

có đốm phù nề, có vằn; gan, lách và nhiều hạch bạch huyết sưng to; thận sưng phồng với những đốm trắng nhỏ có thể quan sát bằng mắt; cơ quan ổ bụng bị phù

nề hay tích nước (Tucker và ctv, 2006; Segalés, 2009)

Bảng 2.1 Tỷ lệ bệnh tích ở heo bệnh PMWS

(Nguồn: Chae, 2005)

Mô

Tỷ lệ % có thương tổn (n=100) Tiêu biến tế bào

lympho

Viêm tế bào hạt

Xuất hiện các thể vùi Hạch bạch huyết vùng bẹn

7

2.1.3.2 Bệnh tích vi thể

Đối với các tế bào hạt như tế bào bạch cầu đơn nhân hoặc đại thực bào đều có

sự hiện diện của những thể vùi chứa vi-rút bên trong tế bào chất (Hình 2.3 A) Các thể vùi có dạng tròn, kích thước khác nhau, ưa base hoặc trung tính Các tế bào đơn nhân gia tăng mật độ trong gan, vùng ống thận, vùng vách ngăn túi phổi, vùng ống dẫn tuyến tụy

(A) (B)

Hình 2.3 Tế bào chứa thể vùi (A) và tế bào đa nhân (B) trên mẫu hạch bạch

huyết heo bệnh PMWS (Nguồn: Segalés, 2002)

Trong hạch bạch huyết, các tế bào B và T chết dần, gia tăng các mô bào và xuất hiện các tế bào đa nhân (Hình 2.3 B) Kháng nguyên PCV2 được phát hiện được trong hạch bạch huyết Trong phổi cũng có sự giảm dần các tế bào B, T, nhưng lại tăng các tế bào trình diện kháng nguyên và bạch cầu trung tính, các tế bào biểu mô đường dẫn khí hoại tử và tróc mảng cùng với sự xuất hiện các tế bào đa nhân (Nailly, 1999; Wikström, 2008)

Tế bào đa nhân

Tế bào chứa thể vùi

80,30 11,11 3,03

Bệnh tích đại thể

Phổi xẹp, màu nhạt Nhiễm các bệnh liên quan đến phổi

Sưng hạch bạch huyết Viêm dạ dày

Viêm thanh quản Viêm thận Gan nhỏ Viêm ruột kết

64,39 59,34

52,78

28,54 25,00 18,43 3,28 3,28

Bệnh tích vi thể

Tiêu biến tế bào lympho Hoại tử tế bào phổi Hoại tử tế bào gan

2,27 2,02 0,51

(Nguồn: Tucker và ctv, 2006)

2.2 Porcine circovirus

2.2.1 Đặc điểm và cấu trúc của Porcine circovirus

2.2.1.1 Đặc điểm

Porcine circovirus - PCV thuộc họ Circoviridae, giống Circovirus, là vi-rút có

DNA mạch vòng đơn, không vỏ bọc, nhỏ nhất với đường kính khoảng 17nm (Hình 2.4) PCV type 1 – PCV1 được Tischer và cộng sự xác định vào năm 1974 khi phát

9

hiện một loại vi-rút giống vi-rút Picorna nhiễm vào tế bào thận heo PK/15 Sau đó,

kháng thể của PCV1 được tìm thấy trong các mẫu huyết thanh heo ở Đức năm

1986, Canada năm 1989 và New Zealand năm 1991 Tuy nhiên, PCV1 không phải

là nguyên nhân gây ra bệnh PMWS Năm 1998, Allan và cộng sự phân lập được

giống Circovirus mới từ mẫu phổi, gan, thận, lách, tụy và nốt hạch bạch huyết của

heo có biểu hiện bệnh PMWS Giống vi-rút mới này có thông tin di truyền gần với PCV1, được gọi là PCV type 2 – PCV2 và là tác nhân quan trọng gây ra bệnh PMWS (Allan và ctv, 1998; Fenaux và ctv, 2000; Chae, 2003)

PCV1 có 3 nhóm phụ là 1a, 1b và 1c, hệ số lắng 57S, ổn định ở pH 3, 56 - 70°C trong 15 phút, có khả năng bị khử hoạt tính khi phơi nhiễm với chloroform Vi-rút này được xem là tác nhân không gây bệnh ở heo nên còn được gọi là vi-rút không độc lực PCV2 đã được giải trình tự vào năm 2000, có 5 nhóm phụ xếp thứ tự từ 2a đến 2e PCV2 giảm độc lực 1,6 lần nếu khử trùng bằng phương pháp khử trùng Pasteur ở 60°C trong 10 giờ, giảm 0,75 lần ở 80°C trong 72 giờ và giảm 1,25 lần ở 120°C trong 30 phút (Martijn và ctv, 2000; Sirje, 2006; Tanja và ctv, 2007)

Hình 2.4 Porcine circovirus quan sát dưới kính hiển vi điện tử

(Nguồn: Weingartl, 2002)

10

2.2.1.2 Cấu trúc

Virion của PCV có cấu trúc đối xứng 20 mặt, chứa 60 phân tử protein capsid chia làm 12 tiểu đơn vị (Hình 2.5) Protein capsid của PCV1 khoảng 36 kDa còn protein capsid của PCV2 khoảng 30 kDa (Weingartl và ctv, 2002)

Hình 2.5 Mô hình cấu trúc virion của PCV

(Nguồn: Weingartl, 2002) PCV1 và PCV2 có khoảng 75 - 76% trình tự nucleotide tương đồng và đều có tổ chức bộ gen tương tự nhau Chiều dài bộ gen PCV1 là 1758 - 1760 pb còn của PCV2 là 1767 - 1768 pb Trình tự gen của PCV2 từ các mẫu phân lập đã được giải trên ngân hàng gen cho thấy tỷ lệ tương đồng trên 95% Từ đó cho thấy, đây là type

có khả năng gây bệnh độc lập Các nucleotide không tương đồng chủ yếu nằm trong đoạn gen ORF2, có vai trò quyết định trong tương tác giữa vi-rút và tế bào chủ (Timmusk và ctv, 2006; Opriessnig và ctv, 2006)

PCV có sáu khung đọc mở ORF, trong đó, ba khung đọc mở quan trọng là ORF1, ORF2 và ORF3 (Hình 2.6)

 ORF1: là ORF lớn nhất - ORF1 và ORF2 chiếm 93% bộ gen - chứa gen rep,

mã hóa protein Rep – Replication associated protein - có khối lượng phân tử là 35,6

kDa và protein Rep’ có khối lượng phân tử 19,2 kDa Theo Wikström (2008),

11

protein Rep cần cho quá trình hình thành liên kết phosphodiester tại chẻ ba sao chép

và có chứa vùng quyết định kháng nguyên liên kết với vị trí nhận diện kháng nguyên của tế bào T (Weingartl và ctv, 2002; Wikström, 2008)

 ORF2: chứa gen cap, mã hóa protein Cap - Capsid protein Protein Cap có

nhiều tiểu đơn vị, có chức năng tự lắp ráp để hình thành capsid của virion, cho phép vi-rút có khả năng tồn tại cao trong môi trường và có khả năng kháng lại một số hóa chất xử lý thông thường, có vai trò trong miễn dịch với tế bào vật chủ Protein Cap

có chứa vùng quyết định kháng nguyên liên kết với vị trí nhận diện kháng nguyên của tế bào B (Weingartl và ctv, 2002; Timmusk và ctv, 2006; Wikström, 2008)

 ORF3: mã hóa protein ORF3, có 104 acid amin, là protein liên quan đến những đặc điểm in vitro và không liên quan đến sự sao chép của vi-rút nhưng kích hoạt quá trình apoptosis tế bào chủ (Opriessnig và ctv, 2006)

 Vùng bắt đầu sao mã của PCV2 nằm ở giữa 2 khung ORF1 và ORF2 Vùng hoạt động bao gồm 4 gen H1, H2, H3 và H4 (Wikström, 2008)

Hình 2.6 Vị trí các khung đọc mở ORF của PCV

(Nguồn: Wikström, 2008)

1768 bp ORF 1

ORF 6

ORF 3

12

2.2.2 PCV2 và hệ miễn dịch của heo

2.2.2.1 Ảnh hưởng của PCV2 lên các tế bào hệ miễn dịch

Theo Antonio và Segalés (2009), PCV2 có khả năng lẩn tránh hệ miễn dịch và thay đổi thành phần cũng như hàm lượng những chất hóa học do hệ miễn dịch điều tiết Với các tế bào tua, PCV2 làm giảm khả năng trình diện kháng nguyên, giảm khả năng nhận biết những tín hiệu nguy hiểm để có thể tiết ra các interferon cảnh báo cho cơ thể Từ đó, hệ miễn dịch sẽ không thể nhận biết các tác nhân lạ xâm nhập, kể cả PCV2 và các tác nhân gây bệnh khác

Trên đại thực bào phế nang - tế bào miễn dịch quan trọng nhất tại phổi - PCV2 làm tăng TNF-α, IL-8, AMCF-II, G-CSF và MCP-1 Các yếu tố này thúc đẩy quá trình nhân lên của tế bào, giúp vi-rút lan rộng Mặt khác, trong thí nghiệm in vitro, Chang và ctv (2006) nhận thấy các đại thực bào phế nang nhiễm PCV2 lại giảm sự hình thành các gốc tự do O2 và H2O2 Do đó, các tế bào này không có khả năng tiêu

diệt nấm Candida albicans McNeilly và ctv (1996) cũng ghi nhận được sự tăng

biểu hiện MHC lớp I trên tế bào này sau 4 ngày nhiễm PCV2 và giảm biểu hiện MHC lớp II sau 8 ngày nhiễm Điều này làm giảm khả năng trình diện kháng nguyên của đại thực bào phế nang cho tế bào lympho, vì vậy, hệ miễn dịch không thể nhận biết các yếu tố xâm nhiễm để thực hiện các hoạt động bảo vệ cơ thể (McNeilly và ctv, 1996; Chang và ctv, 2006; Antonio và Segalés, 2009)

Đối với các tế bào máu đơn nhân ngoại vi, PCV2 làm giảm IL-4 và IL-2, đồng nghĩa với việc giảm quá trình kích thích tăng sinh tế bào T Đồng thời, PCV2 làm tăng quá trình tiết IL-10, IL-1β và IL8 và IFN-α Trong đó, IL-10 là yếu tố ức chế tiết các cytokine IL-12, IFN-γ và IL-2, từ đó làm mất khả năng điều hòa đáp ứng miễn dịch của các tế bào máu đơn nhân ngoại vi Trong thử nghiệm exvivo, nồng

độ IL-10 trong huyết thanh heo tăng cao thường xảy ra cùng với giai đoạn phát triển thành bệnh PMWS

Theo Vincente và ctv (2007), ảnh hưởng của PCV2 lên các tế bào miễn dịch phụ thuộc rất nhiều vào kháng nguyên của vi-rút, quan trọng nhất là các đoạn CpG-

ODN trong gen Rep Nồng độ rất ít của dsDNA cùng với kháng nguyên hình thành

13

trong quá trình sao chép vi-rút đã có thể tác động ức chế hoạt động của tế bào tua Ngược lại, quá trình ức chế biểu hiện IL-2 và IFN-γ ở các tế bào máu ngoại vi giảm mạnh khi loại bỏ đoạn CpG-ODN của vi-rút

2.2.2.2 Đáp ứng miễn dịch ở heo bệnh PMWS

Đối với heo khỏe mạnh, lượng bạch cầu trong máu khoảng 12000 tế bào/mm3 Trong đó, chiếm 45 - 50% là bạch cầu trung tính, 40 – 50% là bạch cầu lympho, còn lại là các bạch cầu ưa acid (2 – 3%), ưa base (0 – 8%), bạch cầu đơn nhân (2 – 6%) (Trần Thị Dân và Dương Nguyên Khang, 2006) Heo bệnh PMWS làm gia tăng số lượng bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân trong hệ tuần hoàn, làm thay đổi tỷ lệ bình thường giữa tế bào lympho và bạch cầu trung tính (Hình 2.7) (Segalés, 2009)

Các thương tổn ở hạch lympho bao gồm quá trình tiêu biến tế bào B, T, tăng số lượng đại thực bào, mất dần hoặc phân bố lại vị trí nang bên trong của các tế bào tua Quá trình tiêu biến tế bào B tăng mạnh từ ngày thứ bảy sau khi nhiễm PCV2, trong khi các tế bào T mới bắt đầu chết Đến khi các triệu chứng lâm sàng biểu hiện

rõ, hệ miễn dịch hầu như mất hoàn toàn các tế bào B và T cùng với sự chết tổng thể các tế bào giết tự nhiên Tế bào T nhớ là các tế bào chịu ảnh hưởng đầu tiên và mạnh mẽ nhất, sau đó là các tế bào T gây độc và tế bào Tγδ Cơ chế gây chết các tế bào lympho của PCV2 có liên quan đến sự gia tăng nồng độ vi-rút Tế bào nhiễm PCV2 thay đổi hình thái theo hướng thoái hóa dần và dẫn đến quá trình apoptosis (Opriessnig và ctv, 2007; Antonio và Segalés, 2009)

So sánh hàm lượng các kháng thể Ig trên heo nhiễm PCV2, Segalés và ctv (2005) nhận thấy hàm lượng IgM cao hơn IgG vào giai đoạn khoảng 21 ngày đầu tiên sau nhiễm Khoảng 20 - 50 ngày sau nhiễm, cùng với sự lan rộng của vi-rút, hàm lượng IgM giảm dần, IgG tăng dần Vào giai đoạn cuối, IgG thay thế hoàn toàn IgM trong hệ miễn dịch

Tăng sản xuất IL-10

Giảm lympho B Giảm lympho T Tăng bạch cầu đơn nhân Tăng bạch cầu hạt Tăng IL-10, IFN-

Giảm lympho B, lympho T Tăng tế bào trình diện kháng nguyên Tăng bạch cầu trung tính

Giảm IFN-, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12

Bảy ngày sau nhiễm, cơ thể heo xuất hiện các thể vùi chứa vi-rút Hàm lượng vi-rút tăng dần và đạt cao nhất trong khoảng 14 – 21 ngày sau nhiễm Thời gian này, PCV2 có thể hiện diện trong nhiều cơ quan, nhưng chiếm tỷ lệ cao nhất là trong các mô bạch huyết Bên cạnh đó, PCV2 cũng được phát hiện trong các tế bào biểu mô thận, tế bào phổi, tế bào tụy và thực quản

Để sao chép và nhân lên, PCV2 cần DNA polymerase của tế bào chủ Vì vậy, các tế bào có tốc độ phân bào cao và đang vào pha S của chu kỳ tế bào sẽ là những

tế bào hiệu quả cho vi-rút (Hình 2.8) Các thí nghiệm xác định được mRNA của gen

cap trong quần thể tế bào máu ngoại vi và nốt hạch lympho tại phổi Các thí nghiệm

cũng chứng minh rằng các tế bào máu ngoại vi được kích thích với Concanavalin A (Con A) thì nhạy cảm với quá trình sao chép của vi-rút hơn Hơn nữa, đặc điểm của quần thể các tế bào như tế bào T và tế bào B cho thấy khả năng chống lại được sự sao chép của vi-rút, còn các tế bào máu ngoại vi như tế bào bạch cầu đơn nhân, đại thực bào lại không có khả năng này Do đó, đây là các tế bào bị xâm nhiễm đầu tiên

và cũng là các tế bào đích để vi-rút nhân lân và lan rộng Khi đó, đáp ứng miễn dịch suy giảm và mất những kháng thể trung hòa đặc hiệu PCV2, dẫn đến thương tổn ở

tế bào lympho và thay đổi hệ miễn dịch biểu hiện rõ nét trên những heo bệnh PMWS

16

Hình 2.8 Quá trình PCV2 phát triển trong tế bào

(Nguồn: Weingartl, 2002)

Đối với heo trong thời kỳ bú đến giai đoạn trưởng thành, tỷ lệ heo nhiễm PCV2

và hàm lượng vi-rút tăng dần và trùng hợp với thời gian hết dần kháng thể kháng PCV2 từ mẹ (MDA) Tỷ lệ lây nhiễm cao hơn khi heo đã vào giai đoạn biểu hiện bệnh với hàm lượng vi-rút cao trong huyết thanh, xuất hiện nhiều các nốt hạch cùng với thể trạng yếu hơn hẳn khi so sánh với giai đoạn cận lâm sàng

Tuần thứ 2- 3 sau nhiễm, đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với PCV2 đã hình thành

Ở những heo đã phát triển hệ miễn dịch hoàn chỉnh và được chăm sóc tốt, chúng có

Vi-rút tấn công và xâm nhập

Bỏ lớp vỏ capsid

Bộ gen vi-rút vào bên trong nhân nhờ quá trình phân bào

Sao mã gen rep ( pha G1)

mRNA của gen rep

Phiên mã tổng hợp protein Rep

Pha S

Tạo bản sao DNA

Phiên mã tổng hợp protein capsid Ghép DNA vào vỏ capsid

Chuyểnvào nhân

Virion giải phóng khỏi nhân

Virion giải ghóng khỏi tế bào chủ

17

khả năng tránh được quá trình chuyển thành bệnh PMWS nhờ sản xuất được kháng thể kháng PCV2 Khi đó, các triệu chứng duy trì ở trạng thái tiềm ẩn với hàm lượng vi-rút rất thấp, có rất ít hoặc không có các bệnh tích xuất hiện trong hệ thống miễn dịch Tuy nhiên, thể vùi chứa vi-rút vẫn tồn tại một thời gian dài ở các mô trong cơ thể (Weingartl, 2002; Vincente và ctv, 2003; Antonio và Segalés, 2009)

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát triển bệnh PMWS

Yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến quá trình phát triển bệnh PMWS ở heo nhiễm PCV2 là các tác động lên hệ miễn dịch của heo Các kích thích này có thể là các tác nhân đồng nhiễm, vắc-xin, hoặc các sản phẩm kích thích hệ miễn dịch khác Các trường hợp heo nhiễm duy nhất PCV2 thường chỉ dẫn đến những dấu hiệu tiềm

ẩn Tuy nhiên, khi nhiễm đồng thời với PRRSV, SIV, PPV, Mycoplasma hyopneumoniae…, PCV2 tăng nhanh tốc độ sao chép và tiến triển thành bệnh

PMWS Năm 2002, trên 484 heo nhiễm PCV2 và có biểu hiện bệnh rõ nét,

Opriessnig và ctv đã ghi nhận được 251 trường hợp (52%) có PRRSV, 172 trường

hợp (36%) có M hyopneumoniae, vi khuẩn nhiễm trùng máu và phổi ở 105 trường

hợp (22%), nhiễm SIV có 26 trường hợp (5,4%) và chỉ có 9 trường hợp (2%) nhiễm

PCV2 duy nhất (Hình 2.9) (Opriessnig và ctv, 2002; Chang và ctv, 2003; Chae,

2005)

Bên cạnh đó, các yếu tố di truyền, tình trạng sức khỏe của heo cũng ảnh hưởng đến quá trình phát triển của bệnh Heo trong điều kiện chăm sóc kém thường diễn tiến bệnh nhanh và trầm trọng hơn Bản thân nguồn gốc vi-rút cũng có những tác động khác nhau Các vi-rút PCV2 phân lập từ heo bệnh hình thành nhiều thể vùi vi-rút trong tế bào hơn các PCV2 phân lập từ quá trình nuôi cấy ở phòng thí nghiệm Tác giả Fenaux và ctv (2004) cho rằng có sự đột biến hai acid amin ở protein Cap khi PCV2 được nuôi cấy Sự biến đổi này gây ảnh hưởng quan trọng đến độc lực và

sự xâm nhiễm của vi-rút Đồng thời, tác giả cũng ghi nhận PCV nhóm phụ 2b có độc lực cao hơn PCV nhóm phụ 2a

18

Hình 2.9 Các trường hợp đồng nhiễm với PCV2 ở Mỹ (n=484)

(Nguồn: Opriessnig, 2002)Cuối cùng là các điều kiện chăn nuôi và chuồng trại Mật độ chăn nuôi quá dày trong những điều kiện chăm sóc kém, thành phần thức ăn và không gian sống không đầy đủ cũng là những yếu tố góp phần thúc đẩy tiến triển của bệnh

2.3 Chẩn đoán bệnh PMWS và phát hiện PCV2

2.3.1 Chẩn đoán bệnh PMWS

Theo Antonio và Segalés (2009), việc chẩn đoán PMWS ở mức cá thể dựa trên

ba dấu hiệu: (i) có các dấu hiệu lâm sàng liên quan PMWS, trong đó dấu hiệu quan trọng nhất là chậm lớn và sụt cân, (ii) có những thương tổn mô bệnh học, điển hình

là tiêu biến tế bào lympho, (iii) tìm thấy kháng nguyên PCV2 trong các hạch bạch huyết

Các chẩn đoán cận lâm sàng cũng cần thiết khi hàm lượng PCV2 nhiễm trong máu và mô thấp dưới 107 bản sao trong một ml, đồng thời những biểu hiện bệnh tích bên ngoài ít hoặc không có

92 68 37 11 0

PCV2 + SIV + M.hyo PCV2 + M.hyo PCV2 + Vi khuẩn nhiễm trùng máu PCV2 + Vi khuẩn viêm phổi PCV2 + các tác nhân khác

MH MH

MH

19

Trong thực tế, việc chẩn đoán bệnh dựa trên hai yếu tố Thứ nhất là tỷ lệ chết cả đàn tăng gấp 1,66 lần so với tỷ lệ cách đó ba tháng gần nhất Nếu không có số liệu theo từng tháng thì khi tỷ lệ chết trên 50% toàn đàn là có thể xác định trang trại nhiễm PMWS Yếu tố thứ hai là có ít nhất năm cá thể heo được chẩn đoán PMWS

ở mức cá thể

2.3.2 Các phương pháp phát hiện PCV2

PCV2 có thể được phát hiện trực tiếp dựa trên kháng nguyên, acid nucleic của vi-rút có trong mẫu huyết thanh, mẫu phân, mô hạch bạch huyết hoặc phát hiện gián tiếp thông qua kháng thể kháng PCV2 có trong mẫu huyết thanh heo Theo Opriessnig (2007), hiện nay có một số phương pháp để xác định PCV2 sau:

 Xác định kháng nguyên PCV2 bằng phương pháp IHC, IFA, ELISA liên kết kháng nguyên Các phương pháp chủ yếu dùng kháng thể đa dòng hoặc đơn dòng cho bắt cặp với kháng nguyên PCV2 từ các mẫu ly trích Phương pháp phân lập vi-rút có thể nuôi cấy invitro trên dòng tế bào PK-15 để theo dõi quá trình xâm nhiễm lây lan, hoạt động của vi-rút

 Xác định acid nucleic của PCV2 bằng phương pháp PCR và ISH: có thể xác đinh trực tiếp DNA của vi-rút từ mẫu máu Nhiều phương pháp PCR được ứng dụng với các cặp mồi đặc hiệu phát hiện đơn hoặc đa các chủng vi-rút Phương pháp ISH cũng được sử dụng phát hiện đồng thời PCV1/PCV2, PCV2/PRRSV hay PCV2/PPV… Một số phương pháp khác như RFLP và giải trình tự cũng được áp dụng để phát hiện trực tiếp chủng vi-rút xâm nhiễm cũng như nghiên cứu vai trò của các tổ hợp gen của chúng để phục vụ cho công tác phòng ngừa và điều trị

 Các phương pháp xác định kháng thể kháng PCV2 trong huyết thanh bao gồm: phát hiện kháng thể huỳnh quang gián tiếp, phương pháp IMPA, phương pháp ELISA, và phương pháp trung hòa vi-rút Sự tồn tại của kháng thể kháng PCV2 trong huyết thanh heo là tương đối dài, đủ thời gian để có thể phát hiện mầm bệnh trên toàn đàn

độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện (Crowther, 2001)

Có 4 phương pháp ELISA cơ bản: ELISA trực tiếp, ELISA gián tiếp, ELISA gắn kẹp trực tiếp và ELISA gắn kẹp gián tiếp Nguyên tắc các phương pháp này được minh họa trong Hình 2.10 và Hình 2.11

Trên nền tảng này, nhiều phương pháp ELISA khác phát triển như ELISA cạnh tranh trực tiếp/gián tiếp để phát hiện kháng nguyên/kháng thể, ELISA ức chế trực tiếp/gián tiếp phát hiện kháng nguyên/kháng thể, ELISA gắn kẹp cạnh tranh trực tiếp/gián tiếp phát hiện kháng nguyên/kháng thể Tùy vào đối tượng, mục đích thí nghiệm và khả năng thực hiện mà chọn lựa phương pháp phù hợp nhất Điều quan trọng là kỹ thuật, phương pháp, dụng cụ, thiết bị và kinh nghiệm của người kỹ thuật viên để có thể có được kết quả chính xác nhất (Crowther, 2001)

 Cách xác định độ tin cậy của phương pháp ELISA

Theo Crowther (2001), ưu điểm của phương pháp ELISA là có thể thực hiện trên một số lượng mẫu lớn và có khả năng phát hiện được kháng thể trong huyết thanh ở một hàm lượng thấp Tuy nhiên, ELISA lại có một số nhược điểm là có thể xảy ra hiện tượng liên kết chéo giữa các kháng nguyên hoặc các kháng thể gắn trong giếng Mặt khác, các liên kết không đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể

có thể cho kết quả dương tính giả và khi nồng độ mẫu quá cao có thể xảy ra hiệu ứng Hook cho kết quả âm tính giả Vì vậy, để có một quy trình ELISA hoàn chỉnh, trước hết, cặp kháng nguyên/kháng thể lựa chọn khi thiết kế phải có liên kết đặc hiệu với nhau và quy trình ELISA phải được thực hiện khảo sát hệ số biến động, độ nhạy và độ đặc hiệu ở những thí nghiệm lặp lại có ý nghĩa về mặt thống kê

21

Hình 2.10 Nguyên tắc phản ứng của phương pháp ELISA trực tiếp (A) và

ELISA gián tiếp (B) (Nguồn: Crowther, 2001)

22

(A) (B)

Hình 2.11 Nguyên tắc phản ứng của phương pháp ELISA gắn kẹp trực tiếp

(A) và ELISA gắn kẹp gián tiếp (B) (Nguồn: Crowther, 2001)

Theo các khuyến cáo của Công ty Công nghệ sinh học Milipore và Công ty Invitrogen, độ tin cậy của một quy trình ELISA có thể xác định qua các xét nghiệm như sau:

Rửa