Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4 Phương pháp tiến hành
3.4.2 Khảo sát độ tin cậy của kít ELISA
Quy trình ELISA được thực hiện được bằng Bộ kit SERELISA® PCV2 Ab Mono Blocking do tập đoàn Synbiotics sản xuất. Bộ kít đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu đánh giá đáp ứng của heo sau khi tiêm vắc-xin tại Hàn Quốc, Anh, Mỹ…nhưng chưa từng được sử dụng để xác định hiệu giá kháng thể kháng PCV2 trong các mẫu huyết thanh heo tại Việt Nam. Chính vì thế, cần đánh giá độ tin cậy của bộ kít nhằm tối ưu hóa quy trình để có thể xác định chính xác hiệu giá kháng thể trong các mẫu huyết thanh từ các đàn heo tại Việt Nam.
3.4.2.2 Dụng cụ, hóa chất và mẫu khảo sát
Dụng cụ
Micropipet, đầu tip đã khử trùng
Ống nghiệm không chứa chất kháng đông
Máy lắc, máy đo OD, máy ly tâm
34
Hóa chất:
Bộ Kit SERELISA PCV2 Ab Mono Blocking (của tập đoàn SYNBIOTICS - Pháp) xác định hiệu giá kháng thể kháng PCV2 trong huyết thanh.
Mẫu khảo sát
Mẫu huyết thanh dùng khảo sát hệ số biến động trong quy trình ELISA được lấy từ 5 heo chọn ngẫu nhiên trong đàn heo ở trại A từ 14 đến 21 ngày tuổi.
Mẫu huyết thanh dùng khảo sát hệ số biến động ở 3 mức hiệu giá kháng thể được lấy ngẫu nhiên từ các mẫu có kết quả xác định hiệu giá kháng thể cao (5000 – 15000 Eu), vừa (2000 – 5000 Eu) và thấp (<2000 Eu) bằng quy trình ELISA của nhà sản xuất.
3.4.2.3 Phương pháp thực hiện
Phương pháp lấy mẫu huyết thanh: Lấy khoảng 2 ml máu heo vào ống nghiệm không chứa chất kháng đông và để máu đông tự nhiên trong 30 phút. Sau đó, tách huyết thanh bằng cách ly tâm 3000 vòng/phút trong thời gian 5 phút. Loại bỏ cặn và lưu giữ dịch huyết thanh ở tủ đá -20OC đến khi tiến hành thí nghiệm.
Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể theo quy trình ELISA do nhà sản xuất cung cấp, gồm 3 bước:
(i) Mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm được pha loãng ở 3 nồng độ là 1:100; 1:1000;
và 1:10000 bằng dung dịch pha loãng mẫu (SD), sau đó phân bố mẫu vào các giếng gắn kháng nguyên PCV2 tinh sạch. Phủ phim dính lên các giếng, lắc nhẹ đĩa và ủ các giếng trong 1 giờ ± 5 phút ở 37oC ± 3oC. Nếu có sự hiện diện của kháng thể kháng PCV2 (Ab1) trong mẫu huyết thanh, kháng thể sẽ liên kết với kháng nguyên.
(ii) Phối 100μl dung dịch conjugate- peroxidase kháng PCV2 (CJ) đã pha loãng với dung dịch pha loãng (CD) theo tỷ lệ 1:100 vào mỗi giếng, phủ phím dính và ủ trong 1
35
giờ ± 5 phút ở 37oC ± 3oC. Nếu mẫu thí nghiệm không có kháng thể kháng PCV2, conjugate - peroxidase kháng PCV2 sẽ liên kết với kháng nguyên. Để sử dụng cho 1 đĩa 96 giếng cần khoảng 10000 μl dung dịch conjugate đã pha loãng.
(iii) Sau khi rửa các thành phần không liên kết, cơ chất peroxidase (PS) được thêm vào sẽ chuyển conjugate – peroxidase thành một sản phẩm có màu sau 30 phút 5phút ủ ở 20oC 5oC. Cuối cùng thêm dung dịch kết thúc vào mỗi giếng.
Kết quả được xác định bằng giá trị OD ở bước sóng 450 nm. Kết quả là hợp lý nếu OD trung bình của đối chứng âm (N) > 0,5 và OD trung bình của đối chứng dương (P)
< 0,3.
Kết quả được tính dựa theo công thức
Log (titer) = a + b x Logit (SNc) Hoặc Titer = 10 (a +b x Logit (SNc))
SNc =
) ( ) (
) ( ) (
P OD N
OD
P OD S OD
Với a = 2,5; b = - 0,70
Trong đó, SNc (Sample to Negative corrected ratio) được tính riêng cho từng độ pha loãng. Nếu SNc (1:10000)> 0,5 kết quả là âm tính. Nếu SNc (1:10000)< 0,5 kết quả là dương tính. Khi đó dựa vào kết quả cụ thể mà hảm lượng kháng thể được tính như sau:
Nếu SNc (1:10000) < 0,0976 , hàm lượng > 15000 đơn vị ELISA (Eu). Nếu SNc (1:10000) nằm trong khoảng từ 0,0976 đến 0,7437, hiệu giá kháng thể được tính bằng công thức
Hàm lượng = 10 x 10a + b x log SNc (1:10000)
Nếu Nếu SNc (1: 10000) > 0,7437, kết quả được căn cứ trên SNc (1: 1000). Nếu SNc (1: 1000) < 0,7437, hiệu giá kháng thể tính bằng công thức:
Hàm lượng =10a + b x log SNc (1:1000)
36
Nếu SNc (1: 1000) > 0,7437, kết quả xét tiếp trên giá trị SNc (1: 100). Nếu SNc (1:
100) > 0,95, hiệu giá kháng thể bằng 0. Nếu SNc (1: 100) < 0,95, hiệu giá kháng thể tính bằng công thức
Hàm lượng =10a + bx log SNc (1:100)
Phương pháp đánh giá độ tin cậy
Độ tin cậy của bộ kít được đánh giá dựa vào hệ số biến động của kết quả xác định hiệu giá kháng thể qua 2 bước.
- Bước 1: Đánh giá hệ số biến động của quy trình
Đánh giá hệ số biến động của quy trình được tiến hành trước khi bố trí các thí nghiệm xác định hiệu giá kháng thể. Năm mẫu huyết thanh được lấy từ 5 heo giai đoạn 14 – 21 ngày tuổi, chọn ngẫu nhiên trong đàn heo ở trại A. Quy trình ELISA được thực hiện hoàn toàn giống nhau theo đúng quy trình do nhà sản xuất cung cấp, trong cùng một điều kiện nhiệt độ, thời gian ủ. Mỗi mẫu được lặp lại 3 lần, từ đó tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của hiệu giá kháng thể ở mỗi mẫu.
- Bước 2: Đánh giá hệ số biến động ở ba mức hiệu giá kháng thể
Sau khi xác định hiệu giá kháng thể kháng PCV2 trên mẫu huyết thanh heo ở các giai đoạn tiêm vắc-xin khác nhau, kết quả được phân làm 3 nhóm: nhóm có hiệu giá kháng thể cao, trung bình và thấp. Ở mỗi nhóm, chọn ngẫu nhiên 3 mẫu ở lô đối chứng và 3 mẫu ở lô thí nghiệm để xác định lại hiệu giá kháng thể với quy trình ELISA. Tính hệ số biến động ở ba mức hiệu giá kháng thể này.
Đồng thời, trong quá trình thực hiện, theo dõi các trường hợp bất thường về chất lượng mẫu, điều kiện thí nghiệm, kết quả khảo sát … ghi nhận các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình và định hướng khắc phục để tối ưu hóa quy trình ELISA do nhà sản xuất cung cấp.
37 3.4.2.4 Các chỉ tiêu theo dõi và công thức tính
Các chỉ tiêu theo dõi gồm hệ số biến động của quy trình sau 3 lần lặp lại và hệ số biến động ở 3 nhóm hiệu giá kháng thể.
Công thức tính:
Số liệu hiệu giá kháng thể được xử lý bằng phần mềm của hãng Synbiotic cung cấp.
Hệ số biến động (CV) được tính theo công thức như sau CV% = (SD/X ) x 100 Trong đó X là giá trị trung bình giữa các lần khảo sát SD là độ lệch chuẩn