NUÔI cấy tếbào ĐỘNG VẬT(ANIMAL CELL CULTURE)

1 NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT (ANIMAL CELL CULTURE) -T -T -T T 1.1 Một số khái niệm [cell culture] Các t bào có th z m t dòng t ã c l y từ kh ọ c thi t l trình t nhân tạo y th c p (subculture/ secondary culture) c tách riêng ngu n g c từ u ki n Mô T ọ - p (primary culture) c tách từ cm l ọ uôi c ạn nuôi c y sau t bào u ki n thích h ạt p (primary culture) T ã in vivo, in vitro - th c p (subculture/ secondary culture) sau c p (subculture/ secondary culture) ằ c c y chuy n l u (first pasage) Sau l n c y chuy u tiên, qu n th t c coi m t dòng t bào Có loại dòng t bào: dòng t bào phân chia hạn ch (finite cell line) dòng t bào b t t Dòng t bào phân chia hạn ch ừ Dòng t bào b t t T dạng, ngu n g c bi u hi n c a t nuôi c y in vitro t bào (hình ng v t n: - Dạng nguyên bào s ng ỡng c c ho dạng thuôn dài, liên k t v i ch t n n nh 2) c, - Dạng bi u mô, t tv HeLa t thành n - Dạng nguyên bào lympho: ng ni c y hình ng s ng trơi bào lympho T i u ki n nuôi c y 1.2 Đ u ki n nuôi c -M c y có ch … - Cá ng nhân tạ c nuôi c y, ng nuôi ỡng c n thi t (a.amin, carbonhydates, vitamin, ch t ng, hocmon u ki n hóa lý (pH, áp su t thẩm th u, nhi … - D ng c ch a t 1.2.1 Môi trường nuôi cấy Một ố i ôi trườ ôi ấ t ườ … ng nuôi c amin, vitamin, mu ng t t mô huy - ch a axit ng ph c b sung ng huy t thanh: M t s thí nghi m s d ng ng huy t Do tác d ng ph không mong mu n T trì s ng c a t n ph c b sung ch t ỡng nhân t có ngu n g c từ ng v t, v y sung huy t T - ng không huy t thanh: loạ ng s d ng m t s ch ỡ thay th hoàn toàn huy t Các loại t bào s d ng bao g m: t bào nuôi c p, t s n xu t protein tái t h p, m t s dòng t bào lai, t bào trùng, m t s dòng t s n xu t virus Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) Institute) Media 1640 (RPMI-1640) T ỡ acid amin, Glycine, L-Arginine hydrochloride, L-Cystine, L-Glutamine, L-Histidine hydrochloride, L-Isoleucine, L-Leucine, LLysine hydrochloride, L-Methionine, L-Phenylalanine, L-Serine, LThreonine, L-Tryptophan, L-Tyrosine disodium salt dihydrate, L-Valine, Choline chloride, D-Calcium pantothenate, Folic Acid, Niacinamide, Pyridoxine hydrochloride, Riboflavin, Thiamine hydrochloride, i-Inositol, Calcium Chloride (CaCl2), Ferric Nitrate, Magnesium Sulfate, Potassium Chloride, Sodium Bicarbonate, Sodium Chloride, Sodium Phosphate monobasic D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate 1.2.2 Huyết ọng, ngu n cung c p nhân t ng, bám dính, hoocmon, lipid, khống ch … bào môi u n t mang lipid, enzym, vi ch t ng ni c n tính th m c a màng t bào hoạ ỡng m t nguyên t cho t bào Tuy n c hi c chuẩn n m t s hi u ng không mong mu n ng và/ho c ch a m t vài ã dòng t bào ẩ 1.2.3 pH H u h t t ng v ng t t pH 7,4 M t vài dòng t bào chuy n dạng lạ ng t ng có pH axit nhẹ (7.0 – ; t vài dòng nguyên bào s ng lại phát tri n t t tạ ng ki m nhẹ (7.4 – 7.7) Các dòng t bào côn trùng ng pH 6.2 dung d ng nuôi c c bicarbonate (HCO3-) 1.2.4 CO2 C n s d ng ngu n CO2 bên v i n c y 5-7% M i loạ ng s thích h p v i n pH chuẩn CO2 trì t CO2 bicarbonate 1.2.5 Nhiệt độ Nhi tách từ nuôi c y ph thu c vào thân nhi t c a cá th mà t ừng t n H uh tt Các t bào từ ng v ng v t máu lạ c trì c 30-37oC ng có ph nhi t r ng, từ 15 – 26oC T nhi u so v i s gi m nhi th t chút so v i nhi S t s nghiêm trọ nuôi c y Do v t nhi t 1.2.6 Thiết bị dụng cụ nuôi cấy tế bào  Các thi t b n : - T hood (hay gọi t c y t bào) dùng nuôi c y t bào (laminar flow ho c biosafety cabinet): Cung c p khu v c làm vi c vơ trùng Có ba loại bao g m: loại I, II III (Class I, II and III) Trong nuôi c y t ng, s d ng t loại II - T c - B nhanh m CO2 (humid CO2 incubator recommended) ng thích h p cho s ng c a t bào n nhi t (water bath) - Máy li tâm (centrifuge) cung ã - T lạnh (4oC -20oC) - D ng c m t bào (cell counter or hemacytometer) - Kính hi c - B ng - N i h p kh trùng - M t s thi t b khác: B ,m  D ng c - D ng c ch a t bào (chai nuôi c u gi … - Pipet cỡ - n (Pipet aid) - B - H u kim tiêm loại ng ch t th i thí nghi m  Hóa ch t: - I ng ni c … - Huy t (serum) - Các y u t b sung: L- … - Trypsin-EDTA - PBS kh trùng c kh trùng/kh ion 1.3 Một số T ươ nuôi cấy tế bào dạng ni c y: bám dính trơi n i  Ni c y bám dính (adherent culture): t l m t nhân tạo - Ni c y bám dính dòng t bào bao g m c ni c hích h p cho h u h t p ằ - ng tạo m t d dàng ki m tra kính hi c c y chuy Các t ọc ng xuyên ho c ằ c tách riêng enzym  Nuôi c y trôi n i (suspension culture): t bào n i dung d ch nuôi c y - Thích h p cho t bào s ng dạng trơi n i ho c m t vài dòng t bào khơng bám dính - ph D dàng c y chuy n mt nh tỷ l s ng c a t i theo dõi t c ng c a chúng - S th pha loãng m - ng c a t bào b gi i hạn b i m ni c kích thích t bào si Có th ni c xoay 1.3.1 Cấy chuyển tế bào t bào ng ó y khơng c n x lý i khí Là q trình loại b ng chuy n t bào từ ng nuôi c y ng nuôi c y m i (bao g ic c y) Quá trình nhằm ti p t c kh a dòng t bào c y chuy n t bào khi: - M t iv it c c y chuy n t bào ng v t có vú, t bào bám dính nm “ ã ” - M ng cạn ki t ỡ iv it ng v t có vú, s gi pH tín hi u cho th y có s c cho t bào Tỷ l i c a pH ph thu c vào m t bào ni c y M cao s cạn ki ng di n nhanh s gi m pH l n t iệ tế bào bám dính t iết a  Nguyên li u c n - ấ ể đối i : ym i - ng ni c y hồn ch ã sung y u t c n thi t G … ã m lên 37oC m CO2 - Dung d phenol … tiế ng t bào nuôi c y - - T bư B … - Y u t tách t bào: enzym (trypsin, TrypLE Express, collagenase, phenol - Các hóa ch t d ng c trypan, bu mt …  nh tỷ l s ng/ch t c a t bào: Blue - Loại b - R a t bào PBS (kho ng 2ml/10cm2 b m t nuôi c ằ hẹ nhàng th dung d ch vào thành c a chai nuôi c y L c nhẹ chai vài l n B - Loại b dung d ch r a m - B sung dung d ch tách t bào ( - Ủ chai nuôi c y nhi c (ki i kính hi ) Có th gõ nhẹ ã c làm c2 y L c nhẹ phòng kho ng hút c xem t bào ã tách u qu tách t bào % bào ã b sung mơi ng ni c y hồn ch ã c làm m v i th tích g p -3 l n th tích dung d ch tách Tr ng lên b m t l p t bào vài l n ã - Chuy n toàn b dung d ch t bào sang ng li tâm li tâm ian – 10 phút,T thu c vào loại t bào) - Loại b ng m i z ng nuôi c - L y m t d ch t m t bào) nh tỷ l s ng ch t (xem ptotocol - Hòa lỗng d ch t ạt m tích phù h p r i cho vào chai ni c t iệ t iết tế bào trôi a  Nguyên li u t bào môi bư t bào c n thi t hút m t th vào t m tiế ấ ể đối i - Chai nuôi c y ch a t bào c n c y chuy n - Chai nuôi c y l c - T ng ni c y hồn ch nh, l m m lên 37oC m CO2 - C c khu y từ (n u s d ng chai spinner) ho c t d ng chai tròn- roller bottle) hay máy l c (n ng - Hóa ch t d ng c us y nh tỷ l t bào s ng/ch t  - Khi t bào s n sàng cho c y chuy n, l y chai kh i t m ẹ ẹ Dùng pipet hút m ng nh th tích d ch t bào nh tỷ l t bào s ng/ch t t - T nm ng dung d ch c n b thích h p - - Cẩn th n b ã bào vào nhi u chai m ng dung d ½ th tích dung d ch mà chai có th ch a) 1.3.2 Cất l nh tế bào - hòa lỗng n ng m ã chia nh m) v i th tích ng dung d ch t t b B o qu n t bào c t lạnh nhi -800 u b phá h y n u nhi -1700C T bào -50oC C t lạnh t bào n nh t s l n c y chuy n nh t có th C mb % bào s c c u ki n c t lạnh có th khác gi a dòng t bào ạ Luôn s d ng ch a ch t b o qu n lạ ừ it 1oC m é ng c t lạ O ng Luôn s d ng tube c t t bào chuyên bi t (cryovials) Các tube có th c c nito l ng m b o gi vô trùng mọ u ki n ng c t lạnh: có th ng ni c y hồn ch nh (ho c huy t thanh) có 10 – 15 % DMSO Ho ẩ Recovery Cell Culture Freezing Medium hay Synth-a-Freeze Cryopreservation Medium t iệ t iết bư tiế ất tế b  Nguyên li u - Chai ni c y có t bào - ng ni c y hoàn ch nh - DMSO ho - pha log ng c t lạ ẩm khác ng li tâm 15 ml 50 ml - Hóa ch t d ng c nh tỷ l t bào s ng/ch t - Tube c t lạnh t bào vô trùng - H p c t lạnh t “ ” - T - ng nito l ng V i t bào bám dính c n thêm tách t bào  C - Chuẩn b - PBS, Trypsin ho c enzym 2–8 ng c t lạ n s d ng i v i t bào bám dính, nhẹ nhàng tách t ut ng ni c y hồn ch nh thích h p - X ã nh tỷ l s ng/ch t - Li tâm d ch t bào 100 – 200 x g – 10 phút Cẩn th n loại b d ch n i ut h p cho loại t bào ng c t lạnh v i m t bào thích - Chia nh dung d ch t bào vào tube c t lạ gi t bào phân b u - t -8 t tube vào h p c t lạ - Chuy n tube t bào vào nito l t bào lâu - 80oC t bào tạ 1.3.3 Ho t hóa tế bào từ cất l nh ã é ạ T ạnh - ã - Nhẹ làm m t bào nhanh t i phút) b n nhi ã ã G m t ch t bào bằ ng hoàn ch c s h i ph c t t ã - Luôn gi u ki n vô trùng, Luôn s d ng thi t b an toàn làm vi c v i nhi th p, Luôn s d p làm vi c v i DMSO i tr Nguyên liệu t a tế b bư a  Nguyên li u - Tube c t lạnh ch a t bào - ng ni c y hồn ch ã m 37oC - Ống li tâm loại - B n nhi t 37oC - C n ethanol 70o - y t bào thích h p  Q L y tube c t lạnh ch a t bào từ bình nito l ng l p t c cho vào b n nhi t 37oC - ã cb n nhi i phút) cách quay nhẹ tube n ch lại m - Chuy n tube vào t c c n Et 70o c m n p, kh trùng xung quang - Chuy n toàn b t bào từ tube sang ng nuôi c y hoàn ch nh, m - Li tâm 200 xg -10 phút (t t bào) ã as nm t li tâm tùy vào loại - Cẩn th n loại b d ch phía mà khơng chạm n kh i t bào - Nhẹ ut chuy ; t vào t mà s d ng chai có th tích phù h p ng hồn ch nh m i m CO2 Tùy theo s ng t bào ... (primary culture) c tách từ cm l ọ uôi c ạn nuôi c y sau t bào u ki n thích h ạt p (primary culture) T ã in vivo, in vitro - th c p (subculture/ secondary culture) sau c p (subculture/ secondary culture). .. lympho: ng ni c y hình ng s ng trơi bào lympho T i u ki n nuôi c y 1.2 Đ u ki n nuôi c -M c y có ch … - Cá ng nhân tạ c nuôi c y, ng nuôi ỡng c n thi t (a.amin, carbonhydates, vitamin, ch t ng,... th t chút so v i nhi S t s nghiêm trọ nuôi c y Do v t nhi t 1.2.6 Thiết bị dụng cụ nuôi cấy tế bào  Các thi t b n : - T hood (hay gọi t c y t bào) dùng nuôi c y t bào (laminar flow ho c biosafety