Chọn giống cây hoa cúc

Đại học Quốc gia Tp.HCM Trường Đại học Khoa học Tự nhiên  Môn: Chọn giống thực vật Đề tài: Chọn giống hoa cúc GVHD: ThS Lưu Thị Thanh Tú Chọn giống hoa cúc Trang I Tổng quan hoa cúc Hoa cúc (Chrysanthemum sp) loại hoa có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam số nước Châu Âu Hoa cúc xếp vào lớp hai mầm (Dicotyledones), phân lớp hoa cúc (Asterldae), cúc (Asterales), phân họ hoa ống (Asteloideae) chi (Chrysanthemum) Theo điều tra Chrysanthemum Việt Nam có lồi giới có 20 loài Các giống loài thuộc chi Chrysanthemum chủ yếu làm hoa cảnh Cúc loại hoa cắt cành có giá trị, ưu chuộng trồng số vùng có khí hậu mát lạnh nước ta Tại Đà Lạt, Lâm Đồng với điều kiện khí hậu thuận lợi, loại hoa sản xuất quanh năm với chất lượng cao, ổn định vượt trội so với hầu hết vùng khác Ngoài ra, cúc trồng số khu vực khác nước ta phái Bắc có Hà Nội, Hải Phòng Đơng Nam Bộ có thành Phố Hồ Chí Minh Cho đến nay, giống hoa cắt cành sản xuất nói chung giống hoa cúc nói riêng Đà Lạt hầu hết giống nhập nội Một số giống hết thời hạn bảo hộ quyền tác giả lỗi thời, số khác khó tham gia thị trường xuất không xác định quyền tác giả đóng lệ phí đầy đủ Ngồi ra, giống cũ thối hóa nhiễm bệnh hại nhiều trình nhân giống kéo dài nhiều năm nên sinh trưởng kém, chết nhiều khó phục hồi Vì vậy, diện tích gieo trồng tăng nhiều sản lượng không tăng đáng kể có xu hướng giảm sovới diện tích Cho nên, định hướng chọn tạo giống hoa cắt cành có chất lượng tốt, phù hợp với thị hiếu tiêu dùng nước thị trường xuất đã, yêu cầu cấp thiết Ngoài ra, chọn tạo giống hoa nước tạo lợi quyền tác giả sản xuất kinh doanh xuất Người sản xuất kinh doanh, đặc biệt xuất không phụ thuộc quyền tác giả nước ngồi, đóng lệ phí cao a) Đặc điểm: - Rễ chùm, phát triển theo chiều ngang, phân bố tầng đất mặt từ 5-20cm - Thân thảo, có nhiều đốt giòn - Lá đơn, khơng có kèm, mọc so le nhau, xẻ thùy hình lơng chim Mặt có lơng tơ, mặt nhẵn Gân hình mạng - Hoa có hai dạng: lưỡng tính đơn tính Đơi có dạng vơ tính Màu sắc loại khác Các hoa tập hợp thành cụm hoa hình đầu lớn, người ta thường gọi hoa tự đầu trạng cánh hoa thực chất bơng hoa, tràng hoa hình ống Bộ nhụy gồm hai nỗn ln ln đính thành bầu dưới, có ô noãn - Quả bế, nhẵn, không cánh, có hạt nẳm khoang đơi lại dính với b) Điều kiện sinh thái: - Nhiệt độ: đa số hoa cúc trồng ưa khí hậu mát mẻ (15-20oC) thời kì hoa cần đảm bảo nhiệt độ thích hợp hoa to đẹp - Ánh sáng: hoa cúc xếp vào loại ngắn ngày Thời gian chiếu sáng cho chất lượng hoa tốt 11 giờ/ ngày Chọn giống hoa cúc Trang - Độ ẩm: cúc trồng cạn, không chịu úng tiêu hao nhiều nước nên chịu hạn Độ ầm đất từ 60-70%, độ ẩm khơng khí từ 55-65% - Đất: cúc có rễ nơng nên đất phải cao ráo, thoát nước, tơi xốp c) Kỹ thuật trồng chăm sóc hoa cúc chậu Thời vụ trồng Trồng hoa cúc chậu vào vụ Đông xuân: Trồng tháng 10 hoa cúc chậu đạt suất chất lượng hoa tốt nhất, thu hoa chậu vào dịp tết nguyên đán, nâng cao giá trị kinh tế Chuẩn bị nhà che Để nâng cao chất lượng hiệu kinh tế, nên trồng hoa cúc chậu nhà có mái che; dùng nhà lưới đại, nhà lưới đơn giản nhà che tạm tuỳ theo điều kiện canh tác Giá thể trồng Yêu cầu giá thể: tơi xốp, khả giữ nước thoát nước tốt, nấm bệnh vi khuẩn Giá thể hỗn hợp gồm ½ đất phù sa + ¼ phân chuồng + ¼ xơ dừa cho suất chất lượng hoa cúc chậu lớn Phun Ridomil (nồng độ 3g/lít) để xử lý nấm bệnh giá thể trước trồng Kỹ thuật trồng chăm sóc 4.1 Tiêu chuẩn giống Sử dụng cúc từ giâm cành, tiêu chuẩn: Chiều cao 5- 7cm; Số lá: 5-7 lá; đường kính thân 0,2cm; dài rễ: 0,5-3cm; số rễ: >4cm 4.2 Kỹ thuật trồng Tùy thuộc vào kích thước, kiểu dáng khác mà lựa chọn số để trồng chậu cho phù hợp Chậu có kích thước 30x 15x 20cm ( chiều cao x đường kính đáy x đường kính miệng chậu) trồng cây/chậu Cách trồng: Cho giá thể xử lý nấm bệnh vào chậu cao cách miệng chậu 5cm Trồng cho phân bố xung quanh chậu để tán đều, không trồng sát vào thành chậu Nên trồng vào buổi chiều, sau trồng tưới đẫm nước Xếp chậu cách chậu 10 -15cm (tính từ mép chậu) 4.3 Điều tiết sinh trưởng cho hoa cúc Nếu trồng cúc chậu vào thời vụ tháng 11, cần chiếu sáng bổ sung liên tục 10 ngày sau trồng (4h ngày từ 22h đến 2h sáng hôm sau), 6m2 đặt bóng 75W, chiều cao bóng đèn từ 0,8- 1m so với 4.4 Kỹ thuật tưới nước Khi trồng xong để dễ bén rễ hồi xanh nên tưới lần/ngày Sau tưới nước để trì ẩm độ đất 65-70% để sinh trưởng phát triển 4.5 Kỹ thuật bón phân Chọn giống hoa cúc Trang Sau trồng tuần tiến hành bón thúc cho Thường sử dụng phân bón Đầu trâu (2020-15 + TE) với liều lượng 2kg phân/200lít nước cho 100m2 Định kỳ 10 ngày tưới lần Ngồi dung thêm chất kích thích sinh trưởng Atonik 1,8DD phun cho với liều lượng 10ml/bình lít nước, 10 ngày phun lần để bổ sung dinh dưỡng cho cây, giúp sinh trưởng phát triển tốt Thu hoạch, bảo quản sử dụng hoa chậu Khi nụ hoa bắt đầu chuyển màu nở đem sử dụng Nếu vận chuyển xa dùng dây buộc tán hoa vào để tránh ảnh hưởng đến chất lượng hoa Xếp chậu khít để giảm va đập vận chuyển Trong trình sử dụng, tùy thuộc vào thời tiết thông thường ngày tưới nước lần, lần tưới 500ml/chậu Chỉ tưới nước vào gốc cây, tránh tưới nước lên hoa để tăng tuổi thọ hoa Phòng trừ sâu bệnh 6.1 Sâu hại 6.1.1 Rệp : - Triệu chứng: Thường làm cho còi cọc, quăn queo, nụ bị thui, hoa không nở dị dạng, gây hại nặng vụ Xuân hè Đơng xn - Phòng trừ: Có thể dùng Karate 2,5 EC liều lượng10 - 15 ml/bình 10lít, Ofatox 400WP Supracide 40ND liều lượng10 – 15 ml/bình 10 lít… 6.1.2 Sâu vẽ bùa : - Triệu chứng: Sâu non nằm biểu bì lá, lấy thức ăn tạo thành đường ngoằn ngoèo màu trắng, phá hoại tế bào diệp lục - Phòng trừ: Dùng bẫy màu vàng dẫn dụ trưởng thành Sử dụng thuốc có chất bám dính mạnh Padan, Supathion 40 EC liều lượng 15- 20ml/ bình 10 lít … Bệnh hại 2.1 Bệnh đốm : - Triệu chứng: Vết bệnh thường có dạng hình tròn bất định màu nâu nhạt nâu đen, nằm rải rác mép gân Bệnh phát triển mạnh độ ẩm cao - Phòng trừ: Score 250ND liều lượng 10ml/bình 10 lít, 10 ngày phun lần 6.2.2 Bệnh gỉ sắt : - Triệu chứng: Vết bệnh dạng ổ nổi, màu gỉ sắt da cam, thường xuất mặt lá, bệnh nặng làm cháy lá, vàng, rụng sớm - Phòng trừ: Sử dụng Zineb 80 WP liều lượng 20 - 50g/10 lít, Anvil SC liều lượng 510ml/bình 10 lít, thuốc có chứa gốc lưu huỳnh d) Nguồn ngun liệu • Nhóm giống cũ: - Cúc đại đóa vàng: Cây cao 60-80 cm, thân yếu, mềm, to không đứng thẳng Hoa kép to 8-10cm, cánh dài cong vào trong, cánh khơng sít vào Khả chịu rét chịu hạn tốt thời gian sinh trưởng dài 150-180 ngày, trồng - Cúc vàng hè Đà Lạt: cao 40-50cm, than nhỏ mảng cong Hoa to trung bình 4-5 cm, cánh ngắn, mền, màu vàng tươi Nhiều to màu xanh vàng, tuổi thọ ngắn nên trồng - Cúc chi Đà Lạt: cao 40-50cm, bụi, than nhỏ cong, phiến to mỏng, màu xanh đậm Hoa nhỏ 2-2,5 cm cánh vàng viền trắng Cây chịu lạnh, sống 120-150 ngày Chọn giống hoa cúc Trang - Cúc chi trắng Đà Lạt: nhỏ dạng thân bò, phân cành nhiều, nhỏ màu xanh đậm Hoa nhỏ đường kính 1-1,5 cm màu trắng, mùi thơm nhẹ Trồng để ướt chè phơi khô, làm thuốc nam - Cúc chi vàng Đà Lạt: giống cúc chi trắng, hoa vàng mùi thơm hắc - Cúc gấm: bụi cao 45-50 cm, phân cành mạnh dùng tạo tán hình cầu Hoa màu vàng nhạt, đường kính 1,5-,2,5 cm sống 120-150 ngày, chịu rét - Cúc tím hoa cà: cao 50-60cm, than cứng Hoa to 8-10cm, cành xếp chồng lên cong vào phần giữa, hoa màu hoa cà, chịu rét tốt Sống 110-130 ngày • Nhóm giống nhập nội - Cúc Đài Loan: từ tập đoàn nhập nội Đài Loan năm 1994 Cây cao 70-80cm, xanh đậm, phiến dày, thân mập thẳng, cứng Hoa kép to nhiều tầng xếp chặc, đường kính hoa 10-12cm, màu vàng nghệ Sinh trưởng 120-150 ngày, thích hợp vụ thu đông - Cúc CN 93: từ Nhật Bản Cây cao 60-70cm, cứng mập thẳng, xanh to Hoa kép, màu vàng, đường kính 10-12cm, cánh dày xếp xít chặc nhau, hoa bền, thời gian cắm lọ từ 1015 ngày Thời gian sinh trưởng ngắn 90-110 ngày, chịu nhiệt tốt - Cúc CN 97: từ Nhật Bản Cây cao 55-65cm, to mập, xanh dày Hoa kép màu trắng sữa, cánh dày đểu, xềp chặt với nhau, đường kính 10-12cm Sinh trưởng 90-110 ngày, chịu rét - Cúc CN98: từ Nhật Bản Cây cao từ 60-70cm, xanh đậm Hoa to, đường kính 810cm, màu vàng chanh Thời gian sinh trưởng 80-90 ngày, chịu nóng, giống chủ lực mùa hè - Cúc CN 42: nhập từ Hà Lan năm 2001 Cây cứng, xanh bong, cao 70-80cm Hoa màu trắng Thời gian sinh trưởng 90-95 ngày, phủ hợp vụ thu đông - Cúc CN 44: nhập chung giống CN 42 Cây cao 85-90cm, hình lơng chim hẹp Hoa màu vàng đậm, đường kính 9-11cm Sống 90-95 ngày, thích hợp trồng vụ đơng - Cúc CN 45: nhập chung giống CN42, cao 70-80cm Cánh hoa bên màu trằng, cánh hên vàng, đường kính 7-10cm Thời gian siinh trưởng 90-100 ngày, thích hợp với vụ đơng II Phương pháp chọn giống truyền thống Chọn giống phương pháp lai: Hoa cúc với giá trị cảnh cao bốn loại hoa phổ biến giới Do đó, lồi hoa chiếm vị trí quan trọng ngành công nghiệp hoa giới Người ta ước tính có 20.000 hoa cúc giới Hơn 90% số chúng sản xuất kỹ thuật chọn giống phương pháp lai truyền thống, nhiều giống hoa cúc phát triển kỹ thuật năm Quá trình chọn giống hoa cúc chậm Sản xuất giống thành công u cầu vơ số pháp lai số lượng lớn hệ cháu để có tổ hợp đặc tính mong muốn từ số cá thể Các dị hợp tử di truyền phức tạp rõ ràng làm cho việc canh tác hoa cúc thành nguồn không giới hạn kiểu hình hoa giống trồng Chọn giống hoa cúc Trang 1.1 Phương pháp: a Lai đơn (AxB): Loài A thụ phấn với phấn hoa lồi B Ví dụ như: Phép lai: "Warhawk x Huntsmen" Bảng mô tả đời Phép lai: "41 Red x Sybil " Bảng mô tả đời Chọn giống hoa cúc Trang Chọn giống hoa cúc Trang Phép lai: "Oregon x Dark Red Star" Bảng mô tả đời b Lai kép lai bốn hướng (AxB)x(CxD) Loài A lai với loài B tạo loài AB loài C lai với loài D tạo loài CD Lai AB với CD tạo loài ABCD có tổ hợp đặc tính từ lồi bố mẹ Ví dụ như: Phép lai: “128x505” (1963) Cây No.128 đến từ phép lai Royal Robe Yellow Delaware, No 505 đến từ phép lai Majestie Delaware Bảng mô tả đời Chọn giống hoa cúc Trang c Lai hướng (AxB)xC Loài A lai với loài B để tạo loài AB mà lai trở lại với loài C để tạo loài ABC tổ hợp đặc tính từ lồi A, B, C Ví dụ: Phép lai “344 x Starburst, “Cây No.344 đến từ Limelight Crown Jewel Cây No 344 lai với Starburst Bảng mô tả đời Chọn giống hoa cúc Trang d Lai hồi giao (AxB)xA (AxB)xB Lai hồi giao sử dụng để tăng cường nguồn germplasm từ giống bố mẹ đặc biệt Phương pháp có hiệu chọn giống chín sớm Phép lai: 345 x Yellow Delaware ví dụ phép lai hồi giao Sự lựa chọn giống 345 đến từ phép lai Gold Lode Yellow Delaware Chọn giống hoa cúc Trang 10 độ bóng/3m , 30 ngày đầu sau trồng Các giống đối chứng giống nhập nội trồng phổ biến ưa chuộng thời điểm khảo nghiệm * Chỉ tiêu theo dõi + Chiều cao hoa (cm) + Đường kính cành hoa (mm) + Đường kính hoa (cm) + Màu sắc hoa (mô tả) + Số hoa cành (hoa) + Mức độ nhiễm bệnh rỉ sắt (1-9): 1= không nhiễm nhiễm không đáng kể; 9= nhiễm nặng, không chấp nhận được; + Mức độ nhiễm ruồi (1-9): 1= không nhiễm nhiễm không đáng kể; 9= nhiễm nặng, không chấp nhận được; + Thời gian sinh trưởng (ngày); + Tuổi thọ cành hoa (ngày); + Một số đặc điểm hình thái (kiểu hình cành hoa, kiểu hoa): theo hệ thống phân loại Hoa Kỳ (National Chrysanthemum Society Inc., USA, 2001) + Mức độ chấp nhận thị trường (1-9): 1= xấu, không phù hợp, không chấp nhận; 9= đẹp, phù hợp, chấp nhận tốt Chọn giống phương pháp gây đột biến Chọn giống phương pháp đột biến quan trọng việc cải tiến trồng Trong 75 năm qua, có 3.100 giống đột biến sản xuất toàn giới Chọn giống hoa cúc Trang 15 Đột biến gây cho phép có thời gian tương đối ngắn với giống hoa cúc khác đặc điểm đặc trưng màu sắc hình dạng kích thước cụm hoa , mà định giá trị làm cảnh chúng Các phương pháp tạo giống truyền thống lai , chọn lọc …hạn chế mẫu kiểu hình lồi 2.1 Giống hoa cúc kết đột biến in vitro Trong chọn giống đột biến xử lý chiếu xạ liên quan đến chồi cành in vivo trường hợp nhân giống in vitro đoạn sinh dưỡng nhỏ, chẳng hạn như, ví dụ như: lá, cuống lá, phần thân cây, cụm hoa cuống, hoa dạng lưỡi bẹ, mô sẹo mô, hệ thống treo tế bào Ngoài ra, mẫu cấy invitro vật liệu đặc biệt thuận tiện cho việc chiếu xạ Nhờ áp dụng giống in vitro ống nghiệm diện tích nhỏ, mơi trường bệnh sâu bệnh, nhiều mẫu cấy chiếu xạ đặt, mà đảm bảo tái sinh hiệu điều kiện in vivo làm tăng khả có đột biến cho phép tăng tốc tất giai đoạn chương trình chọn giống Mục đích nghiên cứu để chứng minh đột biến soma gây ống nghiệm với xạ gamma nhanh chóng hiệu để gia tăng phạm vi thay đổi giống hoa cúc khác a Vật liệu Thí nghiệm thực từ tháng 12 năm 2005 đến tháng 11 năm 2007 Phòng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học nhà kính Sở cảnh trồng thực vật, Đại học Công nghệ Khoa học Cuộc sống Bydgoszcz Nghiên cứu liên quan đến ba giống Chrysantheum × Grandiflorum (Ramat.) Ki-tam ( Dendranthema grandiflora) - 'Albugo' (màu trắng), 'Alchimist (tím than) và' Satinbleu '(màu hồng đậm) Bức xạ gamma với liều 15 Gy đến từ nguồn 60 Co tạo thiết bị Theratron 780 C Suất liều xạ 2,14 Gy × min-1 Mơi trường ni cấy có chứa 30 g × dm -3 saccharose, làm đơng lại với g × dm-3 agar, độ pH xác định trước khử trùng 5.8 b Phương pháp Trong 'Albugo' 'Satinbleu' xạ liên quan đến microcuttings phát triển môi trường sửa đổi Murashige Skoog [1962] (môi trường MS) mà khơng có điều hòa sinh trưởng Sau chiếu xạ, môi trường MS sửa đổi bổ sung 0,6 mg × dm -3 BAP 2,0 mg × dm-3 IAA, 100 mẫu cấy mắt đơn 100 mẫu đặt mẫu vào bình Mẫu đối chứng bao gồm số cấy không chiếu xạ Trong 'Alchimist "có chiếu xạ 250 mẫu cấy với mô sẹo tái sinh cuống Một tháng trước mẫu cấy đặt vào bình mơi trường MS sửa đổi với 0,6 mg × dm-3 BAP 2,0 mg × dm-3 IAA thêm vào Khi chiếu xạ, tái sinh chồi từ mẫu cấy tiến hành mà không cần tiếp tục cấy truyền Kiểm soát liên quan đến 250 mẫu cấy khơng chiếu xạ Ngồi giống 25 mẫu chồi kiểm sốtđược đặt mơi trường MS sửa đổi Tái sinh chồi tháng, sau chúng chuyển vào MS sửa đổi vừa bổ sung 2,0 mg × dm -3 IAA tuần Mẫu cấy in vitro giữ phòng tăng trưởng nhiệt độ 24 ± º C, tiếp xúc với 16 chiếu sáng mật độ dòng photon 30-35 mmol × m-2 × s-1 Chọn giống hoa cúc Trang 16 15 tuần quan sát thực động thái tái sinh chồi ngẫu nhiên mẫu cấy lóng mẫu cấy mắt đơn Trái với 'Satinbleu', 'Albugo' phân biệt chồi nách từ chồi ngẫu nhiên tìm thấy mẫu cấy, thực tế, khơng thể phát triển chuyên sâu tái sinh chúng Vì lý tổng số chúng xem xét Cũng có xác định số lượng trung bình chồi cấy tiêm Kết xác nhận mặt thống kê với phương pháp phân tích phương sai cho thí nghiệm đơn yếu tố thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên, ý nghĩa khác biệt xác nhận với thử nghiệm Tukey HSD mức ý nghĩa α = 0,05 Vào tháng Tư năm 2006, microcuttings bắt rễ trồng vào cuvette nhựa bề mặt than bùn, trước trộn với đá trân châu tỷ lệ khối lượng 2:1 (v: v) khử trùng với thuốc diệt nấm Benlate 50WP với nồng độ 0,2% Việc thích ứng mơi trường 14 ngày Sau đó, đưa trồng vào nơi cố định bàn làm đầy với chất than bùn chuẩn bị Khoảng cách hàng × 10 cm Hoa cúc trồng tiếp xúc với chu kỳ sáng tự nhiên, áp dụng phương pháp tiêu chuẩn Phát triển hoa hoa cúc hệ đột biến sinh dưỡng (vM1) trùng hợp với quan sát để xác định biến thể (các đặc điểm hình thái thay đổi cây) chênh lệch tương ứng với đặc điểm thay đổi Tần số biến thể phương sai xác định với số lượng có hoa Các biến thể lựa chọn cách xác định màu sắc chùm hoa kiểm soát chiếu xạ giai đoạn hoa đầy đủ loại cụm hoa theo Jerzy [2000] Màu sắc phía bên hoa ligulate xác định theo việc đồng ý dựa danh mục RHSCC [1966] Hoa cúc trồng nhà kính hồn tất vào ngày 26 tháng 11 năm 2006 Vào tháng Sáu năm 2007, chồi cắt lấy mẫu từ nguồn bắt rễ sau đưa hoa theo quy trình tương tự hệ thực vật đột biến Màu sắc loại chùm hoa lần xác định để chứng minh ổn định đặc điểm thay đổi hệ vM1 Tương tự vậy, thành phần định tính định lượng sắc tố hoa ligulate giống ban đầu lựa chọn việc quan tâm nhất, giá trị giới thiệu với giống đột biến: ‘Albugo Sunny’, ‘Alchimist Golden Beet’, ‘Alchimist Tubular’, ‘Satinbleu Honey’, ‘Satinbleu Minty’ xác định Các tài liệu nghiên cứu thực từ đoạn hoa tươi ligulate (khoảng cm từ đầu), lấy mẫu giai đoạn hoa đầy đủ Phân tích quang phổ chất chiết xuất thực hai chùm tia quang phổ UV-VIS 1601-PC SHIMADZU bước sóng 330-500 nm cho carotenoids 450600 nm cho anthocyans Dựa đường cong hấp thu thực hiện, có xác định giá trị độ hấp thụ bước sóng (λ max) đặc trưng cho sắc tố, tạo điều kiện cho việc tính tốn nội dung carotenoids anthocyans cho cyanidin-3-glucoside g trọng lượng tươi hoa ligulate b Kết luận Bức xạ Gamma với liều 15 Gy áp dụng thành cơng ống nghiệm yếu tố gây đột biến chọn giống hoa cúc Đột biến gây phương pháp nhân giống hoa cúc có hiệu quả, khẳng định khứ nhiều tác giả khác Giống hoa cúc thu cách sử dụng mẫu cấy mắt đơn chiếu xạ microcuttings cách chiếu mẫu cấy với mô sẹo tái tạo trước cuống Chọn giống hoa cúc Trang 17 Chọn giống hoa cúc Trang 18 2.2 Đột biến chùm tia ion Chùm tia ion dự kiến cho tần số đột biến cao có ảnh hưởng đến sinh học cao.Hơn nữa, sử dụng tia ion có số hạt xun qua tế bào, tia gamma nhiều Do đó, đưa giả thuyết rằng, tia ion gây hư tổn cho nhiễm sắc thể Và đó, chọn giống hoa cúc tia ion thường sử dụng 2.2.1 Ảnh hưởng chiếu xạ tia ion lên cảm ứng đột biến nội dung DNA nhân hoa cúc a Vật liệu Giống hoa cúc (Chrysanthemum morifolium) giống "Taihei" sử dụng cho nghiên cứu b Xử lý chiếu xạ nuôi cấy mô Phân đoạn (10 × mm) cắt từ ống nghiệm thực vật đặt môi trường MS (Murashige Skoog 1962) có bổ sung mg /l 6- benzylaminopurine (BA), 0,2 mg /l axit 1-naphthaleneacetic (NAA), 2% sucrose, 0,9% agar đĩa petri cm đĩa bịt kín với film polyimide Sau 3-4 ngày, phân đoạn chiếu xạ với 220 MeV ion carbon (có nghĩa LET 107 keV / mm) với nồng độ 1, 2, 3, Gy; 320 MeV ion carbon (có nghĩa LET 76 keV / mm) với nồng độ 1, 2, 3, Gy; 100 MeV ion heli (có nghĩa LET keV / mm) nồng độ từ 2, 5, 10, 15 Gy tạo AVF-cyclotron (Cơ quan Năng lượng nguyên tử Nhật Bản, Takasaki, Nhật Bản) Tia gamma áp dụng liều 10, 20, 30, 40 Gy mức liều 10 Gy phòng gamma Viện Chăn ni xạ (Viện Khoa học thuộc nông học, Hitachi-omiya, Nhật Bản) Sau xử lý chiếu xạ, phân đoạn chuyển lên mơi trường MS có bổ sung mg /l BA, 0,2 mg / l NAA, 2% sucrose, agar 0,9% cốc hình nón 100 ml để tạo vết sẹo (callus) Sau 17 18 ngày, phân đoạn chuyển lên môi trường MS có bổ sung mg /l BA, 0,1 mg /l NAA, 2% sucrose, agar 0,9% cốc hình nón 100 ml cho phép chồi tái sinh c Tốc độ hồi phục Tỷ lệ tái sinh nghiên cuus tuần sau chuyển vào môi trường tái sinh Phương pháp điều trị chiếu xạ lặp lặp lại bốn lần với chùm ion carbon 220 320 MeV chùm ion heli 100 MeV năm lần tia gamma, sử dụng 60-100 phân đoạn xử lý chiếu xạ Tỷ lệ tái sinh xác định tỷ lệ số lượng mẫu cấy mà từ nhiều chồi tái sinh với số mẫu cấy chiếu xạ c Sự đột biến màu hoa Chỉ có chồi lấy từ đoạn để loại bỏ trùng lặp chồi đột biến có nguồn gốc từ tế bào đột biến Những chồi tái sinh nuôi môi trường MS có bổ sung 1% sucrose agar 0,9% Rễ chồi thích nghi với mơi trường sau cấy ghép cánh đồng tháng Sáu Trong tháng mười một, đột biến màu hoa nghiên cứu sử dụng 128-399 xử lý chiếu xạ, điều thể Bảng 2-1 Tần số đột biến xác định tỷ lệ số lượng hoa đột biến màu sắc số điều tra Chọn giống hoa cúc Trang 19 2.2.2 Đột biến cảm ứng với chùm ion chiếu xạ nụ bên hoa cúc phân tích cấu trúc khảm đột biến gây a Vật liệu Giống hoa cúc (Chrysanthemum morifolium) giống "Taihei" sử dụng cho nghiên cứu b Sự chiếu xạ thiết lập đột biến màu sắc hoa cúc Lá gỡ bỏ từ chồi nuôi cấy ống nghiệm, mắt cắt Các mắt đặt mơi trường thạch đĩa Petri có đường kính cm, với nụ bên đối diện với nguồn phóng xạ, chiếu xạ với 1, 2, 4, 8, 16 Gy 220 MeV ion carbon (có nghĩa LET 107 keV / mm), 5, 10, 15, 20 Gy 100 MeV ion heli (có nghĩa LET keV / mm) tạo AVF-cyclotron (Cơ quan Năng lượng nguyên tử Nhật Bản, Takasaki, Nhật Bản), 10, 20, 40, 80, 200 Gy tia gamma mức liều 10 Gy gamma phòng (Viện Chăn ni xạ, Viện Khoa học thuộc nông học, Hitachi-omiya, Nhật Bản) Mỗi nụ chiếu xạ chuyển đến môi trường MS (Murashige Skoog 1962) có bổ sung 1% sucrose agar 0,9% ống ni cấy Tỷ lệ sống sót kiểm tra sử dụng 40 nụ lần xử lý 60 ngày sau chiếu xạ Trong phương pháp điều trị chiếu xạ với 220 ion carbon MeV Gy, 100 ion helium MeV lúc 10 Gy, tia gamma 80 Gy, hoa đột biến màu sắc thiết lập cách sử dụng quy trình sau (Hình 4-1) Chọn giống hoa cúc Trang 20 Năm mắt thấp chồi kéo dài từ nụ chiếu xạ cắt (lần cắt đầu tiên), mắt đặt môi trường nêu Chồi phát triển từ chồi bên năm mắt Năm mắt thấp chồi kéo dài cắt (lần cắt thứ hai), chồi phép tăng trưởng từ mỗi mắt cắt Những chồi tập làm quen dần với môi trường sau cấy ghép mơi trường căng thẳng bắt nguồn từ chồi chiếu xạ Bằng thủ tục này, tối đa 25 lấy từ chồi chiếu xạ màu sắc hoa chúng nghiên cứu Các chủng coi đột biến, hoa màu đột biến xuất đời Các tần số đột biến xác định tỷ lệ số lượng chủng đột biến số lượng điều tra Tỷ lệ phân biệt xác định tỷ lệ số lượng hoa đột biến màu sắc số khảo sát dòng mà bao gồm mười Những sectorial (thuộc hình quạt) periclinal chimera tính đột biến Số lượng chủng nghiên cứu lần thí nghiệm thể Bảng 4-2 Chọn giống hoa cúc Trang 21 Chọn giống hoa cúc Trang 22 III Phương pháp đại Loài Nguồn mẫu Dendranthema Lá indicum (L) Des Moul, giống Hàn quốc Nghiên cứu Dòng Agrobacterium LBA4404 có gen chọn lọc neomycin phosphotransferase để nghiên cứu khả chuyển gen tái sinh hoa cúc 14 loài hoa cúc khác Dùng Agrobacterium làm trung gian chuyển gen vào mô sẹo hoa cúc nghiên cứu hiệu chuyển gen , kích thước khối u sau chuyển gen Dendranthema Dùng giống cúc chọn ủ với grandiflora chủng A tumefaciens mang plasmid pBIN 19 chứa gen chọn lọc Nosnptll 35Sgus để chuyển gen nghiên cứu tính ổn định gen gus Dendranthema Lá Dùng đạn chứa vector nguồn grandiflora Tzvelev thân pBIN 19 nucleocapsid (Chrysanthenum virusTSWV để bắn gen vào giống moriflorium Ramat) chọn, dùng gen neomycinphosphotransferase làm gen chọn lọc 71% tái sinh chuyển gen Dendranthema X Cánh hoa Dùng chủng A tumefaciens grandiflora LBA4404 chứa gen chọn lọc nptII để chuyển gen vào cánh hoa cúc peach Margaret Dùng chủng A tumefaciens chứa promoter pMAS102, pMAS201 Dùng gen thị gus để nghiên cứu hiệu promoter lên biểu cúc chuyển gen Tác giả Susan E Ledger cộng sự, 1991 Monique F Van Wordragen cộng sự, 1991 Jan de Jong cộng sự, 1994 Luzz Marcela Yepes cộng , 1995 M R Boase, J M Bradley N K Borst,1998 Murakami Hideko cộng sự, 2004 Giới thiệu Một nghiên cứu chuyển gen vào hoa cúc thông qua Agrobacterium Tumefaciens S Kudo, N Shibata, Y Kanno and M Suzuki Nghiên cứu cố gắng chuyển gen vào hoa cúc ( Dendranthema Grandiflorum- Ramat- Kitamura ) nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến ổn định chuyển gen vào hoa cúc , bao gồm giống hoa cúc , chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens , promoter , điều kiện thời kỳ canh tác.Cây trồng ngày cánh đồng 24 ° C ủ A tumefaciens chủng EHA101 plasmid pIG121Hm Và gen neomycin phosphotransferase ( nptII ) hòa nhập tất phép biến nạp lựa chọn kháng kanamycin Mặc dù tính nhạy cảm hoa cúc với Agrobacterium tumefaciens chứng minh,sự ổn định việc sản xuất hoa cúc biến đổi gen chưa xác định dứt khoát Thơng qua biểu ß -glucuronidase ( GUS ) khu vực giới hạn báo cáo ( Ledger et al ,1991; De Jong cộng , 1993) Tuy nhiên , có vài ví dụ biểu gen gus ổn định sau trồng lâu dài Điều quan trọng phải phân biệt biểu tạm thời hội nhâp ổn định , với biểu hai gen beta -glucuronidase ( uidA ) neomycin phosphotransferase ( nptII ), tích tụ sản phẩm gen xảy Chọn giống hoa cúc Trang 23 ảnh hưởng đến biểu kiểu hình Fukai et al (1995) quan sát thấy giảm nhanh chóng hoạt động gus sau tiêm chủng hoa cúc với A tumefaciens Vật liệu phương pháp • Vật liệu trồng Chồi hoa cúc (Dendranthema grandiflorum (Ramat.) Kitamura) in vitro thuộc giống: 'Seiun’, ' Shuhounotikara ', ' Tenju ', ' Houkou ', gieo chồi lại khoảng tháng, điều kiện chiếu sáng liên tục Những non trưởng thành dùng làm vật liệu chuyển gen • Chủng vi khuẩn vector Bốn chủng vi khuẩn A tumefacients sử dụng EHA101, LBA4404, AGL0 C58C1 Plasmid vector: pIG121Hm, pMUBI, pNOS, pTOK233, and pKUBI Promoter 35S sử dụng để điều khiển biểu gen uidA pIG121Hm and pTOK233 • Sự chuyển gen lên khả phục hồi Cấy (khoảng 0,5 cm2 ) cắt từ chồi in vitro tiêm cá chủng A Tumefaciens chứa Ti plasmid thích hợp 30’ Làm tương tự với A.tumefaciens thực môi trường MS (1 ' MS , mg / l BAP , mg / l NAA , g / l axit casamino , 0,3% Gelrite , pH 5,8 ) bốn ngày 24 ° C bóng tối điều kiện tiêu chuẩn Sau rửa ba lần nước vơ trùng có chứa 200 mg / l Timentin , đĩa nuôi môi trường MS rắn cộng với Timentin bảy ngày để loại bỏ A tumefaciens chuyển qua mơi trường chọn lọc trung bình (1 ' MS , 50 mg / l Km , 200 mg / l Timentin ) ba tháng Timentin sử dụng giết A tumefaciens phát triển bề mặt ( Nauerby cộng sự, 1997; Ling cộng sự, 1998) Mô sẹo màu xanh nhỏ xuất tháng sau tiêm Sau đó, đĩa chuyển vào môi trường cảm ứng chồi (1 'MS, mg / l BAP, mg / l NAA, 200 mg / l Timentin) tháng, sau chuyển vào môi trường rễ (1´ MS) Cây tái sinh thích nghi với mơi trường, đưa vào chậu có đất cát trồng nhà kính • Hoạt động Gus Hoạt động gus tế bào chuyển gen xác định cách nhuộm với X-gluc (Kosugi et al., 1990) Diện tích màu xanh đo quang trắc tính tốn tỷ lệ phần trăm tổng diện tích • Hòa nhập gen biến nạp Bộ DNA phân lập từ chuyển gen (khoảng cm chiều cao) sau kết hợp phương pháp Wagner et al (1987) Bousquet et al (1990) Sàng lọc sơ cấp biến nạp giả định thực cách phân tích PCR để xác nhận diện gen Sau đó, phân tích Southern blot thực để xác nhận hòa nhập gen chuyển biến nạp tích cực • Sự phiên mã gen biến nạp Mức độ phiên mã gen biến nạp đo RNA gel blot để xác định mức độ biểu gen biến nạp Kết Sàng lọc chủng A tumefaciens , Ti plasmid , giống hoa cúc thấy hiệu trình chuyển gen Một số nhóm cho thấy ảnh hưởng giống chủ , chủng A tumefaciens ,và vector sử dụng để chuyển gen Mục tiêu xác định kết hợp tốt chủng A tumefaciens hoa cúc trồng để chuyển gen Bốn chủng A Tumefaciens sử dụng: EHA101 , LBA4404 , AGL0 , C58C1 Lá tiêm chủng chứa vector pIG121Hm Sau trồng, hoạt động GUS đo khảo nghiệm tạm Chọn giống hoa cúc Trang 24 thời(Hình 1a) Các chủng thử nghiệm, EHA101 dẫn đến hoạt động GUS cao nhất, đó, sử dụng chủ yếu chuyển gen Tiếp theo, thử nghiệm hiệu bốn vectơ với promoter khác kiểm soát biểu gen uidA (Hình 1b) Hoạt động GUS cao đĩa tiêm với pIG121Hm , có promoter 35S ; Tuy nhiên , hoạt động GUS giảm nhanh 2,84% củasau 14 ngày trồng (hình 2) Hoạt động GUS giảm xuống 14,5% khoảng thời gian tương tự sử dụng promoter nos ( pNOS ) Khi sử dụng ubiquitin promoter ( pMUBI ), hoạt động GUS giảm xuống 0,37% sau ngày trồng Ngược lại, vectơ pKUBI , có promoter ubiquitin hoa cúc , cho thấy khơng có hoạt động GUS ban đầu ; Tuy nhiên , sau 14 ngày trồng, cho thấy hoạt động GUS nhẹ Sự kết hợp A tumefaciens vectơ ảnh hưởng đến hoạt động GUS Khi chủng A Tumefaciens LBA4404 sử dụng , pNOS cho thấy mức độ hoạt động GUS cao vector khác thử nghiệm Khi chủng EHA101 sử dụng , cho thấy pIG121Hm hoạt động GUS cao pMUBI Tiếp theo , bốn giống hoa cúc thử nghiệm là: ' Seiun , ' Shuhounotikara ', ' Tenju ', ' Houkou ' (Hình 2c) Khi A tumefaciens chủng EHA101 ,chứa pIG121Hm , tiêm cho giống khác nhau, ' Shuhounotikara ' cho thấy hoạt động GUS cao , ' Houkou’ • Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian trồng Yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu chuyển đổi bao gồm thời gian trồng nhiệt độ (Trick Finer , 1998; Dillen cộng sự, 1997 ) Sử dụng dòng EHA101 vector pIG121Hm nghiên cứu giai đoạn trồng nhiệt độ khác Dillen et al (1997) báo cáo nhiệt độ tối ưu 22 ° C , không phân biệt loại hình trợ giúp plasmid Trong trường hợp , bốn ngày 24 ° C tối ưu cho hoạt động GUS hoa cúc Mặc dù thời gian trồng hai ngày thường sử dụng số chuyển gen ( Thủ thuật Finer , 1998) , trồng 1-2 ngày không đủ cho hoa cúc chuyển gen Thời gian trồng dài bốn ngày dẫn đến giảm hoạt động GUS, có lẽ phát triển mức A tumefaciens , làm thiệt hại Nhiệt độ kiểm tra Sau bốn ngày trồng, tăng trưởng mức 22 ° C 20 ° C dẫn đến mức độ hoạt động GUS so sánh với 24 ° C Tuy nhiên , hoạt động GUS sau ngày trồng thấp đáng kể hai 20 ° C 22 ° C so với 24 ° C Vì vậy, chúng tơi tiến hành trồng 24 ° C điều kiện tiêu chuẩn • Xác nhận lại chuyển gen từ mô kháng kanamycin Trong diện 10 mg / l kanamycin, hình thành mơ sẹo mầm hình thành từ phần khơng chuyển gen không xảy Chúng sử dụng 50 mg / l kanamycin để chọn biến nạp Mô sẹo kanamycin chịu lựa chọn sử dụng để tái tạo Để loại bỏ dương tính giả, hai xét nghiệm dựa kháng kanamycin thực Trong thử nghiệm rễ, rễ không phát triển nồng độ cao kanamycin (100 mg / l), biến nạp hãng hình thành rễ phát triển Trong thử nghiệm kiểm tra lá, chuyển giả định đặt môi trường chọn lọc có chứa 50 mg / l kanamycin ni cấy vài ngày Dương tính giả bắt đầu màu cuối chết vòng 30 ngày Ngược lại, biến nạp 142 giữ màu xanh hình thành chồi • Sự hòa nhập gen Để xác nhận hòa nhập ổn định gen chuyển gen giả định lựa chọn kanamycin , phân tích PCR thực để phát diện gen chuyển sàng lọc số mẫu (Hình 3) Trong bốn dòng độc lập tái sinh , ba dòng dẫn Chọn giống hoa cúc Trang 25 đến khuếch đại band 412 - , 657 - , 453 -bp , bắt nguồn từ nptII , uidA , gen hpt Kể từ PCR khuếch đại gen khơng hòa nhập hòa nhập gen không loại trừ khả nhiễm A Tumefaciens Phân tích Southern blot sau thực dòng PCR dương tính Ba mẫu dò sử dụng , bao gồm nptII , uidA , gen hpt ( Hình 4) Trong ba biến nạp , nptII , uidA , hpt thăm dò tất band, phát dòng thiếu uidA hpt Một chuyển gen giả định bị gen uidA , dẫn đến mát hoạt động GUS Do vị trí gần biên giới bên phải T -DNA , bên cạnh gen nptII , gen uidA có xu hướng bị xóa q trình hòa nhập Ngồi ra, khác hòa nhập gen uidA hoạt động GUS thời gian trồng kéo dài đĩa tiêm A.tumefaciens chủng chứa chấp gen uidA Những tượng chứng minh đàn áp biểu uidA hoa cúc chuyển gen • Phân tích RNA gel blot Phân tích NA-gel blot sử dụng để xác nhận hoạt động phiên mã gen (Hình 4) Một band phát với đầu dò nptII, không phát band sử dụng uidA hpt Điều ngụ ý có gen nptII phiên mã, uidA hpt khơng được, chúng hòa nhập Hiện tượng không phụ thuộc vào promoter sử dụng, từ hoạt động GUS biến sớm trồng sau chuyển đổi không phụ thuộc vào promoter sử dụng để điều khiển gen uidA Figure Hoạt động gen gus Chọn giống hoa cúc Trang 26 Figure Hoạt động gus theo thời gian trồng Figure Bảng điện di NPIII, GUS HPT Chọn giống hoa cúc Trang 27 Figure Phân tích southern blot gen chuyển Kết luận Phương pháp chuyển gen hiệu nhờ chủng vi khuẩn A Tumefaciens EHA101, sử dụng vector pIG121Hm , có promoter 35S, giống ‘Shuhounotikara’và số gen hòa nhập, có gen nptII phiên mã Nhờ phương pháp , người ta chuyển gen đổi màu sắc hoa, giảm lão hóa, gen kháng sâu bệnh để tạo giống Ở Việt Nam, có giống hoa cúc HCV-1 chuyển gen anti-ACO giúp cho hoa tươi lâu, giống hoa cúc HCT1 kháng sâu ( kết đạt Bộ môn kỹ thuật di truyền, Viên di truyền Nông nghiệp- AGI) IV Ứng dụng Cơng dụng dễ thấy lồi có hoa dùng để trang trí Hoa cúc trồng ngồi khu vườn để trang trí thê cho ngơi nhà Ngoặc đươc trưng bày vị trí nha để làm đẹp Các loại hoa cúc khác dùng để tặng trogn dịp đặc biệt Các cơng dụng khác kể đến • Làm thực phẩm: • Chiết xuất lấy mật hoa, tinh dầu • Làm thuốc y học cổ truyền Hoa cúc coi loại thảo dược có nhiều tác dụng việc thưởng thức chữa bệnh Từ nhiều năm nay, hoa cúc khô tươi dùng để chế biến thành loại trà Các thành phần hoạt chất tinh dầu hoa cúc Bisabolol coi có tác dụng chống kích ứng, chống viêm chống vi khuẩn Ngồi ra, hoa cúc làm dịu tâm trạng (trà hoa cúc), tốt cho da mắt( cháo hoa cúc), làm giảm chứng chuột rút kì kinh nguyệt Tổng kết Bằng kỹ thuật, phương pháp chọn giống Việt Nam tạo số giống kể đến như: Chọn giống hoa cúc Trang 28 - C07.7:chọn lọc phương pháp lai giống Chevrolet x C05.5 Có kiểu hoa bán kép cỡ trung bình, màu đỏ vàng với vòng tâm vàng, sâu - C07.16: chọn lọc phương pháp lai giống C05.1 x Sunny Yellow Có bơng hoa kiểu thược dược cỡ trung bình, màu vàng tươi có tâm xanh sâu Ưu điểm hai giống hoa đẹp màu đỏ vàng với vòng tâm vàng, s; khả thích ứng tốt với điều kiện địa phương khả chống chịu tốt với ruồi đục rỉ sắt trắng - CVM3: cho hoa màu vàng đồng, tạo từ giống cúc tím Đài Loan nhập nội với cơng nghệ chiếu xạ in vitro có tính ổn định di truyền cao, đồng đều, bệnh, sinh trưởng khỏe, cho hoa to đẹp, đáp ứng thị hiếu ngày cao người tiêu dùng - LĐ9: xử lý đột biến chiếu xạ tia gamma nhân nhanh biện pháp ni cấy mơ Lá có màu xanh, to tròn, xẻ thùy cạn Hoa kép với nhiều lớp cánh, cánh xếp đẹp, màu vàng Giống có khả sinh trưởng phát triển tốt, thời gian hoa từ 81,4-81,7 ngày, cành hoa cao 58,1-58,3 cm, đường kính hoa từ 9,4-9,5 cm; bị nhiễm bệnh đốm lá, cháy lá, chết héo, cho suất chất lượng hoa cao Nhờ phương pháp chọn giống hoa cúc, ngưới ta tạo nhiều giống hoa cúc lạ có tiềm cao kinh tế - Tạo nhiều giống hoa cúc với màu sắc màu xanh, đồng hay pha trộn màu lại với Hình dáng, kích thước, hương thơm đặc tính khác đa dạng - Giống cúc tạo bệnh có khả chống chọi loại sâu bệnh, nấm vi khuẩn - Giống có ưu điểm giúp tiết kiệm kinh phí trồng chăm sóc Lấy ví dụ giống kháng sâu bệnh ta bớt tiền để phun thuốc trừ sâu Ngoài ra, giống có thời gian sinh trưởng ngắn tiết kiệm thời gian chăm sóc - Cây thích nghi tốt với điều kiện môi trường khác nhau: nhiệt dộ8, khí hậu, đất đai… - Các giống có khả chịu han giúp tăng suất trồng thêm nhiều vụ năm Chọn giống hoa cúc Trang 29 ... nhiều tác giả khác Giống hoa cúc thu cách sử dụng mẫu cấy mắt đơn chiếu xạ microcuttings cách chiếu mẫu cấy với mơ sẹo tái tạo trước cuống Chọn giống hoa cúc Trang 17 Chọn giống hoa cúc Trang 18 2.2... trạng (trà hoa cúc) , tốt cho da mắt( cháo hoa cúc) , làm giảm chứng chuột rút kì kinh nguyệt Tổng kết Bằng kỹ thuật, phương pháp chọn giống Việt Nam tạo số giống kể đến như: Chọn giống hoa cúc Trang... lá, chết héo, cho suất chất lượng hoa cao Nhờ phương pháp chọn giống hoa cúc, ngưới ta tạo nhiều giống hoa cúc lạ có tiềm cao kinh tế - Tạo nhiều giống hoa cúc với màu sắc màu xanh, đồng hay