Nghiên cứu tạo chồi địa lan kiếm Bạch Ngọc (Cymbidium mastersii ) từ rễ bằng phương pháp in vitro

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh chồi địa lan kiếm Bạch Ngọc sau 60 ngày nuôi cấy .... Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tạo

NGUYỄN THỊ THANH HÒA

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU TẠO CHỒI ĐỊA LAN KIẾM BẠCH NGỌC (Cymbidium

mastersii ) TỪ RỄ BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Ngành/chuyên ngành : Công nghệ Sinh họcKhoa : CNSH - CNTPKhóa học : 2014 - 2018

Thái Nguyên - năm 2018

NGUYỄN THỊ THANH HÒA

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU TẠO CHỒI ĐỊA LAN KIẾM BẠCH NGỌC (Cymbidium

mastersii ) TỪ RỄ BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo: Chính quy

Ngành/chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thànhtới cô giáo ThS Nguyễn Thị Tình và thầy giáo ThS Vi Đại Lâm, giảng viên khoaCông nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ vàhướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài.

Đồng thời, em xin cảm ơn ThS Ma Thị Hoàn đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốtnhất cho em trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và luôn là chỗdựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng độngviên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Trong quá trình thực tập, cũng như là quá trình làm báo cáo thực tập thờigian có hạn, nên đề tài không thể tránh khỏi những sai sót Em rất mong nhận đượcnhững ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiệnhơn

Lời cuối em xin kính chúc các thầy, cô giáo trong nhà trường, trong khoaCông nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, cùng các bạn đồng nghiệp sức khoẻ,thành công trong cuộc sống

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2018

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Thanh Hòa

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

Từ, thuật ngữ viết tắt Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ

IUCN International Union for Conservation of Nature

and Natural Resources - Liên minh Bảo tồnThiên nhiên Quốc tế

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tái

sinh chồi địa lan kiếm Bạch Ngọc (sau 60 ngày nuôi cấy) 37Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của cây Địa

lan kiếm Bạch Ngọc (sau 10 ngày nuôi cấy) 39Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến

khả năng ra rễ của cây địa lan Kiếm Bạch Ngọc (sau 10 ngày nuôi cấy) 41

Bảng 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IAA đến khả năng nhân

nhanh rễ địa lan kiếm Bạch Ngọc (sau 20 ngày nuôi cấy) 44

Bảng 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IAA kết hợp với IBA đến khả

năng nhân nhanh rễ của địa lan kiếm Bạch Ngọc (sau 20 ngày nuôi cấy) 46

Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IAA kết hợp với IBA và

NAA đến khả năng nhân nhanh rễ của địa lan kiếm Bạch Ngọc (sau 20 ngày nuôi cấy) 48Bảng 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tạo chồi địa lan

kiếm Bạch Ngọc từ rễ (sau 20 ngày nuôi cấy) 50

Bảng 4.8 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin kết hợp với BA đến khả năng

tạo chồi địa lan kiếm Bạch Ngọc từ rễ sau (20 ngày nuôi cấy) 52

Bảng 4.9 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin kết hợp với BA và NAA đến

khả năng tạo chồi địa lan kiếm Bạch Ngọc từ rễ (sau 20 ngày nuôi cấy) 54

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu tạo chồi địa lan kiếm Bạch Ngọc từ rễ bằng phương

pháp invitro 29Hình 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tái

sinh chồi địa lan kiếm Bạch Ngọc (sau 60 ngày nuôi cấy) 38

Hình 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của cây Địa

lan kiếm Bạch Ngọc (sau 10 ngày nuôi cấy) 40

Hình 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến

khả năng ra rễ của cây địa lan Kiếm Bạch Ngọc (sau 10 ngày nuôi cấy) 43Hình 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IAA đến khả năng nhân

nhanh rễ địa lan kiếm Bạch Ngọc (sau 20 ngày nuôi cấy) 45Hình 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IAA kết hợp với IBA đến khả

năng nhân nhanh rễ của địa lan kiếm Bạch Ngọc (sau 20 ngày nuôi cấy) 47Hình 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IAA kết hợp với IBA và NAA

đến khả năng nhân nhanh rễ của địa lan kiếm Bạch Ngọc (sau 20 ngày nuôicấy) 49

Hình 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tạo chồi địa lan

kiếm Bạch Ngọc từ rễ (sau 20 ngày nuôi cấy) 51Hình 4.8 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin kết hợp với BA đến khả năng

tạo chồi địa lan kiếm Bạch Ngọc từ rễ (sau 20 ngày nuôi cấy) 53Hình 4.9 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin kết hợp với BA và NAA đến

khả năng tạo chồi địa lan kiếm Bạch Ngọc từ rễ (sau 20 ngày nuôi cấy) 56

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ii

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC HÌNH iv

MỤC LỤC v

Phần 1: MỞ ĐẦU 1

1.1.Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 3

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

3 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 3

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài 3

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 4

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

2.1 Tổng quan về lan Kiếm 5

2.1.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm của lan Kiếm 5

2.1.1.1 Nguồn gốc 5

2.1.1.2 Phân loại và phân bố

5 2.1.1.3 Đặc điểm hình thái của Địa lan kiếm 6

2.1.2 Hiện trạng cây Địa lan kiếm Việt Nam 8

2.1.3 Tình hình sản xuất, tiêu thụ sản phẩm từ các loài địa lan kiếm trên thế giới 12 2.1.4 Tình hình sản xuất, tiêu thụ địa lan kiếm ở Việt Nam 15

2.1.5 Tình hình nghiên cứu nhân giống địa lan kiếm trên thế giới và ở Việt Nam 17 2.2 Giới thiệu về giống địa lan kiếm Bạch Ngọc

20 2.2.1 Phân loại khoa học

20 2.2.2 Nguồn gốc và sự phân bố 21

2.2.2.1 Nguồn gốc 21

2.2.2.2 Sự phân bố 21

2.2.3 Hình thái 21

2.3 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào 22

2.3.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật 22

2.3.2 Sự phân hoá tế bào 22

2.3.3 Sự phản phân hoá tế bào 22

2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 22

2.4.1 Vật liệu nuôi cấy 22

24.2 Điều kiện nuôi cấy 23

2.4.3 Môi trường dinh dưỡng 23

2.4.3.1 Nguồn Cacbon 24

2.4.3.2 Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng 24

2.4.3.3 Vitamin 24

2.4.3.4 Chất hữu cơ tự nhiên 25

2.4.3.5 Các thành phần khác 25

2.4.3.6 pH của môi trường 25

2.4.3.7 Các chất điều hoà sinh trưởng 25

2.5 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô địa lan kiếm Bạch Ngọc trên thế giới và trong nước 26

2.5.1 Trên thế giới 26

2.5.2 Trong nước 27

Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

3.1 Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu 28

3.2 Nội dung nghiên cứu 28

3.2.1 Nội dung 1: Xác định môi trường tái sinh chồi từ phôi địa lan kiếm Bạch Ngọc

28 3.2.2 Nội dung 2: Xác định môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh địa lan kiếm Bạch Ngọc 28

3.2.3 Nội dung 3: Nghiên cứu môi trường nhân nhanh rễ địa lan kiếm Bạch Ngọc in vitro 28

3.2.4 Nội dung 4: Nghiên cứu môi trường kích chồi địa lan kiếm Bạch Ngọc từ rễ in vitro 28

3.3 Phương pháp nghiên cứu 29

3.3.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro 29

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu 29

3.3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 30

3.3.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh chồi địa lan kiếm Bạch Ngọc 30

3.3.3.2 Nội dung 2: Xác định môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh địa lan kiếm Bạch Ngọc 31

3.3.3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu môi trường nhân nhanh rễ địa lan kiếm Bạch Ngọc in vitro

31 3.3.3.4 Nội dung 4: Nghiên cứu môi trường kích chồi địa lan kiếm Bạch Ngọc từ rễ in vitro 33

3.4 Các phương pháp xử lý số liệu 35

Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37

4.1 Kết quả nghiên cứu: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh chồi địa lan kiếm Bạch Ngọc 37

4.2.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của cây Địa lan kiếm Bạch Ngọc 39

4.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng ra rễ của cây địa lan Kiếm Bạch Ngọc 41

4.3 Kết quả nghiên cứu môi trường nhân nhanh rễ địa lan kiếm Bạch Ngọc in vitro 44

4.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IAA đến khả năng nhân nhanh rễ địa lan kiếm Bạch Ngọc 44

4.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IAA kết hợp với IBA đến khả năng nhân nhanh rễ địa lan kiếm Bạch Ngọc 46

4.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA kết hợp với IBA và NAA đến khả năng tạo chồi địa lan kiếm Bạch Ngọc từ rễ 48

4.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kinitine đến khả năng tạo chồi địa lan

kiếm Bạch Ngọc từ rễ 50

4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin kết hợp với BA đến khả năng tạo chồi địa lan kiếm Bạch Ngọc từ rễ 52

4.4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin kết hợp với BA và NAA đến khả năng tạo chồi địa lan kiếm từ rễ 54

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

5.1 Kết luận 57

5.2 Kiến nghị 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

I Tiếng Việt 58

II Tiếng Anh 58

III Một số trang web 58

Theo Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp năm

2004 đã thống kê được 10 chi lan lớn nhất trong số 160 chi của họ lan ở Việt

Nam trong đó Chi Lan kiếm (Cymbidium), còn gọi là Địa Lan hay Thổ Lan, là một

chi thực vật gồm 52 loài Chi này được Olof Swartz mô tả lần đầu vào năm 1799.Đây cũng là những chi lớn nhất của lan nhiệt đới châu Á Cũng theo các tác giả trênthì địa Lan có sự đa dạng nhất về số loài, kiểu dáng, màu sắc, số lượng hoa trên bôngcũng như kích thước hoa và đặc biệt là hương thơm Đây là nguồn vật liệu di truyềnphong phú phục vụ công tác nghiên cứu lai, chọn tạo giống mới

Ở miền Bắc việc bảo tồn các loài phong lan bằng phương thức nhân giống đã

có nhiều thành công đáng ghi nhận ở một số cơ quan, doanh nghiệp như Viện DiTruyền Nông nghiệp Việt Nam, Viện Rau Quả, Học Viện Nông Nghiệp, Viện Khoa

học sự sống, Công ty Florist, công ty cổ phần và phát triển Agritex Tuy nhiên việcnhân giống các loài địa lan bản địa lại chưa được quan tâm Kết quả nghiên cứu cònhạn chế do khó khăn về nguồn vật liệu nghiên cứu ngày càng bị thu hẹp thậm chínguồn vật liệu địa lan đang có nguy cơ mất dần trong tự nhiên Đặc biệt là nhữngloài địa lan có giá trị thẩm mỹ cao, có hương thơm, những loài hoang dã hiện chúngđang bị săn lùng một cách dáo diết Vì vậy, việc nghiên cứu nhân giống địa lan cógiá trị là cần thiết và có ý nghĩa trong công cuộc bảo vệ hệ sinh thái Việt Nam cũngnhư lưu giữ và phát triển nguồn gen có giá trị trong nghiên cứu khoa học và pháttriển thương mại 52 loài địa lan của Việt Nam đều rơi vào tình trạng nguy cấp xongloài địa lan kiếm Bạch Ngọc là một trong những loài đang bị báo động nguy cơ

tuyệt chủng gần Địa lan kiếm Bạch Ngọc (Cymbidium mastersii) vẫn chưa được

IUCN phân hạng Tuy nhiên, nó đã được đánh giá tạm thời là dễ bị tổn thương(VU) theo tiêu chí Danh sách đỏ của IUCN [9] Nó được liệt kê trong phụ lục II củaCITES [12]

Địa lan kiếm Bạch Ngọc (Cymbidium mastersii) là loài sống phụ sinh, có khi

ở đất Lá hình giải hẹp, mỗi bên từ 6-8 chiếc, dài đến 1m, rộng 0,5cm, đỉnh nhọn.Cụm hoa màu trắng mọc thành chùm hoa dài 25 - 30 cm, có 10 - 15 hoa Hoa lớndài khoảng 6cm, cánh môi lớn, cựa màu vàng, bên trong cánh môi có những sọcmàu tím không đều, bên ngoài màu trắng nhạt, hoa thơm, Theo các nhà thực vậthọc Leonid Aveyanov, Phan Kế Lộc, D.T.Đoan đây là loài phân bố hẹp hiện mớiphát hiện mẫu ở khu vực núi rừng Quảng Ninh, Thanh Hóa vào năm 2003 Hiệnchưa có công bố nào phát hiện loài này ở những khu vực khác

Việt Nam là một quốc gia có trữ lượng hoa lan và các loài lan đặc hữu vào bậcnhất thế giới Tuy nhiên hiện nay rất nhiều loài đã không còn xuất hiện ngoài tựnhiên nếu Việt Nam không có chính sách bảo tồn nhanh các loài thực vật bản địa, cácloài hoang dã thì tương lai rất gần Việt Nam sẽ mất hẳn những nguồn vật liệu quý

Ở nước ta, những nghiên cứu nhân giống địa lan kiếm Bạch Ngọc từ một sốloại vật liệu khởi đầu khác nhau như tạo chồi từ phôi hạt (Đây là phương pháp nhângiống hữu tính - cây con tạo ra không còn giữ được nguyên vẹn đặc tính của cây

mẹ) đã thành công Việc tái sinh từ mầm ngủ cho khả năng tái sinh thấp, hệ số nhângiống không cao ảnh hưởng đến sản xuất địa lan kiếm ở quy mô công nghiệp Việcnghiên cứu tái sinh chồi ở giống lan Kiếm Bạch Ngọc là một kỹ thuật mới chưađược áp dụng ở Việt Nam Hiện nay mới chỉ được nghiên cứu ở một số quốc gia cónền công nghiệp địa lan phát triển như Thái Lan, Đài Loan Phương pháp này cho

hệ số nhân cao, cây con giữ được đặc tính di truyền và hình thái của cây mẹ

Xuất phát từ cơ sở khoa học và yêu cầu thực tế khách quan trên, chúng tôi

tiến hành thực hiện đề tài:“Nghiên cứu tạo chồi địa lan kiếm Bạch Ngọc

(Cymbidium mastersii ) từ rễ bằng phương pháp in vitro”.

1.2 Mục tiêu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

- Nghiên cứu thành công môi trường tối ưu tạo chồi địa lan kiếm Bạch Ngọc

từ rễ bằng phương pháp in vitro.

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

- Xác định môi trường tái sinh chồi từ phôi địa lan kiếm Bạch Ngọc

- Xác định môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh địa lan kiếm Bạch Ngọc

- Xác định được nồng độ một số chất kích thích sinh trưởng tối ưu cho khảnăng nhân nhanh rễ địa lan kiếm Bạch Ngọc

- Xác định được nồng độ một số chất kích thích sinh trưởng tối ưu cho khảnăng tạo chồi địa lan kiếm Bạch Ngọc từ rễ

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ sung vào

kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn

- Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thực tế

cũng như tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục vụ cho cho công tác saunày

- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dữ liệu khoa học mới vềnhân giống địa lan kiếm bằng phương pháp tạo chồi từ rễ, góp phần làm phong phú

cơ sở dữ liệu về kỹ thuật nuôi cấy mô

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Đề xuất được kỹ thuật nhân giống địa lan kiếm mới ở Việt Nam

- Tạo ra số lượng giống địa lan kiếm Bạch Ngọc góp phần bảo tồn nguồn genquý cho nghiên cứu khoa học

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về lan Kiếm

2.1.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm của lan Kiếm

2.1.1.1 Nguồn gốc

Chi lan Kiếm Cymbidium, trong ho phụ Orchidioideae, các loài trong chi

Lan Kiếm có hoa lớn, đẹp, bền phân bố trên một vùng vô cùng rộng lớn khắp ĐôngNam Á, các hải đảo trên Thái Bình Dương đến Hy Lạp Sơn, từ Philippines đếnFidgi Đa số các loài trong chi đều gồm các cây sống phụ trên cây mục khác hoặchốc đá có mùn [13]

2.1.1.2 Phân loại và phân bố

Việt Nam thuộc vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm mưa nhiều, diện tích rừngnúi được phân bố khá rộng từ Nam ra Bắc tạo thành một hệ thống thảm thực vật rất

đa dạng và phong phú trong đó có địa lan (Cymbidium.ssp) Địa lan là một chi thực

vật gồm 52 loài thuộc họ Lan Căn cứ vào vị trí địa lý, địa lan chủ yếu được phân bổtại vùng rừng núi khu vực phía Tây bắc và phía Đông bắc, trong đó khu vực Đôngbắc bao gồm các tỉnh như: Quảng Ninh, Lạng Sơn, Hải Phòng, Hòa Bình là nhiềuloài đặc hữu hơn cả [16]

Căn cứ vào mùa thì có thể phân Địa lan ra thành 3 nhóm: Địa lan thu (ra hoavào mùa thu như: Bạch ngọc, Tố tâm, Trần Mộng ), địa lan đông (ra hoa vào mùađông), địa lan xuân (ra hoa vào mùa xuân như: Đại mạc, Thanh trường, Đại hoàng,Hoàng vũ, Thanh ngọc ) Trong đó lan xuân là phong phú và có nhiều chủng loạiquý hơn cả [16]

Căn cứ vào màu sắc có thể chia thành các nhóm:

Nhóm 1 - Hoa màu nâu: Đại mạc và các biến thể

Nhóm 2 - Hoa màu vàng: Hoàng lan và các biến thể

Nhóm 3 - Hoa màu xanh: Thanh lan và các biến thể

Nhóm 4 - Hoa màu hồng: Hồng lan và các biến thể

Nhóm 5 - Hoa màu trắng: Bạch lan và các biến thể.

Nhóm 6 - Hoa màu đen (hoặc nâu đen): Hắc lan và các biến thể

Trong đó Hồng lan và Hắc lan là 2 loài đặc hữu và quý hiếm nhất [16]

2.1.1.3 Đặc điểm hình thái của Địa lan kiếm

Về hình thái bên ngoài, Địa lan kiếm là những loài thân thảo, đa niên, đẻnhánh hàng năm tạo thành những bụi nhỏ Có loài rễ mọc bám trên vỏ cây, mặt đất(bì sinh hay phụ sinh); có loài rễ ăn sâu trong bọng cây, trong đất mùn (địa sinh haythực sinh) Rễ mới thường chỉ mọc ở cây con, cây mẹ khó ra rễ mới mà chỉ thấyphân nhánh từ củ rễ [16]

Thân ngầm của chúng (căn hành) thường ngắn, nối những củ lan với nhau.Các củ lan thực chất là những cành ngắn của căn hành Củ già, khi bị tách khỏi cănhành cũ, có thể mọc ra đoạn căn hành mới, từ đó mọc lên những cây con Do đó

người ta xếp Cymbidium vào nhóm lan đa thân (sympodial) [16].

Củ lan (giả hành) thường có dạng con quay hay dạng hột xoài, đường kính từ

1 cm đến 15 cm, củ thường tươi và được bọc trong các bẹ lá [16]

Lá thường có hai dạng: dạng vảy đính theo một đoạn căn hành và dạng thựcđính trên giả hành Lá thực thường có cuống lá, giữa bẹ lá và cuống lá có một tầngphân cách Khi phiến lá rụng, vẫn còn đoạn bẹ ôm lấy giả hành Vài loài không cócuống lá Tùy theo từng loài mà phiến lá rất khác nhau, có gân dọc nổi rõ hay chìmtrong thịt lá Một số loài ít chịu râm có phiến lá màu xanh vàng, còn lại thường làxanh đậm Bản lá và độ dày của lá thay đổi tùy theo từng loài: các loài sống ở trảngtrống có lá hẹp và dày hơn các loài ưa bóng râm Lá có dạng dải, dạng mũi mác,dạng phiến Đầu lá nhọn hay chia thành 2 thùy Kích thước của bản lá biến động từ0,5 cm đến 6 cm Chiều dài lá thay đổi từ 10 cm đến 150 cm [16]

Chồi hoa thường xuất hiện bên dưới giả hành, trong các nách lá, tách các bẹgià, đâm ra bên ngoài Thông thường, mỗi giả hành chỉ cho hoa một lần Chồi hoathường xuất hiện đồng thời với chồi thân, những chồi hoa no tròn hơn, còn chồithân hơi dẹp Các lá đầu tiên ở chồi thân mọc đâm ra 2 phía hình đuôi cá, còn ở chồihoa các lá bao hoa luôn ôm chặt quanh phát hoa Cọng phát hoa không phân nhánh,

dựng đứng hay buông thõng Chiều dài của phát hoa từ 10 đến hơn 100 cm Cànhhoa mang từ vài đến vài chục búp hoa xếp luôn phiên theo đường xoắn ốc Búp hoakhi đã đủ lớn, bắt đầu dang xa khỏi cọng hoa, xoay nửa vòng tròn để đưa cánh môi

xuống dưới rồi bắt đầu nở Thoạt nhìn, hoa Cymbidium có 5 cánh gần giống nhau,

thực ra chỉ có 2 cánh hoa ở bên trong, còn lại là 3 lá đài ở bên ngoài, có cấu trúc vàmàu sắc giống cánh hoa Cánh hoa thứ 3 chuyên hóa thành cánh môi, màu sắc rực

rỡ hơn, xẻ thành 3 thùy tạo ra dạng nửa hình ống 2 thùy bên ôm lấy trụ, thùy thứ 3

có dạng bầu hay nhọn tạo thành hình đáy thuyền, làm chỗ đậu cho côn trùng khi đếnhút mật và thụ phấn cho hoa Giữa cánh môi có 2 gờ dọc song song màu vàng Tậncùng bên trong có dĩa mật và đôi khi có những tuyến tiết mùi hương [16]

Hoa Cymbidium lưỡng tính, nhị đực và nhụy cái cùng gắn chung trên một trụ

nhị - nhụy (hay trục hợp nhụy) hình bán trụ hơi cong về phía trước Nhị ở trên cùng,mang 2 khối phấn màu vàng, có gót dính như keo Khối phấn được đậy bởi một nắpmàu trắng ngà dễ mở rời Hộc chứa phấn khối của trục hợp nhụy cách với nuốmnhụy bởi một cái gờ (mỏ) nổi lên Cấu trúc này bắt buộc trong tự nhiên hoa

Cymbidium chỉ thụ phấn được nhờ côn trùng Sau khi thụ phấn, hoa xoay dần về vị

trí cũ, bầu noãn phình lên tạo thành quả [16]

Quả lan là một nang có 3 góc, bên trong có chứa hàng trăm ngàn hạt Khichín, quả mở theo 3 đường góc và gieo vào không khí những hạt như bụi phấn màuvàng lụa Khi rơi vào nơi có điều kiện ẩm độ, ánh sáng thích hợp và có nấm cộngsinh tham gia, hạt sẽ nẩy mầm phát triển thành cây mới [16]

Hạt lan: Rất nhiều, nhỏ li ti (do đó trước đây gọi họ lan là họ vi tử) Hạt chỉcấu tạo bởi một khối chưa phân hoá, trên một mạng lưới nhỏ, xốp, chứa đầy khôngkhí Phải trải qua 5 - 8 tháng hạt mới chín Trong tự nhiên, phần lớn hạt thường chết

vì khó gặp nấm cộng sinh cần thiết để nảy mầm Do đó hạt nhiều có thể theo gióbay rất xa, nhưng hạt nảy mầm thành cây lại rất hiếm Chỉ ở trong những khu rừnggià ẩm ướt, vùng nhiệt đới mới đủ điều kiện cho hạt lan nảy mầm Khối lượng toàn

bộ hạt trong một quả chỉ bằng1/10 đến 1/1000 miligam Trong đó không khí chiếmkhoảng 76 - 96% thể tích của hạt [16]

2.1.2 Hiện trạng cây Địa lan kiếm Việt Nam

Lan Kiếm là một loài cây không những có giá trị thẩm mỹ, giá trị khoa học

mà còn có giá trị kinh tế rất cao Hoa Lan kiếm có một nét đẹp kiêu sa, quyến rũ vàmềm mại, mang dáng vẻ sang trọng và huyền bí Hiện nay cùng với sự phát triểncủa kinh tế xã hội, đời sống con người ngày càng được nâng cao, nhu cầu về thưởngthức cái đẹp càng gia tăng Nghề trồng hoa cây cảnh nói chung và đặc biệt chọn tạogiống hoa lan xuất khẩu nói riêng, đã và đang trở thành một ngành kinh tế thu nhiềulợi nhuận

Địa Lan Kiếm có giá trị thương mại cao, được sưu tầm và tìm kiếm rất

nhiều Chi Cymbidium trên thế giới ghi nhận 52 loài địa lan Trong đó 30 loài địa

lan kiếm được ghi nhận tại Việt Nam Như vậy, nước ta là một trong các quốcgia có nguồn lan kiếm tự nhiên phong phú Không những phong phú về chủngloại, Việt Nam còn có nhiều loài lan kiếm đặc hữu có giá trị thẩm mĩ cao, đượcthế giới ưa chuộng Vì vậy tình trạng thu thập và xuất khẩu lan kiếm một cách ồ

ạt, không kiểm soát dẫn đến việc lan kiếm ngày càng hiếm trong tự nhiên Đồngthời với tình trạng môi trường tự nhiên bị khai thác cạn kiệt như hiện nay, quầnthể lan kiếm càng có nguy cơ suy giảm nghiêm trọng Dưới đây là danh sách 30loài lan kiếm đặc hữu của Việt Nam:

Tên loài (tiếng Latinh) Tên loài (Tiếng Việt) Ghi chú

Tên loài (tiếng Latinh) Tên loài (Tiếng Việt) Ghi chú

3 Cymbidium banaense Đoản kiếm Bà Na,

Thiên Nga (PHH), Lankiếm Bà Nà (TH)

*

9 Cymbidium eburneum

Đồng danh: Cymbidium syringodorum

Bạch Ngọc, Bạch NgọcXuân

elegans

Đồng danh: Cymbidium densiflorum,

Cymbidium longifolium, Cyperorchis

Tên loài (tiếng Latinh) Tên loài (Tiếng Việt) Ghi chú

albomarginatum, Cymbidium arrogans

danh: Cymbidium pendulum, Cymbidium

tricolor, Cymbidium wallichii

Kiếm vàng (TH),Hoàng kiếm lan

Tên loài (tiếng Latinh) Tên loài (Tiếng Việt) Ghi chú

Đồng danh: Cymbidium maclehoseae giáo (TH)

Đồng danh: Cyperorchis schroederi

Hoàng lan (PHH), Kiếmtrung (TH)

fragrans ; Cymbidium hoosai

Kiếm tầu (TH), Mặc lan,Thanh trường, Đại hoàng

*

29 Cymbidium wenshanense Chưa có tên

30 Cymbidium wilsonii

Đồng danh: Cymbidium giganteum

Chưa có tên

Ghi chú: Các giống đánh dấu (*) dưới đây đã được liệt kê vào Phụ Lục II của Công

ước CITES Hiện nay, 21 loài tìm thấy tại Việt Nam nằm trong danh sách CITES2017

TH: Trần Hợp, PHH: Phạm Hoàng Hộ

Trên thực tế, mức độ thu hẹp quần thể tất cả các loài Địa lan kiếm ViệtNam được đang diễn ra trong thời gian gần đây, qua các đợt điều tra thực địa đãphát hiện ra tốc độ phá huỷ mạnh mẽ trên diện rộng của những khu rừng còn sótlại của Việt Nam, chủ yếu trên các đỉnh núi đá vôi

Trước tình hình Địa lan kiếm cạn kiệt ngoài thiên nhiên, nhiều chươngtrình quốc gia về bảo tồn loài hoa quý này đã được triển khai,chủ yếu là thu thập,phân loại, nghiên cứu về các loài địa lan kiếm và bảo tồn môi trường sống tựnhiên của chúng

2.1.3 Tình hình sản xuất, tiêu thụ sản phẩm từ các loài địa lan kiếm trên thế giới

Trước đây, cây lan được cho là xuất hiện đầu tiên ở châu Âu qua bản viết taybằng chữ Hy Lạp, vào khoảng năm 370 - 285 trước Công nguyên (theo PhạmHoàng Hộ, 1973) Nhưng thực tế, cây lan được biết đến đầu tiên ở phương Đông,vào khoảng từ năm 551 - 497 trước Công nguyên Cây lan biết đến đầu tiên ở Trung

Hoa là Kiến lan (được tìm ra đầu tiên ở Phúc Kiến - Trung Quốc) đó là Cymbidium ensifonymum là một loài bán địa lan Ở Phương Đông, lan được chú ý đến bởi vẻ

đẹp duyên dáng của lá và hương thơm tuyệt vời của hoa Vì vậy, trong thực tế lanđược chiêm ngưỡng trước tiên là lá chứ không phải màu sắc của hoa (quan niệmthẩm mỹ thời ấy chuộng tao nhã chứ không ưa phô trương sặc sỡ) Lan đối vớingười Trung Hoa hay lan đối với người Nhật, tượng trưng cho tình yêu và vẻ đẹp,hương thơm tao nhã, tất cả thuộc về phái yếu, quý phái và thanh lịch Khổng Tử đềcao lan là vua của những loài cây cỏ có hương thơm Phong trào chơi phong lan vàđịa lan ở Trung Quốc phát triển rất sớm, từ thế kỷ thứ V trước công nguyên đã cótranh vẽ về phong lan còn lưu lại từ thời Hán Tông Ở châu Âu bắt đầu để ý đếnphong lan từ thế kỷ thứ 18, sau Trung Quốc đến hàng chục thế kỷ và cũng nhờ cácthuỷ thủ thời bấy giờ mà phong lan đã đi khắp các miền của địa cầu Lúc đầu làVanny sau đó đến Bạch Cập, Hạc Đính rồi Kiến Lan Lan chính thức ra nhập vào

ngành hoa cây cảnh trên thế giới 400 năm nay [11] Địa lan (Cymbidium) hay còn

gọi Thổ lan là một loại hoa lan khá phổ thông, vì hội đủ điều kiện: có nhiều hoa, to

đẹp, đủ màu sắc và lâu tàn, rất thông dụng cho việc trang trí trưng bày Hiện nay,nước Mỹ có nhiều vườn địa lan dùng cho kỹ nghệ cắt bông như Gallup & Tripping

ở Santa Barbara nhưng cũng phải nhập hàng triệu đô la mỗi năm từ các nước Châu

Âu và châu Á để cung ứng cho thị trường trong nước Trước năm 1930, nước Mỹkhông có nhiều giống lan và cũng không có nhiều người thích chơi lan hay vườnlan Nói riêng về California thì chỉ có 2- 3 vườn lan ở Oakland và San Francisco,nhưng chỉ dùng cho kỹ nghệ cắt bông, không có bán cây Lúc bấy giờ các vườn lan

chỉ có cát lan (Cattleya) hay địa lan (Cymbidium) nhưng cũng không có nhiều giống

lan hay hoa đẹp, những giống này được nhập cảng từ nước Anh

Nước Anh là nơi nghiên cứu và lưu trữ hồ sơ những loài thảo mộc hay bônghoa, tất cả tên tuổi của những loài thảo mộc hay bông hoa đều được đăng ký và lưutrữ ở Anh Quốc Sau năm 1930 địa lan mới được nhập cảng vào nước Mỹ nhưng rấtgiới hạn, địa lan rất đắt giá, giá tính từng củ một, dù củ không có lá, hay củ có lá giá

cả cũng không khác biệt bao nhiêu Có nhiều loại, một củ với giá có thể tới 800 đô

la Một cây địa lan tên Cym rosanna “pinkie” được bán đấu giá 2.500 đô la và có

người mua với giá 2.600 đô la (Dẫn theo Phạm Cường -Thursday November 1,

2007 - 07:42am (PDT)) Nhưng khi chiến tranh thế thứ II bắt đầu, tất cả nhiên liệuchỉ dành cho chiến tranh, nên các vườn lan ở nước Anh không còn nhiên liệu đểsưởi ấm cho lan vào mùa đông nữa Vì không muốn mất những loại địa lan đã gâygiống nhiều năm, nên họ phải xuất ra nước ngoài, trong đó có cả nước Mỹ Theo tạpchí (Chinese Cymbidium History Part 1), hiện nay tại Mỹ đã có những nghiên cứu

về cây địa lan ở một số khâu kỹ thuật sau:

+ Nghiên cứu giá thể (môi trường) trồng, mỗi một điều kiện khác nhau có thểdùng các giá thể khác nhau: Ở vùng có nhiệt độ môi trường thấp (65H0 F ban ngày

và 45H0 F ban đêm)với độ ẩm trung bình có thể thêm vỏ cây linh sam và đá bọtbiển (peclit thô) vào hỗn hợp trên Hỗn hợp này có nhiều tác dụng nhất cho khí hậulạnh vào mùa đông và ấm nóng vào mùa hè vì vỏ cây giúp giữ lại lượng ẩm đáng kểtrong hỗn hợp Ở điều kiện khí hậu khô có thể tăng thêm rêu và rong biển chúng sẽlàm sự thoát ẩm diễn ra chậm lại Nhưng cần sử dụng cẩn thận khi thêm rong (rêu)

vì sự tưới nước thường xuyên sẽ dẫn đến thừa ẩm, úng làm bộ rễ thối rữa, cây dễ bịbệnh và chết Người ta đã sử dụng các loại giá thể, mục đích giữ cho rễ cây ẩm,song không quá ẩm, rễ cây luôn mát mẻ phát triển tốt

Theo một số nhà trồng lan Châu Á thì ở khí hậu ấm nóng chỉ sử dụng duynhất là đá, tuy nhiên không giới thiệu (khuyên) cho điều kiện khí hậu mát mẻ,những hỗn hợp đá sẽ giữ lại ít nước và được dùng trong điều kiện có độ ẩm thấp Ởvùng ẩm thấp nhiệt độ môi trường cao (85◦ F ban ngày và 65◦ F ban đêm) có thểtrồng với sự pha trộn của đá mịn thô hoặc có thể là cây dương xỉ thêm vào 1 ít hỗnhợp đá thô

+ Nghiên cứu về thay chậu và tách cây: Phương pháp chính của sự sinh sảnđịa lan kiếm châu Á đặc biệt bởi sự đẻ nhánh Những chậu cây sâu và rộng sẽ chomột số sự phát triển mới hay là (thân hành - giả hành), có thể để từ 2-3 năm mớithay giá thể và cho nhiều cây vào chậu tạo sự sinh sản mới, ở điều kiện này sẽ tạonhiều cụm hoa Tuy nhiên cần lưu ý tới vết cắt khi tách cây phải được xử lý bằngsunfua làm giảm sự tiếp xúc của virut

+ Nghiên cứu về độ ẩm: Trong mùa hè - mùa sinh trưởng nên tưới nước 2lần/ tuần, tưới nước từ miệng chậu sao cho nước qua chậu khoảng 10 giây, có thểdùng bình tưới phân sau khi tưới nước, cần giữ độ ẩm ở 75% Khi cây vào thời kỳnghỉ ngơi cần tưới ít nước và giữ độ ẩm từ 40-60% Tưới nước vừa đủ cây có bộ rễsinh trưởng khoẻ và đều đặn

+ Nghiên cứu về ánh sáng: Mùa hè cần độ che phủ khoảng 60-70% ánh sáng,trong mùa đông có thể giảm 20% Lá cây tiếp nhận ánh sáng tốt nhất sẽ xanh vàsáng bóng và có độ cong thanh nhã Màu xanh vàng có thể cho biết là lá quá thừaánh sáng, lá bị gãy gập và rụng có thể là ánh sáng yếu

+ Nghiên cứu về nhiệt độ tới sinh trưởng và phát triển: Nhiệt độ khác nhau

có ảnh hưởng quan trọng đến quá trình ra hoa Địa lan Kanran và Gorengi đòi hỏi

nhiệt độ ban đêm khoảng 40-50◦ F để bắt đầu nở hoa, địa lan Sinence cần nhiệt độ50-60◦ F

+ Nghiên cứu về bón phân: Khi cây con phát triển cần bón phân 1 tuần/ lần,ngừng tưới phân khi cây chuyển sang giai đoạn nghỉ ngơi.

+ Nghiên cứu về bộ rễ đánh giá khả năng sinh trưởng của cây: Mùa xuân làthời gian tốt nhất để kiểm tra bộ rễ, nếu rễ bám quá chặt vào chậu có thể đập bỏchậu Kiểm tra bộ rễ sẽ giúp ta biết được lượng nước tưới, giá thể trồng và sức khoẻcủa cây

2.1.4 Tình hình sản xuất, tiêu thụ địa lan kiếm ở Việt Nam

Nghề trồng hoa lan ở Việt Nam có lịch sử rất lâu đời Vua Trần Nhân Tông lập nên

"Ngũ bách viên" trong đó có 500 loài hoa quý được sưu tập từ khắp các vùng đấtnước, chủ yếu là Địa lan kiếm (loài lan bản địa có nhiều hương) thuộc chi

Cymbidium [3] Các loài lan kiếm đó còn tồn tại đến ngày nay, được các gia đình

khá giả thích chơi các loài lan này và phát triển trong dân gian Hiện nay, một sốloài lan quý hiếm vẫn tồn tại như Thanh Ngọc, Mạc đen, Đại mạc biên, Đại mạc,Hoàng vũ, Thanh trường, Hoàng điểm, Bạch Ngọc, Bạch cập, Mạc xuân , giá trịmỗi chậu lan nhỏ lên tới vài triệu đồng thậm chí cả chục triệu đồng khi tết đến xuân

về [7]

Những nghiên cứu về lan kiếm Việt Nam thời kì đầu không rõ rệt lắm, có lẽ ngườiđầu tiên có khảo sát về lan ở Việt Nam là Gioalas Noureiro - nhà truyền giáo Bồ ĐàoNha, Ông đã mô tả cây lan ở Việt Nam lần đầu tiên vào năm 1789 Trong cuốn “Floracochin chinensis” gọi tên các cây lan trong cuộc hành trình đến Nam phần Việt Nam

là aerides, Phaius và Sarcopodium mà đã được Ben Tham và Hooker ghi lại trongcuốn “Genera plante rum” (1862- 1883) [3] Chỉ sau khi người Pháp đến Việt Namthì mới có những công trình nghiên cứu được công bố đáng kể là F.gagnepain vàA.gnillaumin mô tả 70 chi gồm 101 loài cho cả 3 nước Đông Dương trong bộ "Thựcvật Đông Dương chí" (Flora Genera Indochine) do H Lecomte chủ biên, xuất bản từnhững năm 1932 - 1934 Trong điều kiện hội nhập, đầu tư phát triển công nghiệp, đôthị và du lịch với tốc độ cao, nhu cầu về hoa cho nội tiêu và xuất khẩu gia tăng mạnh.Hoa, cây cảnh mang lại nguồn thu nhập đáng kể cho người trồng hoa, đồng thờithúc

đẩy du lịch, hội nhập và đời sống văn hóa tinh thần của quốc gia Đã có những công

ty hàng năm sản xuất và tiêu thụ hoa lan doanh thu lên hàng tỷ đồng như Sài gònOrchidex, công ty hoa Hoàng Lan , song các công ty này chủ yếu buôn bán cácgiống lan nhập nội Hiện nay trong nước có nhiều người sưu tầm và nghiên cứu

về lan và cũng có những công ty trồng lan để bán và xuất cảng nhưng với số vốnhạn hẹp, kỹ thuật thô sơ nên không thể nào cạnh tranh nổi với các nước láng giềngnhư Thái Lan, Đài Loan đã có mặt trên thị trường quốc tế từ lâu Ngoài ra, do quyluật quốc tế bảo vệ các giống vật và cây hiếm quý do quy ước Convention

on International Trade in Endangered Species of wild fauna and flora (CITIES) đãcấm mua bán một số đặc sản, cho nên hoa lan của Việt Nam khó lòng được chínhthức nhập cảng vào Hoa Kỳ Trong khi đó nhiều lái buôn đã thuê người vào rừngthẳm, núi cao để kiếm lan bất kỳ lớn, nhỏ quý giá hay không đem bán cho cáclái buôn Trung Quốc, Thái Lan hoặc Đài Loan với giá rẻ mạt: 2 - 3 USD/kg Nhữngcụm lan rừng vẫn được bày bán tại các hội hoa lan tại Santa Barbara hay South CoastPlaza có thể là xuất xứ tại Việt Nam (dẫn theo Bùi Xuân Đáng)

Các đề tài, dự án đã nghiên cứu:

- Đề tài (Nghiên cứu sinh): Nghiên cứu phát triển một số giống địa lan thơm

ở miền Bắc Việt Nam (1996 - 2001) Đã thu thập, đánh giá và nhân nhanh được một

số giống hoa địa lan thơm ở miền Bắc Việt Nam

- Đề tài: Điều tra, thu thập nguồn gen cây hoa cây cảnh trong toàn Quốc(1996-1999) Đề tài điều tra, thu thập, phân vùng nguồn gen cây hoa, cây cảnh trongtoàn quốc trong đó có cây hoa lan

- Đề tài: Nghiên cứu chọn tạo một số giống hoa có giá trị (Phong lan, địa lan,Hồng, cúc…) (2000 -2005) đã tuyển chọn được một số giống hoa có nguồn gốcnhập nội và xây dựng quy trình kỹ thuật nhân giống một số giống

- Dự án: Phát triển một số giống hoa địa lan ở Việt Nam (2003 - 2005) tậptrung nghiên cứu và hoàn thiện công nghệ nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào trên

một số giống lan thuộc chi lan Kiếm (Cymbidium) Các đề tài, dự án đang nghiên cứu:

- Đề tài: Nghiên cứu chọn tạo và kỹ thuật sản xuất tiên tiến một số loài hoachủ lực có chất lượng cao phục vụ nội tiêu và xuất khẩu (hoa hồng, cúc, lily và lancắt cành) (2006 - 2010) Mục tiêu đến năm 2010 phải tạo ra 8 đến 10 giống hoa(hồng, cúc, lily và lan cắt cành) và công nghệ nhân giống tiên tiến các giống trên.Hiện nay, đề tài đang được thực hiện, đối tượng các giống lan mà đề tài chọn làm

vật liệu nghiên cứu là các giống lan thuộc chi lan Hồ điệp (phalaenopsis), lan Kiếm (Cymbidium).

- Đề tài: Thu thập đánh giá nguồn gen hoa phong lan Việt Nam và lưu giữchúng tại hai vùng miền núi phía Bắc và đồng bằng Bắc Bộ, triển khai năm 2007.Vật liệu đề tài chú ý tới các loài phong lan của núi rừng phía bắc Việt Nam

- Đề tài: Nghiên cứu và phát triển một số cây trồng lợi thế tại một số tiểuvùng sinh thái đặc thù của miền núi phía Bắc, đề tài thường xuyên do Viện Khoahọc Nông nghiệp Việt Nam chủ trì được triển khai từ năm 2007 Đề tài đã cóchuyên đề đánh giá được tiềm năng của loài địa lan kiếm bản địa, đề xuất nên cónhững nghiên cứu sâu hơn

Như vậy, các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước, các đề tài, dự ánnghiên cứu về hoa lan của Việt Nam trong những năm gần đây tập trung vào một sốnội dung sau:

- Thu thập đánh giá một số loài địa lan thơm của miền Bắc Việt Nam

- Điều tra khảo sát nguồn gen hoa lan của Việt Nam

- Nhập giống, đánh giá và tuyển chọn một số giống hoa lan có nguồn gốc ởnước ngoài

- Nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống trong in vitro đối với lan Hồ điệp (phalaenopsis).

2.1.5 Tình hình nghiên cứu nhân giống địa lan kiếm trên thế giới và ở Việt Nam

Hiện nay, việc nhân giống địa lan kiếm thường sử dụng phương pháp laitruyền thống Bên cạnh đó, để tạo ra số lượng cây giống với sinh khối lớn các nhàchọn giống còn sử dụng kĩ thuật sinh học hiện đại để chọn lọc và nhân giống, bao

gồm kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân giống vô tính các loài Địa lankiếm, sử dụng phương pháp đột biến gây đa bội hóa Địa lan kiếm

Đối với phương pháp nhân giống truyền thống, yêu cầu số lượng giống lai tựnhiên đã được thu thập phải phong phú Con lai tự nhiên có thể là kết quả của 2 loàigiao phấn với nhau hoặc của các dòng trong cùng một loài giao phấn nhờ côn trùng.Điều kiện để một phép lai có thể xảy ra trong tự nhiên là 2 cá thể phải giống nhau

về mùa hoa, cùng khu phân bố và cùng kích thước hoa Điển hình nhất là cây lai

Hồng Hoàng, con lai tự nhiên giữa cây Hồng lan (Cym insigne) và cây Hoàng lan (Cym giganteum) Bản thân nhóm Hồng Hoàng có rất nhiều dạng khác nhau về

màu sắc cánh hoa và sắc tố đỏ trên cánh môi Tuy nhiên, phải nhờ đến bàn tay conngười, những phép lai giữa các loài rất cách biệt nhau mới có thể thực hiện Việc

tạo giống Cymbidium phát triển theo tiến trình thu thập giống hoang dại, nhờ có sự

hỗ trợ của những tiến bộ sinh học, đã đạt được những kết quả không ngờ [16]

Khoảng đầu thế kỷ này, một số lan rừng đã được thu thập từ các vùng rừngnhiệt đới đưa về trồng ở châu Âu Từ những giống hoang dại đó, những phép lai đãđược thực hiện Mục tiêu của những phép lai này là tạo được những giống có đặctính kinh tế và giá trị thẩm mỹ cao như hoa nhiều, lớn, bền, màu sắc sặc sỡ Đó

cũng chính là lý do tại sao Cymbidium không phải là cây nguyên sản ở châu Âu

nhưng các giống lai được nuôi trồng để cắt cành ở đây lại có số lượng rất lớn so vớicác châu lục khác [16]

Cây Cymbidium lai đầu tiên xuất hiện năm 1889 là cây Cym eburneolowianum (Cym eburneum x Cym.lowianum) Trong 20 năm tiếp theo, chỉ

xuất hiện thêm 14 con lai nữa nhưng chúng không có giá trị cao lắm Trong nhữngnăm đầu của thế kỷ 20, người ta tìm thấy ở Miến Điện và Đông Dương nhiều loài

giá trị, nhất là Cym Parishii, Cym insigne, Cym erythrostylum (Bạch hồng) có

màu sắc từ trắng đến hồng, chúng đã đóng vai trò quan trọng trong việc hình thànhcác con lai đẹp sau này [16]

Cym hookerianum và Cym lowianum đã được dùng để tạo ra những giống hoa màu xanh Cym eburneum (Bạch lan) và Cym insigne (Hồng lan) đã cho ra các

giống màu trắng và màu hồng Cym traceyanum cho ra các giống màu vàng Cym ansonii cho ra những giống màu đỏ và màu hồng Cym Parishiiđược dùng để tạo ra những giống có cánh môi đỏ thắm như Cymbidium Miretta Những công trình lai tạo, chọn giống Cymbidium vào đầu thế kỷ này đáng kể nhất là của H G Alexander, đã cho ra đời cây lai Cym Alexanderi Westonbirt (Cym eburneolowianum x Cym insigne) Cây này cho đến nay vẫn giữ một vị trí quan

trọng trong việc tạo ra các giống mới màu trắng, hồng, vàng, xanh, nhất là những

giống ra hoa vào mùa thu và mùa đông Cùng thời gian này, còn có cây lai Cym pauwelsii (Cym insigne x Cym lowianum), là cây đầu dòng để tạo ra những giống

có phát hoa lớn và sức phát triển mạnh như Cym Babylon (Cym Olympus x Cym Pauwelsii) Đến lượt mình, Cym Babylon lại là cây đầu dòng thông dụng để tạo ra

những giống mới có màu sắc rực rỡ [16]

Những năm gần đây có khuynh hướng tạo ra những giống Cymbidium có

màu sắc tinh khiết, không có sắc tố đỏ cả trên cánh môi Do đó, sẽ có những giốngchỉ có màu vàng, xanh hay trắng Phương pháp để đạt kết quả này là hồi giao nhiều

lần với Cym lowianum var Concolor (Thanh ngọc) Một hướng lai tạo khác không

kém lý thú là tạo ra những giống với nhiều màu sắc rực rỡ phối hợp với nhau: màu

2 cánh hoa và cánh môi khác với màu của 3 lá đài, hoặc cánh hoa có nhiều màu tạothành các đốm khảm Về hình dạng hoa thì ngày càng có những giống lai mới cócánh hoa và lá đài tròn , hoa kín và tròn Hoa nhiều trên một cành và độ bền của hoacắt cành cũng là những đặc điểm được quan tâm khi chọn tạo giống [16]

Một nhóm Cymbidium khác có kích thước thân, lá, hoa nhỏ hơn, gọi chung là Cymbidium miniature, cũng được lai tạo ra và chiếm một vị trí đáng kể cạnh nhóm

hoa lớn, do chúng thích hợp với điều kiện nhà ở ngày càng chật hẹp hiện nay

Những cây đầu dòng để tạo giống trong nhóm này có thể kể Cym Devonianum (Gấm ngũ hồ); Cym ensifolium (Mặc lan); Cym Pumilum và Cym Tigrinum, Cym Devonianum cho ra những giống có cành hoa buông thõng, màu xanh, vàng và nâu, cánh môi có bệt đỏ đậm; Cym ensifolium được khai thác ở 2 đặc tính di truyền là mùa hoa (cuối hè và thu) và hương thơm Cym tigrinum cho ra những con lai nở

hoa mùa xuân, cây thấp lùn, lá ngắn, giả hành nhỏ, hoa màu xanh đến vàng Nhưng

đáng kể nhất vẫn là Cym Pumilumđã cho ra nhiều giống miniature màu sắc phong

phú Ưu điểm của nhóm hoa nhỏ này là yêu cầu không khắt khe lắm về nhiệt độthấp để phân hóa hoa nên có thể nuôi trồng rộng rãi hơn ở nước ta [16]

Phương pháp sử dụng kĩ thuật sinh học hiện đại trong chọn lọc và nhângiống: Giữa những nhóm hoa lớn và hoa nhỏ cũng đã có những phép lai, tạo ra

những giống Cymbidium kết hợp được đặc điểm của cả 2 nhóm: hoa lớn trung bình,

số lượng hoa trên một cánh nhiều, dễ trồng trọt và năng suất hoa cao Việc lai tạogiống không ngừng lại ở việc thụ phấn, gieo hạt đơn giản mà còn dùng đến những

kỹ thuật sinh học hiện đại để tạo ra nhiều giống đa bội Cymbidium cũng là chi đầu

tiên của hoa lan được áp dụng thành công phương pháp cấy đỉnh sinh trưởng vànhân giống vô tính hàng loạt trong ống nghiệm để có số lượng cây giống lớn, đồngnhất và sạch bệnh trong một thời gian tương đối ngắn Hiện nay, xu hướng của cácnhà chọn giống là phối hợp giữa phương pháp lai tạo truyền thống với các kĩ thuậtsinh học phân tử hiện đại trong chọn giống thực vật nói chung cũng như chọn tạogiống Địa lan kiếm nói riêng

2.2 Giới thiệu về giống địa lan kiếm Bạch Ngọc

2.2.1 Phân loại khoa học

Tên Việt Nam: Lan kiếm bạch ngọc

Tên Latin: Cymbidium mastersii

Đồng danh: Cymbidium mastersii Griff ex Lindl 1845; Cymbidium affine Griff 1851; Cymbidium maguanense F.Y Liu 1996; Cymbidium mastersii var album Rchb f 1880 [16].

2.2.2 Nguồn gốc và sự phân bố

2.2.2.1 Nguồn gốc

Địa lan kiếm Bạch Ngọc được mô tả lần đầu tiên vào năm 1845 từ một câyđang nở rộ trong bộ sưu tập vườn ươm Loddiges ở Anh, nó được đặt tên theo JohnWilliam Masters (1792-1873), người làm việc tại Vườn Bách thảo ở Calcutta Cho

đến gần đây, sự phân bố Cym mastersii được biết đến là ở miền bắc Ấn Độ,

Myanmar (Miến Điện) và miền bắc Thái Lan Năm 1993 nó cũng được ghi nhận từtỉnh Vân Nam ở Trung Quốc Nó được tìm thấy từ độ cao 2950-7200 ft (900-2200m), nơi nó phát triển trên cây và đá trong rừng thường xanh, thường trong bóng râmsâu [15]

2.2.2.2 Sự phân bố

- Trên thế giới: miền bắc Ấn Độ, phía đông Himalaya; Bhutan, Myanmar;miền bắc Thái Lan và Trung Quốc ở độ cao từ 900 đến 2400 mét trên cây và đátrong rừng núi thường xanh hoặc thỉnh thoảng trên mặt đất mùn, rêu hoặc gỗ mụcnát [15]

- Tại Việt Nam: Loài mới ghi nhận ở vùng núi rừng Quảng Ninh, Thanh Hóa

và do các nhà thực vật học Leonid Aveyanov, Phan Kế Lộc, D.T.Đoan tìm thấy vàotháng 10 năm 2003

- Cymbidium mastersii vẫn chưa được IUCN phân hạng Tuy nhiên, nó đã

được đánh giá tạm thời là dễ bị tổn thương (VU) theo tiêu chí Danh sách đỏ củaIUCN [9] Nó được liệt kê trong Phụ lục II của CITES [12]

2.3 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào

2.3.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật

Gottlieb Haberlandt (1902) nhà thực vật học người Đức là người đầu tiênkhởi xướng ý tưởng nuôi cấy mô tế bào thực vật Ông đưa giả thuyết về tính toànnăng của tế bào trong cuốn sách “Thực nghiệm về nuôi cấy tế bào tách rời” Theoông mỗi tế bất kì của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triểnthành một cơ thể hoàn chỉnh Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bàoriêng rẽ đã phân hoá đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của

cả sinh vật đó Khi gặp điều kiện thuận lợi, mỗi tế bào đều có thể phát triển thànhmột cá thể hoàn chỉnh Đó là tính toàn năng của tế bào và là cơ sở lý luận củaphương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật [6]

2.3.2 Sự phân hoá tế bào

Sự sinh trưởng của tế bào gồm hai giai đoạn: Giai đoạn phân chia tế bào vàgiai đoạn giãn của tế bào Trong hai giai đoạn này tế bào chưa có những đặc trưngriêng về cấu trúc và chức năng Sau đó các tế bào bắt đầu phân hoá thành các môchuyên hoá để đảm nhận các chức năng khác nhau, các tế bào trong giai đoạn này

có đặc trưng riêng về cấu trúc và chức năng Có thể nói rằng sự phân hoá tế bào là

sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hoá [6]

2.3.3 Sự phản phân hoá tế bào

Sự phản phân hoá tế bào là quá trình ngược lại với sự phân hoá tế bào Các tếbào đã phân hoá trong các mô chức năng không mất đi khả năng phân chia củamình, trong những điều kiện thích hợp, chúng có thể quay lại đóng vai trò như các

mô phân sinh và có khả năng phân chia để tạo ra các tế bào mới [6]

2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.4.1 Vật liệu nuôi cấy

Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào thựcvật Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô - tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quanhay bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá ), các cấu trúc của phôi (lámầm, trụ lá mầm ), các cơ quan dự trữ (củ, thân, rễ )

Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khác nhau,trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình nuôi cấy, vìvậy việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý và tuổi củamẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu, mục đích và khả năngnuôi cấy.

Mẫu nuôi cấy trước khi đưa vào nuôi cấy phải được vô trùng Phương phápphổ biến nhất trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hoá chất có khả năng tiêudiệt vi sinh vật Hoá chất được lựa chọn để vô trùng mẫu phải đảm bảo 2 điều kiện:

Có khả năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít độc đối với mẫu Hiệu quả vôtrùng tuỳ thuộc vào thời gian, nồng độ và khả năng xâm nhập để tiêu diệt vi sinh vậtcủa hoá chất Một số hoá chất thường được sử dụng hiện nay để vô trùng mẫu là:Ca(OCl)2-hypoclorit canxi, NaClO-hypoclorit natri, oxy già, HgCl2- thuỷ ngânclorua, chất kháng sinh(gentamicin, ampixilin )

24.2 Điều kiện nuôi cấy

- Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô - tế bào thực vật, các thao tác vớimẫu cấy được tiến hành trong điều kiện vô trùng gồm buồng cấy vô trùng, các dụng

cụ cấy vô trùng và môi trường cấy vô trùng nhằm đảm bảo mẫu cấy sẽ không bịnhiễm vi sinh vật Để tạo điều kiện vô trùng, buồng cấy phải dùng đèn tử ngoạichiếu trong 30 phút sau đó được lau sạch bằng cồn 90°, dụng cụ và môi trường nuôicấy thường được khử trùng ở 121°C trong 25-30 phút

- Ánh sáng và nhiệt độ: Mẫu nuôi cấy thường được đặt trong phòng ổn định

về ánh sáng và nhiệt độ

2.4.3 Môi trường dinh dưỡng

Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tuỳ theo loài, bộ phận,các giai đoạn phát triển, phân hoá khác nhau của mẫu cấy và mục đích nuôi cấy nhưduy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hoặc tái sinh cây hoàn chỉnh [4]

Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật bao gồm cácthành phần chính sau:

2.4.3.1 Nguồn Cacbon

Mô cấy trong môi trường nuôi cấy in vitro không còn khả năng tự dưỡng do

không tiến hành quang hợp đầy đủ Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấynguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc Nguồn Cacbon cung cấp cho môitrường nuôi cấy thường là các loại đường, phổ biến nhất là saccharose với hàmlượng từ 20-30 g/l Ngoài ra còn có thể sử dụng các loại đường khác như fructose,rafinose, sorbitol, glucose, maltose, lactose, những loại đường này chỉ dùng trongnhững trường hợp cá biệt

2.4.3.2 Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng

Các chất vô cơ bao gồm thành phần khoáng đa lượng và khoáng vi lượng cótrong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật được sử dụng như là thành phần cơbản để tổng hợp chất hữu cơ [2] Các dạng ion của muối khoáng đóng vai trò quantrọng trong quá trình vận chuyển xuyên màng, điều hoà áp suất thẩm thấu và điệnthế màng

- Nguyên tố đa lượng:

Quan trọng nhất là các nguyên tố: N, P, K, Mg, Ca, Na, S

- Nguyên tố vi lượng: Chủ yếu là Fe, B, Mn, Cu, Zn, I, Ni các nguyên tố

vi lượng bổ sung với lượng nhỏ vào môi trường nhưng có vai trò quan trọng đốivới quá trình trao đổi chất, tổng hợp protein, hoạt động phân bào của mô, tế bàonuôi cấy [10]

2.4.3.3 Vitamin

Hầu hết các tế bào nuôi cấy có khả năng tổng hợp vitamin nhưng không đủ

về lượng nên cần bổ sung, nhất là nhóm vitamin B

- Vitamin B1 (Thiaminee HCl): Là chất bổ sung rất cần thiết cho môi trườngnuôi cấy, có vai trò trong trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp amino acid

- Vitamin B6 (Pyridocinen): Là coenzyme quan trọng trong nhiều phản ứngtrao đổi chất

- Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp

- Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế bào,tham gia vận chuyển đường, các nguyên tố khoáng, trao đổi hydratcacbon.

2.4.3.4 Chất hữu cơ tự nhiên

- Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng như inositol, các amino acid, đường,các chất thuộc nhóm cytokinin, các chất có hoạt tính auxin

2.4.3.5 Các thành phần khác

- Agar: Chiết xuất từ rong biển, thành phần của agar gồm một số chất hữu cơnhư acid hữu cơ, acid béo, cùng một số nguyên tố vô cơ như Cu, Fe, Zn Ngoài tácdụng tạo gel cho môi trường, agar cũng cung cấp một số chất dinh dưỡng cho tếbào, mô nuôi cấy

- Than hoạt tính: Dùng để hấp thụ chất màu, các hợp chất thứ cấp gây ức chếsinh trưởng của mẫu nuôi cấy Ngoài ra, có thể sử dụng một số chất chống oxy hoákhác như polyvinyl pyrolodon (PVP), acid ascorbic

2.4.3.6 pH của môi trường

Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận chất dinh dưỡngcủa mẫu từ môi trường nuôi cấy Đa số pH của môi trường được điều chỉnh trongkhoảng từ 5,5-6,0 Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm do mẫunuôi cấy sản sinh ra các acid hữu cơ

2.4.3.7 Các chất điều hoà sinh trưởng

Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần quyết định quá trình phát sinhhình thái thực vật Hiệu quả của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ

và nhóm chất điều hoà sinh trưởng

Dựa vào hoạt tính sinh lý có thể phân chất điều hoà sinh trưởng làm 2 nhóm:Nhóm chất kích thích sinh trưởng và nhóm ức chế sinh trưởng Trong nuôi cấy mô,

tế bào thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm thường được sử dụng

- Nhóm Auxin: Được phát hiện lần đầu tiên bởi Charles Darwin và con trai làFrancis Darwin khi thử nghiệm tính hướng sáng trên cây yến mạch Sau đó, nhiềunhà khoa học đã nghiên cứu và dần mở rộng hiểu biết về nhóm chất này Auxintrong cơ thể thực vật tập trung nhiều ở các chồi, lá non, hạt nảy mầm, trong phấn

hoa Auxin có nhiều tác động tới các hiệu ứng sinh trưởng và phát triển trên cơ thểthực vật Các auxin thường được sử dụng là: NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhân tạo),IAA (auxin tự nhiên).

- Nhóm Cytokinin: Được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ XX, chấtđầu tiên là Kinetin bắt nguồn từ tinh dịch cá trích Tiếp đó, đến zeatin tách từ nộinhũ của hạt ngô non Đã phát hiện cytokinin ở vi sinh vật, tảo silic, rêu, dương xỉ,cây lá kim Zeain có nhiều trong thực vật bậc cao và trong một số vi khuẩn Trongthực vật, cytokinin có nhiều trong hạt, quả đang lớn, mô phân sinh Cytokinin kíchthích hoặc ức chế nhiều quá trình sinh lý, trao đổi chất Cùng với auxin, cytokininđiều khiển sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽkích thích tạo rễ, ngược lại sẽ hình thành chồi Cytokinin cảm ứng sự hình thànhchồi bên và ức chế ưu thế đỉnh Quá trình sinh trưởng dãn dài của tế bào cũng chịuảnh hưởng của cytokinin Ngoài ra cytokinin còn làm chậm sự già hoá [4]

Trong các chất thuộc nhóm cytokinin thì Kinetin và BAP được sử dụng phổbiến vì hoạt tính mạnh: Kinetin (phối hợp cùng auxin vơi tỷ lệ thích hợp có khảnăng kích thích phân chia tế bào), BAP (hoạt tính mạnh, bền nhiệt), ngoài ra có thể

2.5 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô địa lan kiếm Bạch Ngọc trên thế giới

và trong nước

2.5.1 Trên thế giới

Năm 2012, nhóm tác giả Mohanty P , Paul S , Das MC , Kumaria S , TandonP.thuộc Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Khoa thực vật học, Đại họcHill Đông Bắc, Shillong, Meghalaya 793022, Ấn Độ đã tiến hành đề tài nghiên cứu:

Một phương thức đơn giản và hiệu quả cho việc nhân giống đại trà Cymbidium mastersii: phong lan cảnh của Đông Bắc Ấn Độ Bốn môi trường dinh dưỡng được

đánh giá cho sự nảy mầm và phát triển protocorm sớm: Murashige và Skoog (MS),1/2 MS, Knudson 'C' (KC), và Vacin và Went (VW) Ngoài ra, ảnh hưởng của cácchất điều hòa sinh trưởng thực vật 6-benzylaminopurine (BAP), kinetin (KN), axitaxetic α-naphthalene (NAA) và axit indole-3-butyric (IBA) đã được nghiên cứu mộtmình và kết hợp Tỷ lệ nảy mầm hạt giống tối đa (93,58 ± 0,56) thu được trong môitrường cơ sở MS sau 8-9 tuần nuôi cấy Protocorms thứ cấp (cơ quan giống nhưprotocorm) được phát triển từ protocorms chính trên môi trường MS củng cố vớinồng độ khác nhau và sự kết hợp của cytokinin (BAP và KN) và auxin (NAA vàIBA) Số lượng protocorms thứ cấp cao nhất (20.55 ± 0.62) / protocorms chính thuđược trong môi trường MS bổ sung với 5.0 µ M BAP và 2.5 µ M NAA Nguồnauxin hiệu quả nhất thúc đẩy sản xuất rễ (7,46 ± 0,09 mỗi lần chụp) là10,0 µ M IBA Thực vật đã được thích nghi một cách hiệu quả (tỉ lệ sống 88%)trong nhà kính sử dụng môi trường rễ của gạch và than vô trùng nghiền (1: 1v /v) và phân hữu cơ (lá xả + phân bò, 1: 1v / v) [14]

2.5.2 Trong nước

Các đề tài, dự án đã nghiên cứu:

- Đề tài (Nghiên cứu sinh): Nghiên cứu phát triển một số giống địa lan

thơm ở miền Bắc Việt Nam (1996 - 2001) Đã thu thập, đánh giá và nhânnhanh được một số giống hoa địa lan thơm ở miền Bắc Việt Nam

- Dự án: Phát triển một số giống hoa địa lan ở Việt Nam (2003 - 2005) (dự ánP) tập trung nghiên cứu và hoàn thiện công nghệ nhân giống bằng nuôi cấy mô tế

bào trên một số giống lan thuộc chi lan Kiếm (Cymbidium).

- Đề tài: Nghiên cứu và phát triển một số cây trồng lợi thế tại một số tiểuvùng sinh thái đặc thù của miền núi phía Bắc, đề tài thường xuyên do Viện Khoahọc Nông nghiệp Việt Nam chủ trì được triển khai từ năm 2007 Đề tài đã cóchuyên đề đánh giá được tiềm năng của loài địa lan kiếm bản địa, đề xuất nên cónhững nghiên cứu sâu hơn

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Loài địa lan kiếm Bạch Ngọc thu thập từ Vườn lan

Đỗ Khắc Nguyên - Huyện Đồng Hỷ - Thành phố Thái Nguyên

Vật liệu nghiên cứu: phôi quả 8 tháng tuổi và rễ tái sinh từ phôi hạt.

- Phạm vi nghiên cứu:

+ Xác định môi trường tái sinh chồi từ phôi địa lan kiếm Bạch Ngọc

+ Xác định môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh địa lan kiếm Bạch Ngọc.+ Xác định được nồng độ một số chất kích thích sinh trưởng thích hợp chokhả năng nhân nhanh rễ địa lan kiếm Bạch Ngọc

+ Xác định được nồng độ một số chất kích thích sinh trưởng thích hợp chokhả năng tạo chồi địa lan kiếm Bạch Ngọc từ rễ

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.2.1 Nội dung 1: Xác định môi trường tái sinh chồi từ phôi địa lan kiếm Bạch Ngọc

- Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường nuôi cấy đếnkhả năng tái sinh chồi địa lan kiếm Bạch Ngọc

3.2.2 Nội dung 2: Xác định môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh địa lan kiếm Bạch Ngọc.

- Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của câyĐịa lan kiếm Bạch Ngọc

- Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tínhđến khả năng ra rễ của cây địa lan kiếm Bạch Ngọc

3.2.3 Nội dung 3: Nghiên cứu môi trường nhân nhanh rễ địa lan kiếm Bạch Ngọc in vitro

- Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng tạo rễ địa lankiếm Bạch Ngọc

- Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA kết hợp với IBA đến khảnăng tạo rễ địa lan kiếm Bạch Ngọc

- Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA kết hợp với IBA và NAAđến khả năng tạo rễ địa lan kiếm Bạch Ngọc

3.2.4 Nội dung 4: Nghiên cứu môi trường kích chồi địa lan kiếm Bạch Ngọc từ rễ

in vitro.

- Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của kinitine đến khả năng tạo chồi

địa lan kiếm Bạch Ngọc từ rễ.

- Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của kinitine kết hợp với BA đến khảnăng tạo chồi địa lan kiếm Bạch Ngọc từ rễ

- Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của kinitine kết hợp với BA và NAAđến khả năng tạo chồi địa lan kiếm Bạch Ngọc từ rễ

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro

Sử dụng các môi trường MS, RE có bổ sung agar 5,5 g/l, đường 30g/l, nướcdừa 150ml/l, Myo-inositol 100mg/l, các chất BA, Kinetin, NAA (mg/l), IAA, IBA,than hoạt tính (g/l) có hàm lượng thay đổi tùy theo từng thí nghiệm, PH=5,6-5,8

Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng bổ sung vào MT nuôi cấy với hàmlượng khác nhau tùy từng thí nghiệm

Thể tích MT nuôi cấy trong mỗi bình nuôi cấy là 50-70 ml/bình

Môi trường được hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1atm trong 15 phút

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu

Phôi hạtCấy vào 4 môi trường: MS, 1/2MS, RE, ½RE

và lựa chọn môi trường thích hợp nhất làm

môi trường nềnTái sinh chồi

Môi trường nền bổ sung lần lượt NAA và THT

Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

Môi trường nền lần lượt bổ sung IAA, IBA vàNAA

Nhân nhanh rễ

Môi trường nền lần lượt bổ sung kinetin, BA

và NAATạo chồi từ rễ

Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu tạo chồi địa lan kiếm Bạch Ngọc từ rễ bằng phương

pháp in vitro

-Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi côngthức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình 3 mẫu.

3.3.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh chồi địa lan kiếm Bạch Ngọc

- Phôi hạt 8 tháng tuổi được cấy chuyển sang nuôi cấy trên các môi trườngkhác nhau, sau đó đặt trong phòng nuôi cấy với điều kiện thích hợp Tiến hành theodõi, quan sát chồi tái sinh và hình thái chồi tái sinh

- Môi trường thích hợp nhất sẽ dùng làm môi trường nền cho các thínghiệm tiếp theo

- Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh chồi địa lan kiếm Bạch Ngọc

Thí nghiệm được bố trí như sau:

Công thức thí nghiệm Môi trường