Nghiên cứu bào chế nano polyme fluconazol

thể tích pha ngoại 3.14 Công thức bào chế nano fluconazol được lựa chọn 30 3.15 Kích thước của tiểu phân nano trong các môi trường khác nhau... Danh mục các hình vẽ, đồ thị 1.1 Sơ đồ phư

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

============

TRẦN THỊ HUỆ

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ NANO PIROXICAM BẰNG PHƯƠN TỦA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn:

ThS Nguyễn Thị Mai Anh

DS Đào Minh Huy

Là những thày cô đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em cũng chân thành cảm ơn:

Các thày cô trong Ban giám hiệu, các bộ môn, phòng Đào tạo và cán bộ các phòng ban trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy dỗ em trong những năm tháng học tập tại trường

Các thày cô và kỹ thuật viên bộ môn Bào chế, bộ môn Công nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận này

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã cổ vũ, động viên giúp đỡ em hoàn thành khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2013

Sinh viên Trịnh Ngọc Dương

MỤC LỤC

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ và đồ thị

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương I: TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cương về hệ nano 2

1.1.1 Khái niệm công nghệ nano 2

1.1.2 Tính chất của tiểu phân nano 2

1.1.3 Ưu nhược điểm của tiểu phân nano 3

1.1.4 Một số cấu trúc hệ nano vận chuyển thuốc 4

1.2 Nano polyme 4

1.2.1 Giới thiệu 4

1.2.2 Một số phương pháp bào chế nano polyme 5

1.3 Fluconazol 8

1.3.1 Công thức hóa học 8

1.3.2 Tính chất 9

1.3.3 Tác dụng, chỉ định 9

1.3.4 Các dạng bào chế có trên thị trường 10

1.4 Một số nghiên cứu bào chế nano fluconazol 10

Chương II: NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên liệu 15

2.2 Phương tiện 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Bào chế nano fluconazol 16

2.3.2 Xác định độ tan của fluconazol 16

2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của tá dược và thiết bị đến sự hình thành hệ nano 18

2.3.4 Đánh giá một số đặc tính của tiểu phân nano 18

2.3.5 Định lượng 19

2.3.6 Đánh giá khả năng giải phóng dược chất từ hệ nano 20

Chương III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 23

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của tá dược và thông số kỹ thuật đến hệ nano 23

3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của một số thông số kỹ thuật 23

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của các tá dược 24

3.2 Đánh giá một số đặc tính của hệ nano 31

3.2.1 Kích thước, phân bố kích thước của tiểu phân 31

3.2.2 Thế Zeta của tiểu phân 32

3.2.3 Hình dạng và cấu trúc tiểu phân 33

3.3 Xác định hiệu suất quy trình bào chế nano fluconazol 34

3.4 Sơ bộ đánh giá khả năng giải phóng dược chất từ hệ nano 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38

KẾT LUẬN 38

KIẾN NGHỊ 39 Phụ lục

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography) HPMC Hydroxypropyl methyl cellulose

KHV Kính hiển vi NLC Hệ vận chuyển lipid có cấu trúc nano (Nanostructured lipid carrier) PBS Đệm phosphate (Phosphate Buffered Saline) PDI Chỉ số đa phân tán (Polydispersion index)

PEG Polyethylen glycol

PG Propylen glycol PLA Poly (d,l-lactic acid) PVA Alcol polyvinic SLN Nano lipid rắn (Solid lipid nanoparticle) TEM KHV điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscopy)

Danh mục các bảng

2.1 Nguyên liệu sử dụng trong quá trình thực nghiệm 15

3.2 Công thức bào chế nano fluconazol sử dụng các dung môi khác

thể tích pha ngoại 3.14 Công thức bào chế nano fluconazol được lựa chọn 30 3.15 Kích thước của tiểu phân nano trong các môi trường khác nhau

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

1.1 Sơ đồ phương pháp nhũ hóa bay hơi dung môi 5

1.3 Sơ đồ phương pháp nhũ hóa khuếch tán dung môi 7

2.1 Sơ đồ quy trình bào chế nano polyme fluconazol 17 2.2 Hệ thống đánh giá giải phóng thuốc qua màng Hanson Research 21 3.1 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi kích thước của tiểu phân nano

fluconazol trong các môi trường khác nhau

31

3.2 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi thế Zeta của tiểu phân nano

fluconazol trong các môi trường khác nhau

3.4 Đồ thị biểu diễn phần trăm fluconazol giải phóng trong 7 giờ của

hỗn dịch fluconazol nguyên liệu và hỗn dịch nano

36

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hơn 50 năm qua, công nghệ nano được nghiên cứu liên tục trên thế giới và đang được phát triển ứng dụng trên nhiều lĩnh vực ở Việt Nam Trong ngành dược, những dạng thuốc nano đã góp phần không nhỏ vào sự phát triển của công nghệ bào chế hiện đại

Thuốc nano có thể áp dụng cho tất cả các đường dùng, tuy nhiên, tác dụng trên da

là cách dùng được xem là ít độc nhất đối với cơ thể Trong bào chế thuốc điều trị bệnh ở da, các nhà khoa học phải đối mặt với hai thách thức lớn: một là thuốc phải xuyên qua được lớp sừng và thấm qua lớp biểu bì; hai là thuốc phải được lưu giữ lâu trên da (ít hấp thu qua da để vào vòng tuần hoàn chung gây tác dụng toàn thân) Đây là hai vấn đề đối nghịch nhau và khó giải quyết ở những dạng thuốc bôi thông thường Những đặc tính mới của thuốc nano có thể được ứng dụng để giải quyết hai khó khăn này, cải thiện hiệu quả điều trị các bệnh ở da

Fluconazol là thuốc chống nấm tổng hợp thuộc nhóm triazol được chỉ định điều trị nhiễm nấm Candida ở miệng họng, thực quản, âm đạo hoặc toàn thân Hiện nay, fluconazol chủ yếu được dùng qua đường uống và tiêm truyền trong khi những chế phẩm tác dụng tại chỗ trên da còn hạn chế Do vậy để có thể bước đầu xây dựng phương pháp bào chế dạng dùng qua da của fluconazol bằng cách ứng dụng công

nghệ nano, chúng tôi tiến hành đề tài ―Nghiên cứu bào chế nano polyme fluconazol ‖, với hai mục tiêu chính sau:

1- Bào chế hệ tiểu phân nano polyme fluconazol

2- Đánh giá một số đặc tính của hệ tiểu phân nano polyme fluconazol

Chương I: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về hệ nano

1.1.1 Khái niệm công nghệ nano

Công nghệ nano là khoa học sáng tạo ra các nguyên liệu, thiết bị và hệ thống hữu ích nhờ các thao tác, sắp xếp ở mức nguyên tử, phân tử và các cấu trúc siêu phân tử, đồng thời khai thác các đặc tính và hiện tượng mới xuất hiện khi vật chất ở kích thước nano

Công nghệ nano có ba thuộc tính quan trọng là:

- Các thao tác thực hiện ở mức nano

- Kích thước vật liệu ở mức nano

- Kết quả của công nghệ nano là tạo ra vật liệu, thiết bị, hệ thống hữu ích mới [4] Theo bách khoa về công nghệ dược phẩm, tiểu phân nano được định nghĩa là ―các tiểu phân keo rắn có kích thước từ 1 đến 1000 nm Chúng chứa các vật liệu phân tử lớn và có thể được sử dụng trong điều trị như là hệ mang thuốc, trong đó các chất có hoạt tính được hòa tan, bao, hấp phụ hoặc gắn lên hệ‖ [15] Một số tài liệu y dược hiện nay giới hạn kích thước tiểu phân nano dưới 500 nm

1.1.2 Tính chất của tiểu phân nano

1.1.2.1 Kích thước tiểu phân

Kích thước và phân bố kích thước ảnh hưởng đến độ ổn định, khả năng giải phóng dược chất và đưa thuốc tới đích [3]

Nhờ kích thước nhỏ, tiểu phân nano có khả năng hấp thụ vào tế bào nhiều hơn so với tiểu phân kích thước micro và có thể tác dụng vào nhiều tế bào đích hơn Nano polyme polybutyl cyanoacrylat làm tăng khả năng đưa nhiều thuốc qua hàng rào máu não như dalargin, doxorubicin [31]

Khi kích thước tiểu phân càng nhỏ, diện tích bề mặt càng lớn, càng nhiều các phân tử dược chất sẽ ở trên hoặc gần bề mặt tiểu phân nên khả năng giải phóng của dược chất được tăng cường [20]

1.1.2.2 Đặc tính bề mặt

Diện tích bề mặt của tiểu phân nano lớn làm tăng lực hút Van Der-Waals nên khả

năng kết tập của chúng cao hơn [3]

Điện tích bề mặt là đặc tính quan trọng đánh giá tính chất bề mặt của tiểu phân Giá trị tuyệt đối của thế Zeta trên +30 mV được cho là có khả năng ngăn cản sự kết

tụ tiểu phân, do đó tăng độ ổn định của hỗn dịch nano [20]

Nhằm đạt được tác dụng tại đích, bề mặt tiểu phân nano được gắn các chất giúp nhận biết tế bào đích theo cơ chế kháng nguyên - kháng thể, ligand - receptor như folat, transferin, kháng thể [30] Để giảm sự opsonin hóa, bề mặt tiểu phân được gắn các polyme thân nước như PEG giúp kéo dài thời gian di chuyển trong vòng tuần hoàn của cơ thể [3], [30]

1.1.2.3 Đặc tính từ và quang học

Nhiều loại tiểu phân nano có tính từ và quang học Từ tính của tiểu phân nano tinh thể có kích thước từ 10 đến 20 nm với nhân Fe2+ và Fe3+ bao phủ bởi dextran hoặc PEG đã được ứng dụng để đánh dấu các phân tử sinh học [26] Dựa vào từ tính của tiểu phân, trường điện từ được sử dụng để đưa thuốc đến các mô đích trong cơ thể [22]

Trong lĩnh vực chẩn đoán lâm sàng, tiểu phân nano như chấm lượng tử có khả năng khắc phục những nhược điểm của các chất phát huỳnh quang hữu cơ như kém bền với ánh sáng, cường độ thấp [26]

1.1.3 Ưu nhược điểm của tiểu phân nano

1.1.3.1 Ưu điểm

- Tác dụng tại đích

- Tăng độ an toàn, giảm tác dụng phụ

- Phù hợp với nhiều đường dùng như đường tiêu hóa, đường tiêm, qua da

- Tăng hấp thu, tăng sinh khả dụng của thuốc

- Tăng hoạt tính sinh học của dược chất

- Ổn định trong máu và có thời gian tuần hoàn dài [3], [20], [22]

1.1.3.2 Nhược điểm

- Bào chế khó khăn, giá thành sản phẩm cao

- Có thể gây dị ứng, gây tăng độc tính một số dược chất

- Khó khăn trong bảo quản

- Dược chất có thể bị giải phóng đột ngột do khó kiểm soát kích thước và cấu trúc tiểu phân [3], [20], [22]

1.1.4 Một số cấu trúc hệ nano vận chuyển thuốc

Hệ nano có thể chia làm hai loại: sử dụng chất mang và không sử dụng chất mang Một vài cấu trúc hệ nano có sử dụng chất mang [24]:

Bảng 1.1: Một số cấu trúc của hệ nano

Nano lipid Nano polyme Các cấu trúc khác

Ba cơ chế giải phóng dược chất chính tại mô tế bào của tiểu phân nano polyme:

- Polyme trương nở, sau đó dược chất khuếch tán ra ngoài

- Phản ứng xúc tác enzyme gây ra vỡ, thoái hóa polyme làm giải phóng lõi dược chất

- Dược chất bị tách ra khỏi polyme và giải phóng hoặc phản hấp phụ từ tiểu phân nano đã trương nở

Các polyme thường được sử dụng:

- Polyme tự nhiên: chitosan, gelatin, natri alginat, albumin

- Polyme nhân tạo: poly lactic acid, polyanhydrid, polyorthoester, poly glutamic acid, poly methacrylic acid, poly acrylamid [21], [32]

1.2.2 Một số phương pháp bào chế nano polyme

1.2.2.1 Nhũ hóa bay hơi dung môi

Polyme được hòa tan trong dung môi hữu cơ không đồng tan với nước và dễ bay hơi như diclomethan, ete, chloroform; dược chất được hòa tan hoặc phân tán trong dung dịch này Hỗn hợp trên được phân tán vào pha nước có chất nhũ hóa để hình thành nhũ tương Sau đó dung môi hữu cơ được bay hơi dưới áp suất thấp hoặc khuấy liên tục để hình thành tiểu phân nano Pha ngoại được loại bằng cách ly tâm hoặc lọc [9], [23], [24] Để tạo ra tiểu phân nano có kích thước nhỏ thường phải dùng máy đồng nhất hóa tốc độ cao hoặc siêu âm [20] Phương pháp có những hạn chế như sử dụng các dung môi hữu cơ diclomethan, chloroform [24] và khó mở rộng quy mô sản xuất [9]

Hình 1.1: Sơ đồ phương pháp nhũ hóa bay hơi dung môi

1.2.2.2 Keo tụ hay gel hóa ion

Một số hệ nano polyme thân nước như chitosan, gelatin, natri alginat được bào chế theo cách này Hai pha nước được trộn lẫn vào nhau, một pha chứa polyme mang điện dương và pha còn lại có chất mang điện âm (như natri tripolyphosphat) Tương tác tĩnh điện giữa hai pha gây keo tụ tạo tiểu phân nano [20]

Bay hơi dung môi

Bước 1

Bước 2

Pha dầu: polyme, dược chất trong dung môi hữu cơ

Pha nước có chất ổn định

Hình 1.2:Sơ đồ phương pháp keo tụ ion

1.2.2.3 Nhũ hóa khuếch tán dung môi

Polyme được hòa tan trong dung môi đồng tan với nước như aceton Dung dịch này được bão hòa với nước để tạo cân bằng nhiệt động, sau đó được nhũ hóa vào pha nước có chứa chất ổn định Thêm nước vào nhũ tương gây ra sự khuếch tán của dung môi hữu cơ sang pha ngoại dẫn đến hình thành tiểu phân nano

Phương pháp tách muối có thể coi là sự cải tiến của phương pháp trên Đầu tiên polyme được hòa tan trong dung môi đồng tan với nước Nhũ tương của dung dịch này trong nước vẫn có thể tạo thành bằng cách hòa tan lượng lớn muối hoặc sucrose

ở pha ngoại gây ra hiệu ứng tách muối mạnh Sau đó nhũ tương này được pha loãng bằng nước để hình thành tiểu phân nano [9], [24], [25]

1.2.2.4 Kết tủa do thay đổi dung môi

Polyme được hòa tan trong dung môi có độ phân cực trung bình đồng tan với nước Phối hợp dung dịch này vào pha nước chứa chất diện hoạt được khuấy trộn với tốc độ thích hợp Do sự khuếch tán nhanh của dung môi sang pha nước nên polyme bị tủa hình thành các tiểu phân nano [21]

1.2.2.5 Phương pháp polyme hóa

Các monome được polyme hóa bằng xúc tác hoặc thay đổi pH môi trường để hình thành tiểu phân nano Dược chất được đưa vào bằng cách hòa tan trong môi trường

Dung dịch STPP

Đồng nhất

Hệ nano mang dược chất Dung dịch chitosan và

dược chất

polyme hóa hoặc hấp phụ lên trên tiểu phân nano đã hình thành [20] Có ba cách phổ biến là nhũ tương polyme hóa, polyme hóa bề mặt, đông tụ polyme bề mặt [25]

Hình 1.3: Sơ đồ phương pháp nhũ hóa khuếch tán dung môi

Hình 1.4: Sơ đồ phương pháp kết tủa

1.2.2.6 Dùng dung môi siêu tới hạn

Dung môi thường được sử dụng là carbonic (CO2) siêu tới hạn Hai phương pháp chính như sau:

- Dùng dung môi như methanol để hòa tan polyme và dược chất Dung dịch này được bơm vào CO2 siêu tới hạn Bởi methanol đồng tan còn dược chất và polyme

Dung môi hữu cơ:

Dược chất, polyme, chất diện hoạt

Pha nước: chất ổn định (diện hoạt)

trong nước

Dung môi Bay hơi

Loại dung môi Nước

Pha nước: Chất

ổn định trong nước Polyme và dược chất trong dung môi hữu cơ

không tan trong dung môi siêu tới hạn nên các chất tan bị kết tủa, hình thành tiểu phân nano [20], [24]

- Chất tan được hòa tan vào CO2 siêu tới hạn ở áp suất cao, sau đó áp suất được giảm đột ngột gây tủa chất tan [3], [20], [25]

1.2.2.7 Thẩm tích

Polyme được hòa tan trong dung môi hữu cơ và đưa vào túi thẩm tích chỉ cho phân tử có khối lượng xác định đi qua Quá trình thẩm tích được tiến hành với một chất lỏng khác đồng tan với dung môi trên nhưng không hòa tan polyme Sự dịch chuyển của dung môi trong màng thẩm tích dẫn đến kết tủa polyme, tạo ra hỗn dịch

có kích thước tiểu phân nano [25]

Hình 1.6: Công thức hóa học của fluconazol

Công thức phân tử: C13H12F2N6O Khối lượng phân tử: 306,3 Tên khoa học: 2,4-difluoro-1’,1’-bis (1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl) benzyl alcol

Xác định: Fluconazol phải chứa từ 98,5 đến 101,5% C13H12 F2N6O tính theo chế phẩm đã làm khô [1]

1.3.2 Tính chất

1.3.2.1 Tính chất vật lý

- Đặc tính: Bột kết tinh hay tinh thể màu trắng hoặc gần như trắng, háo ẩm

- Độ tan: Dễ tan trong methanol, tan trong ethanol, aceton; khó tan trong nước, dicloromethan và trong acid acetic Không tan trong ete [1], [8]

- Fluconazol nguyên liệu: Chuẩn độ trong môi trường khan

- Viên nang fluconazol: Định lượng bằng quang phổ tử ngoại [1]

1.3.3 Tác dụng, chỉ định

1.3.3.1 Tác dụng

Fluconazol là thuốc đầu tiên của nhóm thuốc tổng hợp triazol chống nấm mới Fluconazol có tác dụng chống nấm do làm biến đổi màng tế bào, làm tăng tính thấm

màng tế bào, làm thoát các yếu tố thiết yếu (thí dụ amino acid, kali) và làm giảm nhập các phân tử tiền chất (thí dụ purin và pyrimidin tiền chất của DNA) Fluconazol tác động bằng cách ức chế cytochrom P45014 - alpha - demethylase, ngăn chặn tổng hợp ergosterol là sterol chủ yếu ở màng tế bào nấm [2]

1.3.3.2 Chỉ định

- Fluconazol được chỉ định trong điều trị các bệnh nấm Candida ở miệng - họng, thực quản, âm hộ - âm đạo và các bệnh nhiễm nấm Candida toàn thân nghiêm trọng khác (như nhiễm Candida đường niệu, màng bụng, máu, phổi và nhiễm Candida phát tán) Thuốc cũng được dùng để chữa viêm màng não do Cryptococcus neoformans, các bệnh nấm do Blastomyces, Coccidioides immitis và Histoplasma

- Fluconazol cũng dùng để dự phòng nhiễm nấm Candida cho người ghép tủy xương đang điều trị bằng hóa chất hoặc tia xạ Ngoài ra thuốc còn được dùng để phòng các bệnh nhiễm nấm trầm trọng (như nhiễm nấm Candida, Cryptococcus, Histoplasma, Coccidioides immitis) ở người bệnh nhiễm HIV [2]

1.3.4 Các dạng bào chế có trên thị trường

- Dạng uống:

+ Viên nén 50 mg, 100 mg, 200 mg (Diflucan) [7]

+ Viên nang 50 mg (Farcozol), 150 mg (Flucomedil), 100 mg, 200 mg (Trican) + Dung dịch uống 5 mg/ml; bột pha hỗn dịch uống 10 mg/ml, 40 mg/ml (Diflucan)

- Dạng tiêm truyền tĩnh mạch: lọ 50 mg/25 ml, 200 mg/100 ml trong dung dịch natri clorid 0,9% (Diflucan)

- Dạng gel 0,5% dùng ngoài da (Diflucan, Zocon Transgel)

1.4 Một số nghiên cứu bào chế nano fluconazol

Bhalaria M và cộng sự nghiên cứu bào chế ethosom fluconazol bằng phương pháp đồng nhất hóa theo quy trình:

- Hòa tan fluconazol trong hỗn hợp dung môi ethanol và PG (1)

- Phân tán phosphatidyl cholin đậu nành trong nước (2)

- Phối hợp (1) vào (2), sau đó lần lượt siêu âm và đồng nhất ở áp suất cao

Tác giả cũng đồng thời bào chế liposom fluconazol như sau:

- Cất quay dung dịch fluconazol, cholesterol, phosphatidyl cholin đậu nành trong hỗn hợp cloroform và methanol để tạo lớp film

- Hydrat hóa bằng nước

- Nhũ tương sau đó được siêu âm và đồng nhất hóa

Ethosom có kích thước trung bình 188 nm, hiệu suất ethosom hóa đạt 72,21% Trong khi đó, liposom có kích thước trung bình 212 nm và hiệu suất liposom hóa là 62,23% Tiểu phân ethosom có bề mặt nhẵn, hình cầu và đa lớp Ethosom được đưa

vào gel HPMC với mục đích dùng ngoài da Nghiên cứu in vitro cho thấy khả năng

khuyếch tán của ethosom qua da chuột cao gần gấp đôi so với liposom và gấp ba lần cồn thuốc fluconazol [6]

Shah R R và cộng sự nghiên cứu bào chế nano nhũ tương fluconazol với dung môi pha nội là isopropyl myristat, hỗn hợp chất diện hoạt labrasol và labrac lipofil trong nước Nhũ tương dầu trong nước thu được có kích thước giọt từ 122 đến 418

nm, thế Zeta từ -0,596 đến -0,114 mV Trong thử nghiệm in vitro trên da, sau 6 giờ,

lượng thuốc giải phóng đạt từ 70% đến 90,2% Công thức tối ưu giải phóng nhiều gấp 5 lần chế phẩm thị trường cho thấy vi nhũ tương có khả năng cải thiện hiệu quả dùng đường da của fluconazol [28]

Yadav M và Ahuja M đã bào chế nano polyme fluconazol bằng phương pháp nhũ hóa tạo liên kết chéo với polyme cordia chiết từ quả cây C obliqua theo quy trình:

- Nhũ hóa dung dịch fluconazol và polyme trong nước vào diclomethan chứa chất diện hoạt natri dioctyl sulfosuccinat, sử dụng siêu âm

- Nhũ hóa nhũ tương trên vào dung dịch PVA 3,5% (siêu âm)

- Thêm calci clorid 60%

- Khuấy từ bay hơi dung môi

- Cất quay chân không

- Ly tâm và đông khô thu lấy hệ nano

Sản phẩm thu được có kích thước tiểu phân từ 315,7 đến 847,1 nm, thế Zeta từ 53,4 đến -37,9 mV, hiệu suất nang hóa từ 27,2 đến 93% Công thức tối ưu được bào chế dưới dạng hỗn dịch nhỏ mắt Khả năng giải phóng sau 2 giờ của hỗn dịch này tương đương với dung dịch fluconazol trên thị trường [34]

Schwarz J C và cộng sự nghiên cứu bào chế liposom fluconazol với dẫn chất lysin bằng phương pháp hydrat hóa film theo quy trình:

- Cất quay dung dịch 1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphocholin trong cloroform

để tạo lớp film

- Hydrat hóa rồi siêu âm tạo liposom

- Đưa fluconazol và olygolysin vào trong liposom

Sản phẩm liposom thu được có kích thước từ 37,00 ± 1,80 nm đến 72,43 ± 12,48 nm; PDI từ 0,2 đến 0,3 và thế Zeta là từ +3 đến +10 mV Hiệu suất nang hóa thấp, chỉ đạt khoảng 4% Liposom có hình cầu, đơn lớp Kết quả thử giải phóng qua da trên bình Franz cho thấy hệ nano giải phóng rất chậm: sau 8 giờ, chỉ có 7% fluconazol được giải phóng [27]

Jadhav K và cộng sự bào chế nano nhũ tương fluconazol theo quy trình:

- Fluconazol được hòa tan trong isopropyl palmytat hoặc dầu parafin nhẹ

- Pha dầu được nhũ hóa vào nước có hai chất diện hoạt Aerosol OT và sorbitan monoleat dùng khuấy từ

Sản phẩm thu được có kích thước giọt dưới 100 nm Mẫu dùng isopropyl palmytat

có kích thước đồng đều và thấm qua da tốt hơn mẫu dùng dầu parafin Nano nhũ

tương được bào chế với Carbopol 940 thành gel dùng ngoài da Đánh giá in vitro

cho thấy không có kích ứng trên da và tác dụng chống nấm tương đương chế phẩm cùng loại trên thị trường [14]

Nano nhũ tương fluconazol tiếp tục được Kumar K J R và cộng sự nghiên cứu với dung môi pha nội là acid oleic, pha ngoại là dung dịch Tween 80 và PG trong nước Sản phẩm tạo thành có kích thước giọt từ 23 đến 100 nm, thế Zeta từ +29,3 đến +31,2 mV Nano nhũ tương được bào chế với gôm xanthan thành gel dùng

ngoài da Kết quả thử giải phóng in vitro cho thấy: sau 7 giờ, lượng fluconazol giải

phóng là 72,23% Tác dụng diệt nấm Aspergillus niger của nano nhũ tương tốt hơn

so với chế phẩm thị trường [16]

Gupta M và cộng sự nghiên cứu bào chế SLN và NLC fluconazol với Compritol

888 ATO là lipid rắn và acid oleic là lipid lỏng bằng phương pháp khuếch tán dung môi theo quy trình:

- Các lipid được hòa tan trong hỗn hợp aceton và ethanol

- Nhũ hóa dung dịch trên vào nước có chất diện hoạt phosphatidyl cholin và Pluronic F-68

- Điều chỉnh pH về 1,2 bằng acid hydrocloric để tạo hệ nano

Kích thước, thế Zeta của SLN và NLC lần lượt là 134,3 ± 5,2 nm, -29 ± 2,4 mV

và 178,9 ± 3,8 nm, -25 ± 3,7 mV Hiệu suất nang hóa của NLC là 81,4%, tốt hơn so

với mẫu SLN Kết quả thử giải phóng in vitro cho thấy NLC giải phóng nhiều gấp 5

lần dung dịch thường và 3,3 lần so với SLN sau 12 giờ [11]

Sau nghiên cứu vào năm 2011 về SLN fluconazol, Gupta M và cộng sự tiếp tục bào chế niosom của dược chất này bằng phương pháp hydrat hóa film với các loại Span và Brij khác nhau Hệ nano khi dùng Span 40, Span 60, Brij 72 ổn định nhất,

có kích thước tiểu phân lần lượt là 378 ± 22 nm, 343 ± 63 nm và 287 ± 12 nm Hiệu suất nang hóa của các mẫu trên 41% Ba mẫu này được lựa chọn để thử giải phóng

in vitro qua da và đều có khả năng kéo dài giải phóng fluconazol [12]

Sharma S K và cộng sự nghiên cứu bào chế niosom fluconazol bằng kĩ thuật tiêm ete theo quy trình:

- Hòa tan Span 60, cholesterol và fluconazol vào cloroform

- Dung dịch trên được tiêm chậm qua kim vào đệm phosphat pH 7,4

- Siêu âm hỗn hợp rồi lọc qua màng 0,2 µm

Sản phẩm thu được có kích thước tiểu phân từ 70 đến 80 nm, hình cầu và đa lớp Hiệu suất nang hóa đạt trên 91% Mẫu niosom tối ưu được bào chế thành hỗn dịch

dùng đường uống Thử giải phóng in vitro cho thấy hệ có khả năng giải phóng kéo

dài: sau 25 giờ, 70% fluconazol đã giải phóng [29]

De Assis D N và cộng sự đã bào chế và đánh giá các đặc tính của nano nang fluconazol với copolyme PLA – PEG bằng phương pháp nhũ hóa bay hơi dung môi theo quy trình:

- PLA – PEG, lecithin đậu nành, Myglyol 810N và fluconazol được hòa tan trong hỗn hợp dung môi methanol, aceton

- Nhũ hóa dung dịch trên vào nước có PEG

- Bốc hơi dung môi ở áp suất thấp

Sản phẩm thu được có kích thước tiểu phân từ 236 đến 356 nm, PDI từ 0,116 đến 0,418 Giá trị thế Zeta là từ -69,6 đến -55,4 mV Hiệu suất nang hóa đạt 32,3% Thử giải phóng trên da cho thấy hệ nano có giai đoạn ban đầu giải phóng nhanh rồi kéo dài và không hoàn toàn đến 4 giờ [10]

Chương II: NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

Bảng 2.1: Nguyên liệu sử dụng trong quá trình thực nghiệm

3 Methylen clorid Trung Quốc Nhà sản xuất

4 Alcol polyvinic Trung Quốc Nhà sản xuất

6 Cremophor RH 40 Trung Quốc Nhà sản xuất

9 Dinatri hydrophosphat Trung Quốc Tinh khiết hóa học

10 Kali dihydrophosphat Trung Quốc Tinh khiết hóa học

11 Kali clorid Trung Quốc Tinh khiết hóa học

12 Acid hydrochloric Trung Quốc Tinh khiết hóa học

14 Ethyl acetat Trung Quốc Tinh khiết hóa học

15 Acid citric Trung Quốc Tinh khiết hóa học

16 Natri hydroxyd Trung Quốc Tinh khiết hóa học

17 Kali hydroxyd Trung Quốc Tinh khiết hóa học

2.2 Phương tiện

- Máy khuấy cầm tay Korean Queen – Hàn Quốc

- Máy khuấy từ IKA – WERKE

- Máy đồng nhất hóa Unidrive

- Máy siêu âm Ultrasonic LC 60 H

- Máy đo quang phổ UV – VIS U1800 HITACHI

- Máy đo pH Eutech intrusment pH 510

- Máy ly tâm Sigma 3 – 18K Satorius

- Máy HPLC Spectra System Thermo

- KHV điện tử quét FEI Quanta 200

- Hệ thống đánh giá giải phóng thuốc qua màng Hanson Research

- Màng thẩm tích Spectra/Por 4

- Máy đo kích thước tiểu phân Zetasizer Nano ZS90 Malverin

- Cân phân tích, tủ sấy, tủ sấy chân không, tủ lạnh, máy lọc nén, nhiệt kế…

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Bào chế nano fluconazol

Bào chế nano fluconazol bằng phương pháp nhũ hóa bay hơi dung môi

- Tạo tiểu phân nano:

+ Phối hợp trực tiếp dung dịch 1 vào trong dung dịch 2

+ Làm lạnh môi trường bằng nước đá

+ Khuấy trộn liên tục bằng máy khuấy từ trong 24 giờ, điều kiện phòng thí nghiệm

- Tạo hỗn dịch nano trong nước:

+ Lấy tiểu phân nano bằng cách ly tâm với tốc độ 17000 vòng/phút trong 45 phút

ở 4ºC Rửa tủa 2 lần bằng nước bão hòa fluconazol

+ Phân tán tủa trong 25 ml nước cất

2.3.2 Xác định độ tan của fluconazol

- Trong dung dịch PVA bằng cách : Sau khi ly tâm ở 4ºC thu lấy tủa, dịch ly tâm được định lượng fluconazol bằng phương pháp HPLC theo mục 2.3.5 để xác định

lượng fluconazol bị hòa tan trong pha ngoại

- Trong diclomethan và nước bằng cách: Hòa tan fluconazol trong dung môi đến nồng độ thích hợp Quét phổ tử ngoại của dung dịch này trong khoảng bước sóng

200 – 600 nm để tìm cực đại hấp thụ của fluconazol Cực đại này được chọn để đo

độ hấp thụ của fluconazol trong dung môi tương ứng Cho 1 lượng dư fluconazol vào khoảng 50 ml dung môi, khuấy từ đến bão hòa ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, lọc lần lượt qua màng lọc có kích thước lỗ xốp 0,45 µm và 0,2 µm thu lấy dung dịch Tính toán độ tan bằng cách pha loãng và đo quang, so sánh với dung dịch chuẩn

Hình 2.1: Sơ đồ quy trình bào chế nano polyme fluconazol

Ly tâm lấy tủa Nhũ hóa

Bốc hơi dung môi Khuấy từ 24 giờ

Nhiệt độ phòng thí nghiệm

2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của tá dược và thiết bị đến sự hình thành hệ nano

Thay đổi các điều kiện bào chế nano fluconazol bao gồm:

- Thay đổi một số yếu tố kĩ thuật:

+ Nhiệt độ khi phối hợp dung dịch 1 và 2

+ Lực phân tán: Sử dụng máy siêu âm, máy đồng nhất hóa (tốc độ 4000 – 15000 vòng/phút), máy khuấy cầm tay (tốc độ khoảng 18000 vòng)

+ Thời gian tác động lực phân tán

+ Thể tích pha nội và pha ngoại

Các mẫu đều được tiến hành 2 lần Ngay sau khi bào chế, đánh giá hệ tiểu phân thu được dựa trên kích thước, phân bố kích thước, thế Zeta và hiệu suất quy trình để lựa chọn điều kiện bào chế

2.3.4 Đánh giá một số đặc tính của tiểu phân nano

2.3.4.1 Đánh giá cấu trúc tiểu phân bằng KHV điện tử truyền qua (TEM)

Nguyên tắc: Một chùm electron hội tụ có năng lượng cao được truyền đến mẫu

có bề dày siêu mỏng Tương tác giữa các điện tử và mẫu có hai kiểu là đàn hồi và không đàn hồi Trong tương tác đàn hồi, điện tử không bị mất năng lượng; trong tương tác không đàn hồi, điện tử mất một phần năng lượng và tạo ra nhiều tín hiệu như điện tử thứ cấp, điện tử Auger, tia X, tia khả kiến Các electron truyền được qua mẫu cũng xuất hiện cùng lúc này Do sự giảm năng lượng của electron phụ thuộc chủ yếu vào mật độ và độ dày của mẫu nên các điện tử truyền qua này tạo ra ảnh hai chiều của mẫu phân tích [24]

2.3.4.2 Đánh giá kích thước và phân bố kích thước

- Nguyên tắc: Kích thước hạt được xác định bằng phương pháp tán xạ lade Nguyên lý của phương pháp là khi chiếu chùm tia lade vào các hạt có kích thước khác nhau sẽ thu được mức độ tán xạ ánh sáng khác nhau do chuyển động Brown Phân tích sự dao động cường độ tán xạ của chùm tia sau khi va chạm vào hạt ta có thể đánh giá được chuyển động Brown và xác định được kích thước hạt nhờ phương trình Stokes – Einstein [18]

- Phương pháp: Tương tự như phương pháp xác định kích thước tiểu phân, sử dụng cuvet nhựa

+ Dung dịch thử: hút chính xác một lượng hỗn dịch tương ứng khoảng 30 mg fluconazol cho vào bình định mức 50 ml, thêm 10 ml ethanol, siêu âm cho dược chất tan hết, thêm nước cất đến định mức, trộn đều và lọc

+ Dung dịch chuẩn: hòa tan một lượng fluconazol chuẩn trong nước để thu được dung dịch có nồng độ 600 µg/ml

- Tính hàm lượng fluconazol có trong mẫu và hiệu suất quy trình dựa vào diện tích pic trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn, dung dịch thử

Công thức tính hàm lượng: X =  50

nano chuan

chuan

nano

V

C S

Trong đó:

H : Phần trăm khối lượng fluconazol có trong mẫu so với fluconazol ban đầu

X : Nồng độ fluconazol có trong mẫu

fluconazol

m : Khối lượng bột fluconazol dùng để bào chế mẫu

2.3.6 Đánh giá khả năng giải phóng dược chất từ hệ nano

- Khả năng giải phóng dược chất từ hệ nano được đánh giá qua hệ thống đánh giá giải phóng thuốc qua màng Hanson Research với các điều kiện cụ thể như sau: + Màng thẩm tích làm từ cellulose tái sinh, cho phân tử có khối lượng từ

12000 đến 14000 Da đi qua, diện tích bề mặt màng giải phóng là 0,785cm2

+ Môi trường khuếch tán: Dung dịch đệm PBS pH 7,4 gồm:

Natri clorid 8,00 g Kali clorid 0,20 g Dinatri hydrophosphat 1,44 g Kali dihydrophosphat 0,24 g Nước cất vđ 1000 ml + Thể tích môi trường khuếch tán: V = 7ml

+ Nhiệt độ môi trường khuếch tán: 37 ± 0,50C + Tốc độ khuấy: 400 vòng/phút

+ Lấy mẫu: Thử trong 7 giờ, sau mỗi giờ lấy v = 1ml dung dịch, bổ sung 1ml môi trường khuếch tán mới Xác định lượng fluconazol giải phóng bằng phương pháp HPLC theo mục 2.3.5

Hình 2.2: Hệ thống đánh giá giải phóng thuốc qua màng Hanson Research

- Đánh giá mức độ giải phóng fluconazol của hỗn dịch nano:

Mức độ giải phóng dược chất từ các mẫu hỗn dịch được đánh giá dựa trên phần trăm dược chất đã giải phóng ra từ thời điểm t

+ Nồng độ fluconazol trong môi trường khuếch tán tại thời điểm t được tính

theo công thức: Ct = ch

ch

t C S

S 