Nuôi cấy virus động vật

Như vậy rất khó quan sát được các hiệu ứng đặc thù của virus ở mức độ tế bào.. Vào những năm 30 của thế kỷ 20 các nhà virus học đã phát hiện thấy trứng gà mang phôi đã thụ tinh hay chưa

Nuôi cấy virus động vật

Bởi:

Nguyễn Lân Dũng phamvanty

Phát triển phương pháp nuôi cấy

Trước kia nếu muốn nuôi cấy virus thì người ta phải nuôi cấy trên cơ thể động vật Như vậy rất khó quan sát được các hiệu ứng đặc thù của virus ở mức độ tế bào Vào những năm 30 của thế kỷ 20 các nhà virus học đã phát hiện thấy trứng gà mang phôi (đã thụ tinh hay chưa thụ tinh) có thể được dùng để nuôi cấy virus herpes, virus đậu mùa và virus cúm Mặc dù phôi gà có kết cấu giản đơn hơn nhiều so với cơ thể thỏ hay chuột thí nghiệm nhưng phôi gà vẫn là một cơ thể phức tạp Sử dụng phôi gà không giải quyết được triệt để những vấn đề gặp trong hiệu ứng tế bào học do virus gây ra Mặt khác, vi khuẩn cũng phát triển tốt trên phôi gà, trên các phôi nhiễm vi khuẩn rất khó đánh giá chính xác được các hiệu ứng do virus Vì vậy ngành virus học đã phát triển chậm chạp khi chưa cải tiến được phương pháp nuôi cấy virus

Có hai phát hiện mới đã làm triển khai được phương pháp nuôi cấy tế bào giúp cho các nhà virus học và các nhà khoa học khác Một là, việc phát hiện và sử dụng chất kháng sinh để ngăn ngừa sự cảm nhiễm vi khuẩn Hai là, các nhà sinh học phát hiện thấy các enzyme thủy phân protein (proteolytic), nhất là trypsin, có thể làm tách riêng các tế bào

ra khỏi các mô xung quanh mà không làm tổn hại đến các tế bào này Rửa các tế bào

và đếm số lượng chúng, pha loãng rồi chuyển vào các bình, các ống nghiệm hay hộp Petri bằng nhựa (plastic) Các tế bào trong dịch huyền phù sẽ hấp phụ trên bề mặt lớp thành nhựa, cúng sinh sôi nẩy nở và lan ra thành một tầng tế bào gọi là tầng tế bào đơn (monolayer) Tầng tế bào đơn này có thể truyền thế hệ (subcultured) Nuôi cấy truyền thế hệ (subculturing) là đem các tế bào nuôi cấy được đi nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy mới Một lượng lớn các tế bào truyền thế hệ (subcultures) được tạo thành từ một mẫu tổ chức đơn sẽ là mẫu tế bào nuôi cấy đồng nhất cần thiết cho hàng loạt các nghiên cứu hiệu ứng của virus

Thuật ngữ nuôi cấy mô (tissue culture) đã được sử dụng rộng rãi nhưng nuôi cấy tế bào (cell culture) cần sử dụng chính xác hơn Hiện nay, phần lớn các tế bào nuôi cấy đều là tầng tế bào đơn sinh trưởng ra từ các tế bào phân tán đã được xử lý nhờ enzyme Nhờ sử dụng nhiều loại hình nuôi cấy tế bào vận dụng chất kháng sinh để ức chế cam nhiễm mà

Virus học đã bước vào thời đại vàng (Golden Age) Từ thập kỷ 50 đến thập kỷ 60 của

thế kỷ 20 đã có trên 400 virus được phân lập và giám định (characterized) Mặc dù các virus mới đã được phát hiện nhưng trọng tâm hiện nay là cân giám định kỹ hơn các đặc tính của virus, xác định các bước cảm nhiễm (infection) và nhân lên (replication) của virus

Các thí nghiệm vệt tan (plaque) dùng trong nghiên cứu phage (phages) có thểt dùng cho

cả các virus đồng vật Chẳng hạn, nuôi cấy tầng tế bào đơn các tế bào người, sau đó cấy virus, nếu virus làm tan tế bào thì rất nhiều vòng xâm nhiễm sẽ sản sinh vệt tan

Các loại hình nuôi cấy tế bào

Trong Virus học lâm sàng và Virus học thực nghiệm thường sử dụng rộng rãi 3 kiểu cơ bản nuôi cấy tế bào:

• Nuôi cấy tế bào nguyên đại (primery cell culture)

• Các chủng nguyên bào sợi nhị bội thể (diploid fibroblast strains)

• Các dòng tế bào liên tục (continous cell lines)

Vật nuôi cấy tế bào nguyên đại là lấy trực tiếp từ động vật, không qua truyền thế hệ (not subcultured) Các động vật lấy mẫu càng non thì thời gian sống của tế bào nuôi cấy càng kéo dài Điển hình của các tế bào này là thể hỗn hợp của nhiều loại hình tế bào như tế bào cơ bắp (muscle), tế bào thượng bì (epithelial) Tuy vậy số lần phân cắt của các tế bào này thường không nhiều, nhưng cũng đủ để hỗ trợ cho nhiều chủng virus sinh trưởng

Nếu việc nuôi cấy tế bào nguyên đại có thể truyền thế hệ một cách lặp lại thì một típ (type) tế bào sẽ chiếm ưu thế và vật nuôi cấy các tế bào này được gọi là chủng tế bào (cell strain) Trong chủng tế bào tất cả các tế bào loại hình gene giống nhau Chúng có thể truyền thế hệ nhiều lần, mỗi thế hệ giữa các tế bào khả năng xuất hiện các khác biệt

là rất nhỏ Các khác biệt này có thể can thiệp vào kết quả xác định hiệu ứng của virus

Các chủng nguyên bào sợi nhị bội thể là các chủng tế bào thường dùng nhất Nguyên bào sợi (fibroblasts) là một loại tế bào chưa thành thục Chúng có thể sản sinh ra collagen và

các sợi khác như là cơ chất của mô liên kết giống như chân bì (dermis of the skin) Các

chủng tế bào này là lấy từ mô của phôi, giữ tốc độ phát triển nhanh và phân cắt liên tiếp của phôi Chủng tế bào này hỗ trợ cho sự phát triển của các loại virus và thường không mang các virus ô nhiễm như các chủng tế bào thu được từ các động vật trưởng thành Chính vì vậy mà các chủng tế bào này thường được sử dụng để sản xuất các loại vaccin virus

Típ thứ ba nuôi cấy tế bào được sử dụng rộng rãi là dòng tế bào liên tục Một dòng tế bào liên tục chứa các tế bào có thể sinh sản ra rất nhiều thế hệ Dòng tế bào liên tục nổi tiếng nhất là dòng tế bào HeLa Dòng tế bào này sau khi được phát hiện từ năm 1951 đã được

nuôi cấy liên tục và được các nhà nghiên cứu khắp thế giới sử dụng rộng rãi Nguồn gốc của dòng tế bào HeLa là lấy từ một phụ nữ bị ung thư tử cung và chữ HeLa là lấy từ các chữ đầu của tên người này Trên thực tế rất nhiều dòng tế bào liên tục thời kỳ đầu đều là dùng các tế bào ung thư ác tính, vì chúng có năng lực sinh trưởng rất nhanh Các dòng

tế bào vĩnh sinh (immortal cell lines) được nuôi cấy trong các phòng thí nghiệm không

bị lão hóa, phân chia nhanh chóng, nhu cầu dinh dưỡng thường đơn giản hơn các tế bào thông thường Ví dụ dòng tế bào HeLa có chứa 2 gen virus cần thiết cho năng lực vĩnh sinh hóa (immortality) của chúng Dòng tế bào vĩnh sinh này là dị bội thể (heteroploid) –chứa số lượng khác nhau các nhiễm sắc thể, vì vậy mà có tính đa dạng di truyền

Việc nuôi cấy tế bào đã thay thế trên mức độ rất lớn các động vật thực nghiệm và trứng chứa phôi khi nghiên cứu Virus học động vật Tuy vậy trứng gà mang phôi vẫn là hệ thống vật chủ tốt nhất đối với virus cúm A

Ngoài ra chuột nhỏ loại Albino Swiss vẫn được dùng để nuôi cấy Arbovirrus

(Arthropod-borne viruses), có lúc cũng dùng những dòng tế bào động vật có vú khác

hoặc các dòng tế bào muỗi

Hiệu ứng bệnh biến tế bào (The cytopathic effect)

Hiệu ứng thấy được của virus đối với tế bào cảm nhiễm được gọi là hiệu ứng bệnh biến (cytopathic effect, CPE) Các tế bào trong nuôi cấy biểu hiện các loại hiệu ứng chung, bao gồm sự biến đổi hình dạng tế bào và sự tách ra khỏi các tế bào phụ cận hoặc vật dụng nuôi cấy

Tuy nhiên CPE có thể cũng có những biểu hiện đặc biệt mà các nhà nghiên cứu virus học thực nghiệm có thể dùng để giám định sơ bộ virus xâm nhiễm Chẳng hạn, adeno virus và herpes virus ở người có thể làm cho tế bào cảm nhiễm trương phồng lên do bị tích lũy dịch thể Còn picorna virus lúc xâm nhập tế bào có thể ngăn chặn tế bào và làm tan vỡ tế bào khi chúng thoát ra Paramyxo virus có thể làm dung hợp (fuse) các tế bào đứng gần nhau, tạo nên các thể hợp bào (syncytia, số nhiều là syncytium) Thể hợp bào

có thể chứa từ 4 tới 100 nhân trong một tế bào chất chung Ngoài ra có một dạng CPE khác là sự biến nạp (transformation): từ tế bào bình thường biến thành tế bào ác tính