2.3 Chẩn đoán bệnh PMWS và phát hiện PCV2
2.3.3 Phương pháp ELISA dùng trong phát hiện PCV2
2.3.3.2 ELISA dùng trong phát hiện PCV2
Hiện nay, có nhiều kít ELISA dùng phát hiện PCV2 trên thị trường. Kit
“SERELISA® PCV2 Ag Capture” của hãng Synbiotics, Mỹ dùng phương pháp ELISA gắn kẹp phát hiện kháng nguyên PCV2 từ mẫu phân. Kit “Porcine Parvovirus Antibody ELISA Test” của hãng Ivshiyuan Biotechnology dùng phương pháp ELISA trực tiếp phát hiện kháng thể kháng PCV2 trong huyết thanh. Kit “Ingezim PCV IgG®
and Ingezim PCV IgM®” của hãng Ingenasa, Tây Ban Nha xác định các giai đoạn nhiễm PCV2 dựa trên tỷ lệ IgM và IgG trong mẫu huyết thanh … Thông dụng nhất là các kít phát hiện kháng thể trong huyết thanh nhờ kháng nguyên đặc hiệu gắn sẵn trong giếng. Kháng nguyên có thể là PCV2, đoạn gen ORF2, protein Cap tinh sạch hoặc tái tổ hợp từ các vector biểu hiện hoặc sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu với PCV2 …
24
Phương pháp ELISA gián tiếp dùng kháng nguyên là protein ORF2 tinh sạch được Blanchard (2003) tiến hành trên 322 mẫu huyết thanh thu nhận từ các trại heo ở Anh.
Kết quả được so sánh với phương pháp IPMA (Immuno Peroxidase Monolayer Assay) cho thấy độ đặc hiệu là 94,5%, độ nhạy là 98,2%. Phương pháp ELISA cạnh tranh dùng PCV2 tinh sạch là kháng nguyên, dùng kháng thể đơn dòng đặc hiệu PCV2 là chất cạnh tranh cũng được Walker tiến hành trên 484 mẫu huyết thanh năm 2000. Kết quả được so sánh với phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp cho thấy độ đặc hiệu là 97,14%, độ nhạy là 99,58% (Walker và ctv, 2000; Blanchard và ctv, 2003).
Bên cạnh đó, năm 2008, Patterson và ctv đã tiến hành một thí nghiệm so sánh độ tin cậy của ba kít ELISA trên 55 heo 3 tuần tuổi được chia làm 7 nhóm. Nhóm 1 (n=7) âm tính hoàn toàn với PCV2, 3 nhóm tiếp theo (n=8/nhóm) lần lượt được nhiễm với PCV2a, PCV2b và PCV1, 3 nhóm cuối cùng (n=8/nhóm) lần lượt được tiêm vắc-xin Ingalvac CircoFLEX, Circumvent PCV2 và Suvaxyn PCV2 One Dose. Mẫu máu thu nhận mỗi tuần và tiến hành với 3 phương pháp ELISA: (i) ELISA gián tiếp có giếng phủ kháng nguyên ORF2 tái tổ hợp của PCV2a, (ii) ELISA cạnh tranh có giếng phủ kháng nguyên PCV2 tinh sạch, (iii) ELISA bắt giữ có giếng phủ với kháng thể đơn dòng đặc hiệu với IgG của heo và dùng kháng nguyên là protein PCV2b tái tổ hợp của PCV2b. Kết quả được tác giả so sánh với phương pháp kháng thể gián tiếp phát huỳnh quang IFAT (Indirect Fluorescent Antibody test), xử lý với phân tích nghiên cứu tiên lượng ROC (Receiver operating characteristic) và biểu diễn dưới giá trị AUC. Giá trị AUC trong ba phương pháp ELISA của tác giả lần lượt là 0,94; 0,97 và 0,96, không chệnh lệch nhiều so với AUC của phương pháp IFAT là 0,98. Điều này chứng tỏ các phương pháp ELISA có độ chính xác cao và có thể áp dụng trong thực tế kiểm tra lâm sàng (AUC < 0,6 thì thí nghiệm không được áp dụng trong thực tế). Mặc khác, tác giả cũng kết luận không có sự khác biệt trong kết quả xác định kháng thể kháng PCV2a và 2b và không có phản ứng với kháng thể kháng PCV1 (Patterson và ctv, 2008).
25
Qua nhiều công trình nghiên cứu, các tác giả đều cho thấy phương pháp ELISA dùng kháng nguyên là ORF2, protein Cap tinh sạch hoặc tái tổ hợp đều có khả năng phát hiện kháng thể kháng PCV2 có trong huyết thanh. Mặc dù ELISA có độ chính xác thấp hơn so với các kỹ thuật phát hiện trực tiếp kháng nguyên trên mẫu như IPMA, IFAT, PCR… nhưng với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phương pháp này có thể dùng để chẩn đoán nhiễm PCV2 trên quần thể lớn, sàng lọc PCV2 bằng miễn dịch, đồng thời là công cụ hữu ích cho việc kiểm tra sự thay đổi huyết tranh trong quá trình tiêm vắc-xin (Walker và ctv, 2000; Blanchard và ctv, 2003; Patterson và ctv, 2008).
2.3.3.3 Kit ELISA dùng trong đề tài
Đề tài sử dụng Kít “SERELISA PCV2 Ab Mono Blocking” của hãng Synbiotics dùng phát hiện kháng thể kháng PCV2 trong huyết thanh. Kít dựa trên kỹ thuật ELISA gián tiếp. Kháng nguyên PCV2 tinh sạch được gắn vào giếng sẽ liên kết đặc hiệu với kháng thể kháng PCV2 có trong mẫu huyết thanh. Những mẫu không có kháng thể, kháng nguyên sẽ được liên kết với phức hợp peroxidase/kháng thể kháng PCV2 và làm đổi màu cơ chất thêm vào. Dựa trên giá trị mật độ quang đo được để xác định hiệu giá kháng thể có trong mẫu ban đầu.
Bộ kít đã được Psikal và ctv (2006) thử nghiệm trên 22 mẫu huyết thanh heo sạch bệnh và có biểu hiện PMWS, đồng thời so sánh với phương pháp ELISA gián tiếp dùng protein capsid phân lập từ PCV2. Tác giả cho thấy không có sự khác biệt trong kết quả định tính, định lượng hiệu giá kháng thể giữa hai phương pháp. Trong các nghiên cứu đánh giá đáp ứng miễn dịch của heo với vắc-xin, các tác giả Kim và ctv (2009), Choi và ctv (2009) … đều sử dụng kít ELISA này để xác định hiệu giá kháng thể song song với các phương pháp IHC, PCR.