chọn giống cây đu đủ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA: SINH HỌC MÔN: CHỌN GIỐNG –|– GVHD: I TÀI NGUYÊN DI TRUYỀN 1.1 Phân loại: Lưu Thị Thanh Tú Tên khoa học Carica papaya L., thuộc họ Caricaceae Một số tác giả cho họ Caricaceae gồm 31 loài thuộc giống Carica, Jacaratia Jarilla từ vùng nhiệt đới châu Mỹ giống Cylicomorpha từ vùng xích đạo châu Phi (Nakasone Paull, 1998) Một nghiên cứu phân loại học gần đề nghị vài loài giống Carica thuộc giống Vasconella (Badillo, 2002) Do phân loại họ Caricaceae sửa lại, họ Caricaceae gồm giống Cylicomorpha giống Nam Mỹ Trung Mỹ (Carica, Jacaratia, Jarilla, Horovitzia Vasconella) Carica papaya L loài thuộc giống Carica Carica papaya L biết đến với tên paw paw, papaw Ở Australia, trái có ruột màu đỏ gọi papaya, trái có ruột màu vàng gọi paw paw Ở đất nước khác, đu đủ có tên papaya Đặc điểm chung họ Caricaceae thân thẳng, mềm, sinh trưởng nhanh, thân thường không phân nhánh, xếp hình xoắn ốc bao quanh đỉnh, bị tổn thương, thân chảy nhực trắng đục sữa (Magdalita, 2002) 1.2 Đặc điểm hình thái: Thân: đạt chiều cao – 10m, đường kính gốc đạt 30 cm Thân khơng phân nhánh, mang nhiều sẹo lá, đốt sít Cấu tạo thân: phần vỏ sau lớp biểu bì mạng lưới dày đặc bó sợi gỗ có tác dụng chống đổ cho Phần sau lớp vỏ tế bào nhu mô làm nhiệm vụ dự trữ dinh dưỡng cho (Trần Thế Tục, 1998) Trên thân có mơ phân sinh bên hình thành chồi song phần lớn chúng trạng thái ngủ (Trần Thế Tục Đoàn Thế Lư, 2002) Rễ: rễ chùm, đâm nhánh ngang mạnh gặp điều kiện thuận lợi mọc xuống sâu Đu đủ khơng có rễ mà có rễ con, thường có hai loại rễ: loại rễ cố định : có đường kính trung bình – 4cm, ăn sâu 0,7 – 1m Thường giữ vai trò thay rễ nghĩa có tác dụng làm cho vững chắc, thường có – rễ Loại rễ hút: phân bố dày đặc tầng đất mặt, có nhiều lơng hút, có tác dụng hút chất dinh dưỡng cung cấp cho Đường kính rễ trung bình 0,5mm, phân bố nhiều tầng đất 10 – 30 cm (Dương Tấn Lợi, 2002) Rễ nhỏ, mềm, giòn, dễ bị tổn thương giới ngập úng khô hạn Rễ thường phân bố nông, tập trung tầng đất – 30 cm Nếu đất thống khí, tầng canh tác dày, tiêu nước tốt rễ phân bố tầng đất sâu 50 – 60 cm Rễ phân bố rộng tương đương với độ rộng tán mặt đất Trong đất, rễ hoạt động mạnh chúng cần nhiều oxy (Trần Thế Tục Đoàn Thế Lư, 2002) Lá: đơn mọc thành chùm cây, xếp theo đường xoắn ốc bao quanh đỉnh, có rộng Lá chia thành nhiều thùy, thường số thùy ổn định đạt – với số thùy biến động từ – thùy Phiến đạt kích thước từ 60 – 100 cm Cuống đạt độ dài từ 70 – 90 cm (Trần Thế Tục Đoàn Thế Lư, 2002) Lá mẫn cảm với sương muối, gió lạnh điều kiện ngoại cảnh không thuận lợi hạn, úng, thiếu dinh dưỡng Biểu chậm, phiến héo rũ, hoại tử mô lá, rụng sớm Số liên quan chặt chẽ đến suất cây, tỷ lệ thuận với khả đậu trái suất thu hoạch Một trung bình đạt 13 – 17 xanh hoạt động tỷ lệ hoa đậu phát triển bình thường Nếu đạt 25 – 30 xanh hoạt động suất cao ổn định ( Trấn Thế Tục Đồn Thế Lư, 2002) Do cần ý bảo vệ Hoa: có ba loại hoa: hoa đực (1), hoa lưỡng tính (2), hoa (3) Hoa mọc nách Hoa thường nở vào ban đêm thời gian từ nở kéo dài – ngày (Trần Tục Đoàn Thế Lư, 2002) Hoa đực có cánh, đường kính 0,4 – 0,5 cm, dài – cm Nửa hoa dính liền tạo thành dạng ống, nửa tách rời Hoa có 10 nhị đực phát triển, hoa bé, màu trắng Bầu noãn tiêu biến không cho trái (Nguyễn Thành Hối ctv, 1996) Một số hoa đầu nhánh có bầu nhụy phát triển, tạo quả nhỏ, ăn đắng khơng có giá trị (Trần Thế Tục, 1998) Hoa có cánh rời, dài – cm, đường kính – cm Hoa có bầu nỗn lớn – cm, nhị đực thối hóa Hoa mọc riêng chùm có – hoa Hoa có khả tự tạo trái, cho vài trái bầu noãn tự phát triển (dạng trinh sinh) trái nhỏ khơng có hạt (Nguyễn Thành Hối ctv, 1996) Hoa lưỡng tính có cánh, nửa tách rời, nửa hợp thành ống Hoa có nhị đực bao phấn hoạt động, vòi nhụy cao nhị giúp sẵn sàng nhận phấn, bầu noãn hoạt động tốt giúp khả đậu trái cao Hoa lưỡng tính vừa có khả tự thụ phấn vừa thụ phấn chéo để tạo (Dương Tấn Lợi, 2002) Quả: thuộc loại thịt, hình dạng độ lớn thay đổi tùy giống, thường có dạng dài, ovan, lê, dài, tròn Theo Nguyễn Thành Hối (1996), hình dạng tùy thuộc vào loại hoa thụ tinh: hình trứng hay hình cầu hoa phát triển, trái lớn tròn, mỏng cơm, bọng ruột Hình thon dài: hoa lưỡng tính tạo thành, thường dài 20 – 40 cm, đường kính – 15 cm, trọng lượng 0,5 – kg, dày cơm, hạt nhiều, ngon Thời gian sinh trưởng kể từ lúc tàn hoa đến lúc chín kéo dài – tháng phụ thuộc giống, địa điểm trồng mùa vụ hoa Khi chưa chín có màu xanh chuyển sang xanh đậm, xanh sữa chín có màu vàng vàng da cam, vàng sẫm Khác với trồng khác, phẩm chất đu đủ phụ thuộc nhiều vào thời gian chín, mức độ thụ phấn, số lượng hạt hình thành qua thụ tinh Nhìn chung, chín thời gian mưa, nhiệt độ cao có nhiều hạt phẩm chất tốt Vỏ mỏng, dễ dập nát nên cẩn thận vận chuyển (Trần Thế Tục Đoàn Thế Lư, 2002) Hạt: lượng hạt hay nhiều phụ thuộc việc thụ phấn điều kiện ngoại cảnh tác động Nếu thụ phấn tốt, có 1000 hạt có có hạt phần cuống, có khơng có hạt Trái đu đủ trung bình có 300 – 500 hạt Trái đu đủ già thường có khoảng 60 – 70% hạt mọc thành Hạt già có màu đen xám thường chìm nước Bên ngồi hạt có lớp vỏ lụa mỏng bao quanh ngăn cản thấm nước nên cần chà tróc lớp vỏ trước gieo, có chứa dầu nên dễ sức nảy mầm Hạt nảy mầm tốt nhiệt độ 350C, 230C hay cao 440C ức chế hạt nảy mầm (Trần Thế Tục Đoàn Thế Lư, 2002) 1.3 Giới tính đu đủ: Cây đu đủ có ba loại giới tính: đực, cái, lưỡng tính Cây đực thường khơng cho quả, có số cho hoa lưỡng tính cuống dài có khả đậu Cây liên tục, quanh năm Cây lưỡng tính cách mùa (tháng – đậu quả, cho thu hoạch vào tháng – 11) (Dương Tấn Lợi, 2002) Vì người trống đu đủ ln mong muốn mà họ trồng lưỡng tính Đu đủ thường hoa vào – tháng sau trồng cho trái vào – tháng, thời gian chờ đợi từ trồng đến thu hoạch tương đối dài Cây đực: mang hoa đực, khơng có Một số hoa đầu nhánh có bầu hoa phát triển hình thành quả nhỏ, ăn đắng khơng có giá trị thương phẩm Cây đu đủ đực khơng có ý nghĩa suất song chúng cho phấn, giúp tăng suất phẩm chất Cây đu đủ cái: mang hoa Để tạo thành hoa phải nhận phấn từ đực lưỡng tính song chúng phát triển đơn tính sinh Nếu dùng phấn hoa lưỡng tính thụ phấn nhân tạo khả cho tốt Quá trình hoa ổn định, bị ảnh hưởng chi phối điều kiện ngoại cảnh Cây đu đủ lưỡng tính: mang hoa lưỡng tính mọc thành chùm đơn độc; mọc thánh chùm ngồi hoa lưỡng tính chùm có hoa đực Tùy vào điều kiện dinh dưỡng điều kiện ngoại cảnh năm, lưỡng tính loại hoa khác Trong điều kiện nhiệt độ tăng cao dần trình tự nở hoa là: từ hoa lưỡng tính dạng chuyển sang hoa lưỡng tính dạng đực hoa đực có cuống ngắn Ngược lại nhiệt độ chuyển từ cao xuống thấp, lúc từ hoa lưỡng tính dạng đực hoa đực chuyển thành hoa lưỡng tính dạng Như q trình hoa lưỡng tính khơng ổn định, khả đậu khơng cái, trọng lượng lại cao, phẩm chất lại tốt (Trần Thế Tục, 1998) 1.4 Đặc tính thực vật: Đu đủ thường đồng chu, đu đủ xếp thành loại phương diện giới tính: đực, lưỡng tính Vài đu đủ trổ ba loại hoa nói Ngồi có hoa khơng hẳn hồn tồn đực, hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều đặc tính ba loại hoa Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn thời tiết gây khô hạn thay đổi nhiệt độ Nhiệt độ cao khuynh hướng sản xuất hoa đực lớn Hoa đực đực màu xanh lục, mọc từ nách chùm dài, nhiều nhánh Hoa lớn hơn, cuống ngắn, mọc rải rác hay hai ba hoa phần thân, sản xuất trái tròn, bầu dục hay hình trái lê, vỏ xanh hay vàng trái chín Cây đực lẽ dĩ nhiên khơng có trái Trái hoa lưỡng tính ưa chuộng thị trường Vì vậy, cần lựa chọn cho trái với loại hoa hay hoa lưỡng tính thích hợp Nhà vườn lựa chọn được, gieo hột lấy từ trái thụ phấn tự Trái lại, nhà vườn lựa chọn cách xác cái, lưỡng tính cách bao giấy hoa hay hoa lưỡng tính chưa nở, tự lựa phấn để rắc tay (thụ phấn chéo) vào vòi nỗn hoa hay hoa lưỡng tính nở Những nghiên cứu thụ phấn đu đủ cho biết rằng:  Thụ phấn hoa phấn hoa đực nửa số đực, nửa  Dùng phấn hoa lưỡng tính để thụ phấn hoa nửa số cái, nửa lưỡng tính  Hoa lưỡng tính tự thụ tinh hay thụ phấn chéo với phấn hoa lưỡng tính khác cho tỉ lệ hai lưỡng tính  Dùng phấn đực để thụ phấn hoa lưỡng tính phần ba số cái, phần ba đực, phần ba lưỡng tính Chiếu theo nghiên cứu này, phương cách 2) 3) cho trái nhiều Nếu khơng làm thụ phấn tay, nhà vườn để lại vài đực vườn đủ bảo đảm hoa khác thụ phấn trái 1.5 Nguồn gốc phân bố: Mặc dù có nhiều ý kiến khác nguồn gốc đu đủ, theo Nakasone Paull (1998), đu đủ có nguồn gốc từ vùng thấp trung đông châu Mỹ, từ Mexico đến Panama Sau hạt chúng phân bố đến Caribbean Đông Nam Á qua thám hiểm người Tây Ban Nha, từ nơi đu đủ phổ biến rộng rãi đến Ấn Độ, quần đảo Thái Bình Dương, châu Phi (Villegas,1997) Do đu đủ có khả giao phấn lớn nhân giống hạt nên bị phân ly lớn, không giữ đặc tính ban đầu bố mẹ nên người ta chưa tìm thấy dạng gần gũi với dòng, giống trồng Hiện nay, đu đủ trồng nước vùng nhiệt đới vùng nhiệt đới ẩm châu Á phạm vi 320 Bắc – 320 Nam, nơi có nhiệt độ bình qn năm khơng thấp 150C Tuy nhiên với tiến công tác chọn giống tạo số giống tương đối chịu lạnh Trên giới, nước trồng nhiều đu đủ Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Philippine, Mianma, Malaysia (châu Á); Tazania, Ugan da (châu Phi); Brazil, Mỹ (châu Mỹ); Úc , Newzealand (châu Úc) Ở Việt Nam, đu đủ trồng nhiều tỉnh miền Bắc miền Nam, chúng trồng nhiều tỉnh đồng Hà tây, Hà Nam, Hưng Yên, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Bình Dương, Tiền Giang, Sơng Bé tỉnh Tây Nguyên (Trần Thế Tục Đoàn Thế Lư, 2002) 1.6 Các giống đu đủ trồng Việt nam: Ở Việt nam ba giống đu đủ địa phương truyền thống đu đủ thịt đỏ, đu đủ thịt vàng đu đủ thịt vàng cam nhiều giống đu đủ nhập nội từ nước từ Viện Cây ăn nhiệt đới Á Châu (ở Đài Loan), Đài Loan, Thái Lan Nam Mỹ Các giống đu đủ chủ lực Việt nam gồm có:  Các giống đu đủ nội địa: Giống đu đủ thịt đỏ nội địa: Thịt màu đỏ, dày, giòn, thơm ngon, ngọt, trồng nhiều đất giồng đồng sông Cửu Long, giáp biên giới Campuchia Đu đủ thịt đỏ gồm nhiều hoa lưỡng tính đậu có Quả hình bầu dục, đầu nhọn, màu xanh, vàng chín Giống đu đủ thịt vàng nội địa: Cũng tìm thấy đất giồng, giống có nhiều đực hơn, nhiều hơn, tròn ngắn có màu vàng chín Hột nhiều hơn, ruột mỏng mềm nhũn, ăn hôi Giống đu đủ thịt vàng cam nội địa: Có thịt màu vàng cam, hình bầu dục thơm đu đủ thịt đỏ Nói chung giống đu đủ nội địa trồng rải rác hộ nông dân, trồng theo kiểu tự cấp, tự túc gia đình Ưu điểm giống đu đủ nội địa dễ gieo ươm từ hạt, hạt tự mọc bứng đem trồng Các giống đu đủ nội địa khơng thích nghi thâm canh diện tích lớn  Các giống đu đủ nhập nội: Đu đủ có nhiều loại giống nhập nội khác phổ biến giống sau: +Giống đu đủ Hong Kong da bông: Cho suất cao, trọng lượng trung bình từ 2,5-3kg, vỏ dày, chống chịu với nhện đỏ bệnh Virus Thịt có màu vàng, hàm lượng đường từ 9-10% +Giống đu đủ Đài Loan tím (F1): Năng suất cao, nhiều, trọng lượng từ 1,2-1,5 kg Thịt có màu đỏ tím, thịt Hàm lượng đường từ 10-11% Cây dễ bị nhện đỏ bệnh Virus, có khả cho trái tốt năm đầu +Giống đu đủ EKSOTIKA: Cho phẩm chất ngon, thịt màu đỏ tía, thịt, tươi đẹp, hàm lượng đường 13-14%, trọng lượng 0,5-1kg +Giống đu đủ Solo: Có đặc điểm gần giống EKSOTIKA thịt trái hơn, thơm ngon hơn, hàm lượng đường 15-17%, trọng lượng trái 300500g Nguồn gốc xứ từ Barbade Nam Mỹ tuyển chọn Hawaii lâu ngày giống thương mại hóa thị trường quốc tế Các đu đủ Solo phát sinh từ hoa lưỡng tính tự thụ phấn lấy, cỡ đặn, to vừa phải, hình lê tây mùi vị ưa chuộng Đu đủ Solo phổ biến nhiều Phi Châu Trước có đem trồng Việt Nam Ở Việt Nam, đu đủ Solo có ruột màu cam Hiện Hawaii có giống Solo cải thiện gọi giống “Solo mặt trời mọc” (Sunrise Solo), có ruột màu hồng lợt, nên du nhập trồng thử Việt Nam +Giống Đu đủ Hồng Phi 786 (Red Lady 786): Cây phát triển khỏe, có sớm, có lúc cao khoảng 80cm Tỷ lệ đậu cao, mùa đậu 30 trở lên, sản lượng cao Quả lớn, trọng lượng từ 1,5-2Kg (có thể đạt 3kg/quả) Cây hình bầu dục, lưỡng tính cho dài Da nhẵn bóng, thịt dày màu đỏ tươi, hàm lượng đường 13-14%, dễ vận chuyển Giống đu đủ thích nghi để thâm canh với diện tích lớn, có giá trị xuất  Các giống đu đủ lai tạo Việt Nam: _Với mục tiêu nhanh chóng tuyển chọn, lai tạo số giống đu đủ có ưu điểm vượt trội so với giống nhập nội như: khả kháng bệnh tốt hơn, suất, chất lượng tương đương cao hơn, sản xuất hạt giống lai F1 với giá thành thấp để cung cấp cho nông dân nhằm mở rộng diện tích, từ năm 2005 đến nhà khoa học Bộ môn Di truyền chọn tạo giống thuộc Khoa Nông học, Trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội tập trung nghiên cứu, tuyển chọn, lai tạo trồng thử nghiệm thành công giống đu đủ đáp ứng tiêu chí nói đặt tên VNĐĐ9 v VN10 - Tra mẫu: Mẫu DNA đợc trộn víi ®Ưm tra mÉu theo tØ lƯ 1V mÉu : 1V - đệm 1X nhỏ vào giếng tra mẫu gel Chạy điện di: điện từ 60 -80 V DNA di chun tõ cùc ©m sang cự dơng Quan sát di chuyển màu bromophenol blue để biết - lúc ngừng điện di Nhuộm DNA EtBr: Bản gel đợc lấy khỏi khay ngâm vào dung dịch EtBr 0,5 mg/l thời gian khoảng 15 phút máy lắc nhẹ Sau rửa gel nớc soi dới ánh sáng tử ngoại 300nm máy soi DNA, chụp ảnh phim polaroit Bc 3: Thiết kế Primer: Đoạn trình tự acid amin giống phía hai đầu protein đợc chọn chuyển thành trình tự nucleotid để sử dụng làm primer Bc 4: Phơng pháp RT-PCR Qui trình: - Tổng hợp sợi khuôn thứ đoạn cDNA: hỗn hợp phản ứng đợc chuẩn bị theo trình tự bảng sau: Thành phần phản ứng Thể tích (20l) Nồng độ cuối Dung dịch MgCl2 5mM Đệm PCR 10X 1X Nớc xử lý DEPC - dNTP 2( loại) 1mM Rnase inhibitor 1U/l Oligo dT 2,5M RNA tæng sè ~1g MuLV reverse Transcriptase - 2,5U/(l) Ph¶n øng ®ỵc thùc hiƯn theo chu kú nhiƯt: 420C 2h; 950C 5' 50C 5' Sản phẩm đợc sử dụng cho phản ứng - khuếch đại đoạn cDNA Khuếch đại đoạn cDNA: hỗn hợp phản ứng đợc chuẩn bị theo trình tự bảng sau: Thành phần phản ứng Thể tích (100l) Nồng độ cuối Dung dịch MgCl2 2mM Đệm PCR 10X 1X Níc khư ion 57.5 - Måi 1,25pmol Måi 1,25pmol Taq DNA polymerase 0,5 2,5U/100l Sợi đơn cDNA (mới tổng hợp) 20 - Phản ứng đợc thực hiÖn theo chu kú nhiÖt: 940C 5'; (940C 1'; 550C 1'; 720C 1', lặp lại 35 vòng) 720C 10' Bc 5: Phơng pháp tách tinh DNA từ gel Agarose ly tâm DNA sau đợc phân tách phơng pháp điện di gel agarose, gel đợc nhuộm vớiEtBr 15 đợc soi dới đèn UV xác định đoạn DNA cần tách Dùng dao nhọn cắt phần gel chứa đoạn DNA cần tách đa vào ống tube đợc thiết kÕ nh sau: - Ly t©m ë 13500 v/p 5', thu dÞch tube 1,5ml chun sang tube - khác Thêm: - 0,1V NaOAc 5M (Hoặc 0,2V NH4OAc 10M) 2l LPA 0,25% (liner polyacrylamide) 2V EtOH; Đặt -200C 15' Ly t©m 13500v/p 15 ë 40C Thu kÕt tđa vµ rưa b»ng etanol 70% Lµm khô speed vaccum Tan tủa 20l TE giữ 40C Bc 6: Phản ứng ghép nối đoạn gen với vector - Đoạn DNA cần nối ghép vector mở vòng đợc trộn lẫn với theo tỷ lệ 3:1 số lợng phân tử Lợng DNA cần nối thờng đợc tính - theo công thức Số ng DNA = Chiều dài đoạn DNA (bp) X ng vector KÝch thíc vector (bp) Trong ®ã víi kÝch thíc vector xấp xỉ 4000bp lợng vector thờng - dùng X = 50 ng T4 ligase đợc cho vào phản ứng với nồng độ đơn vị/ 10l phản ứng Hỗn hợp phản ứng đợc trộn theo thứ tự: ddH2O l l Đệm T4 ligase x10 Đoạn gen cần gắn l Vector mở vòng l T4 ligase (4 đơn vị/l) 0,5 l thể tích 10 l - Phản ứng đợc ủ qua đêm 12-160C ủ 40C 24h Đệm lai (10X): 200mM Tris- HCl; 50mM MgCl2; 50mM dithiothreitol; 500 g/ml BSA, pH=7,6 Bc 6: Phơng pháp xử lý với enzim giới hạn Mung-bean nuclease - Các vector tái tổ hợp đợc xử lý với enzim giới hạn theo phản ứng: Xử lý với enzim: Hỗn hợp phản ứng đợc trén theo thø tù (30 -x - 3,5) l H20 l Đệm 10X riêng enzim Dịch plasmid x l (~1g) Enzim (10U/l) 0,5l Tỉng thĨ tÝch ph¶n øng - 30l Xử lý với hai enzim: Hỗn hợp phản ứng đợc trộn theo thứ tự (30 -x - 3,5) l H20 l §Ưm 10X chung tèi u cho hai enzim x l (~1g) DÞch plasmid Enzim (10U/l) 0,5 l Enzim (10U/l) 0,5 l Tỉng thĨ tÝch phản ứng 30 l - Phản ứng đợc ủ 370C qua đêm sản phẩm cắt đợc kiểm tra - điện di gel agarose 1% Xử lý với Mung-Bean nuclease - Vector pRSETA đoạn gen PRSVN sau đợc cắt enzim giới hạn có đầu dính đợc xử lý tạo đầu với enzim Mung-Bean nuclease b»ng ph¶n øng: 16 l H20 l Đệm 10X 10 l Dịch plasmid pRSETA đoạn gen PRSVN (~1g) Enzim Mung-bean (3,9U/l) Tỉng thĨ tÝch ph¶n øng - l 30 l Phản ứng đợc ủ nhiệt độ phòng 15' sản phẩm cắt đợc kiểm tra điện di gel agarose 1% Bc 7: Phơng pháp biến nạp Biến nạp vào E coli - Chuẩn bị tế bào khả biến: + Lấy khuẩn lạc E coli (DH 5) nuôi 10 ml LB lỏng 370C qua đêm, lắc 250v/p + Hút 0,5ml dịch tế bào cho vào 50ml LB lỏng nuôi 4h 370C, lắc 250v/p + Thu dịch tế bào làm lạnh đá 10' + Ly tâm 4000v/p ë 40C 5', thu kÕt tña + Tan tủa tế bào 5ml CaCl2 0,1M ( để lạnh sẵn 00C), ly tâm thu tủa + Tan tủa tế bào 0,85ml CaCl2 0,1M ( để lạnh sẵn ë 00C) vµ 0,15 + + + + ml glycerol , chia nhỏ 2001 vào ống eppendof Làm lạnh nhanh N2 lỏng, giữ -850C Biến nạp: Giữ ấm ống đựng tế bào khả biến cho tan băng đặt vào đá Thêm ~50ng dung dịch plasmid vào ống tế bào, ủ 30' đá Sốc nhiệt 420C 90'', chuyển sang nớc đá 2'-3' + Trộn thêm 8001 dung dịch SOC ủ 1h 370C + Hút 501 1001 dịch tế bào cấy trải môi trờng LB đặc bổ sung 50mg/l Kanamixin, đặt qua đêm 370C chọn lọc khuẩn lạc đợc biến nạp Biến nạp vào agrobacterium - Chuẩn bị tế bào khả biến: + Lấy khuẩn lạc agrobacterium nuôi 10 ml LB lỏng 290C qua đêm, lắc 250v/p + Hút 4ml dịch tế bào cho vào 100ml LB lỏng nuôi 4h 290C, lắc 250v/p + Ly t©m 4000v/p ë 40C 5', thu kÕt tủa + Tan tủa tế bào 0,85ml môi trờng LB láng vµ 0,15 ml glycerol , + + + chia nhỏ 2001 vào ống eppendof Làm lạnh nhanh N2 lỏng, giữ -850C Biến nạp: Giữ ấm ống đựng tế bào khả biến cho tan băng đặt vào đá Thêm ~50ng dung dịch plasmid vào ống tế bào, làm lạnh nhanh N2 lỏng + Sốc nhiƯt ë 370C + Trén thªm 8001 dung dÞch SOC đ 2h ë 280C + Hót 501 1001 dịch tế bào cấy trải môi trờng LB đặc bổ sung 50mg/l Kanamycin, đặt 280C từ hai đến ba ngày chọn lọc khuẩn lạc đợc biÕn n¹p + LB: 10g/l Trypton; 10 g/l NaCl; 5g/l extrac yeast, pH 7,0 + SOC: 20g/l Trypton; 5g/l extrac yeast; 0,5g/l NaCl; 10ml/l KCl 0,25M vµ 5ml/l MgCl2 2M; pH 7,0 Bước 8: KiĨm tra khn l¹c chøa vector tái tổ hợp PCR - Lấy phần khuẩn lạc chuyển vào ống Eppendorf có chứa sẵn 45l ddH2O khử trùng Đun sôi phút Ly tâm nhanh, chuyÓn 41,75 l sang èng Eppendorf 0,5 ml cã chøa sẵn thành phần cho phản ứng PCR: dNTP(10mM) l §Ưm PCR x10 l Måi Måi l l Taq polymerase 0,25 l  thÓ tích 8,25 l - Chu trình nhiệt là: 940C: phót; (940C: phót, 560C: phót, 720C: - phút 20 giây) lặp lại 25 chu kỳ; 720C: 10 phút Kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR gel agarose 1%, (15 l/mÉu) Bước 9: T¸ch chiÕt DNA plasmid từ E coli - Hoá chất Dung dịch I: glucose 50mM; Tris-HCl 25mM, EDTA 10mM, pH 8,0 Dung dÞch II: NaOH 0,2N; SDS 1% Dung dÞch III: 60ml Potassium acetat 5M : 11,5ml axit acetic : 28,5ml - H2O Natri acetat 3M pH 5,2  Qui tr×nh - CÊy chuyển khuẩn lạc vào ống nghiệm chứa ml môi trờng LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc, nuôi cấy lắc qua đêm 370C, 200 - vòng/phút Chuyển 1,5 ml dịch nuôi cấy vào ống Eppendorf loại 1,5 ml - đem ly tâm 6000 vòng/phút, phút để thu tế bào Loại bỏ dịch Cặn đợc hoà 100 l dung dịch I máy vortex Bổ sung 200 l dung dịch II Đảo ống Eppendorf nhẹ nhàng, giữ - phút Hỗn hợp trở nên suốt quánh Bổ sung tiếp 150 l dung dịch III đảo nhẹ nhàng, giữ - phút Trong hỗn hợp xuất kết tủa trắng Đem ly tâm 10 phút tốc độ 10000 vòng/phút Chuyển dịch sang ống Eppendorf míi Bỉ sung 450 dung dÞch Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1), trộn thật đem ly tâm 10000 vòng/phút, 15 phút để loại protein DNA nhiễm sắc - thể Hút nhẹ nhàng pha sang ống Eppendorf moi lặp lại bớc với 400 l dung dịch hỗn hợp Chloroform: Isoamyl Alcohol (24:1) để loại bỏ - lợng nhỏ phenol sót lại khỏi dung dịch DNA plasmid Hút nhẹ nhàng pha sang ống Eppendorf (tránh làm vẩn pha dới) Tủa dịch thu đợc với lần thể tích cồn tuyệt đối có thêm dung dịch mi Natri axetat tíi nång ®é ci cïng 0,3 M §Ĩ dung dÞch DNA - kÕt tđa ë -200C qua đêm -750C Thu DNA kết tủa dung dịch cách đem ly tâm 14000 vòng/phút 15 phút 40C Phần kết tủa đợc rửa với cồn 700C - thu lại cách ly tâm 14000 vòng/phút 10 phút Hoà tan DNA thu đợc vào 30l dung dịch TE nớc cất hai lần - khử trùng Giữ -200C Chạy điện di kiểm tra gel agarose 0,8% Bc 10: Phân tích trình tự nucleotide - pCR2.1-TA vector có chứa đoạn gen CP sau tinh đợc đọc trình tự gen máy đọc tự động, sử dụng cặp mồi đọc trình tự - M13 forward reverse Kết đợc phân tích máy tính, sử dụng chơng trình phần mềm DNAstar Từ chơng trình tiến hành: + So sánh trình tự nối ghép đoạn gen đợc đọc từ hai đầu forward reverse + Xác định đợc vị trí, số lợng enzyme giới hạn trình tự DNA + Phiên mã tr×nh tù nucleotide sang tr×nh tù amino acid theo mét - khung đọc mở Trình tự nucleotide đợc so sánh với trình tự nucleotide gen CP khác ngân hàng gen trang Web: www.ncbi.nlm.nih.gov chơng trình EMBL FASTA Bc 11: Thiết kế vector chuyển gen mang gen PRSVN Gen PRSVN vector p2K7 đợc cắt hai enzim Sac I Xba I, đợc tinh điện di gel agarose Gen PRSVN đợc chèn vào vector p2K7 để gắn với 35S promoter Nos terminater T4 ligase Vector tái tổ hợp đợc biến nạp vào E.coli Top10F' Cấu trúc 35S pro - gen PRSVN - Nos ter đợc cắt Hind III Kpn I đa vào vector chuyển gen pCAMBIA2300 đợc mớ vòng hai enzim Hind III KpnI Vector tái tổ hợp bớc đợc biến nạp vào chủng vi khuẩn Agrobacterium LBA4404 Các khuẩn lạc đợc chọn lọc kanamycin khẳng định phản ứng PCR Bc 12: Biểu gen CP E.coli Gen PRSVN đợc đa vào vector biểu pRSETA ba bớc: + Đầu tiên pRSETA đợc mở vòng enzim Pst I p2300-PRSVN đợc mở enzim Xba I + Sau đó, đoạn gen vector đợc xử lý tạo đầu với enzim Mung Bean, cắt với enzim Nco I Đoạn gen PRSVN đợc gắn vào pRSETA T4 ligase đợc biến nạp vào chủng E.coli BL21(DE3) + Chủng E.coli BL21(DE3) mang plasmid tái tổ hợp pRSETA-PRSVN đợc nuôi 2ml môi trờng LB qua đêm Sau lấy 0,25 ml dịch nuôi cấy tiếp tục nuôi 25ml LB Sau giê, kiĨm tra OD (kho¶ng 0,30,5), thêm IPTG vào môi trờng (nồng độ cuối 0.5mM), tiếp tục nuôi qua đêm thu sinh khối tế bào Tủa tế bào đợc hoà tan đệm đun sôi 5' Sau Protein tổng số đợc phân tích điện di gel acrylamide 12% Bước 13: Western blotting - Protein tỉng sè ph©n tÝch gel acrylamide đợc chuyển sang màng - nitrocellulo PVDF điện di 60V Vạch protein đợc phát nhuộm màng dung dịch nhuộm, quan sát màu ngừng phản ứng nhuộm rửa màng víi níc 3.2.3 Kết  T¸ch ARN tỉng sè: l dịch ARN đợc lấy điện di gel agarose 1% để kiểm tra chất lợng hàm lợng ARN Thiết kế primer Xác định điều kiện tối u cho phản ứng PCR Sàng lọc gen CP PRSV từ mẫu đu đủ nhiễm PRSV Việt Nam: Kết sàng lọc phơng pháp RT-PCR cho thấy có đoạn gen CP đợc nhân lên với tất mẫu nhiễm PRSV đợc sàng lọc Kết lặp lại sử dụng hai cặp primer MB11-MB12 nh2-nh5 Điều đợc khẳng định gen CP cđa PRSV ë ViƯt Nam cã cïng mét kÝch thíc vµ nh vËy cã thĨ chóng lµ cïng chủng PRS Phân tích trình tự gen CP Đoạn gen CP sau đợc nhân lên với hai cặp primer MB11-MB12 NH2-NH5 đợc đa vào vector pCR2.1 Vector tái tổ hợp đợc tinh đọc trình tự Chúng nhận đợc kết Sử dụng chơng trình Aligment phần mềm DNAstar để so sánh trình tự gen CP đợc nhân lên hai cặp primer khác Kết so sánh cho thấy hai trình tự tơng đồng (giống ~98%) Kiểm tra gen PRSVN nhận đợc PCR nhân lên đoạn đặc hiệu gen CP Ba cặp primer đặc hiệu cho gen CP PRSV đợc sử dụng Kết với cặp primer 10U&10L nhân lên đợc đoạn ADN khoảng 550bp hai gen PRSVN tõ PRSV cđa ViƯt Nam vµ CP tõ PRSV cđa Malaysia Nh vËy, chóng t«i cã thĨ khẳng định gen PRSVN CP PRSV Kiểm tra trình tự gen PRSVN nhận đợc cắt với enzim giới hạn Sử dụng chơng trình Mapdraw phần mềm DNAstar để phân tích đồ enzim cắt hạn chế gen PRSVN Trình tự gen PRSVN chứa 140 vị trí nhận biết enzim khác Nhng chọn số enzim Xba I (2), Dra I (278), Nru I (592), Nde I (728), Ban II (717, 905) and Sac I (905) để kiểm tra xác trình tự gen nhận đợc Thiết kế vector chuyển gen mang gen PRSVN Trớc tiên gen PRSVN đợc tách cắt với hai enzim Xba I Sac I, đợc đa vào vector p2K7 T4 ligase để tạo cÊu tróc víi 35S promoter vµ Nos terminator Vector tái tổ hợp đợc biến nạp vào E coli TOP 10F' đợc chọn lọc khuẩn lạc xanh/trắng môi trờng LB đặc có 50mg/l kanamycin Các khuẩn lạc tiếp tục đợc sàng lọc PCR tách plasmid để cắt với enzim giới hạn Dòng 1, nhận băng ADN ~900bp ~ 6Kb Băng 900bp gen PRSVN 6Kb phần vector p2K7 Trong dòng 3, 4, băng ADN nhận đợc tơng ứng ~630bp, ~725 ~ 590 băng đợc cắt từ gen PRSVN Dòng có băng ADN ~ 2,8Kb gen PRSVN gắn với 35S promoter Nos terminater Kết cho thấy gen PRSVN đợc gắn 35S promoter Nos terminator p2K7 vector CÊu tróc 35S pro - gen PRSVN - Nos ter (băng 2,8Kb) đợc tinh đợc đa tiếp vào vector chuyển gen pCAMBIA ®· më b»ng enzim Hind III vµ Kpn I Vector tái tổ hợp đợc biến nạp vào Agrobacterium đợc chọn lọc khuẩn lạc xanh/trắng môi trờng LB đặc có 50mg/l kanamycin Các khuẩn lạc tiếp tục đợc sàng lọc PCR tách plasmid để cắt víi enzim giíi h¹n  BiĨu hiƯn gen PRSVN - Gen PRSVN đợc đa vào vector pRSETA đợc biến nạp vào chủng E.coli kết đợc kiểm tra băng cắt với enzim giới hạn - Dòng 1, nhận đợc băng ADN ~1,1 Kb, ~2,9 Kb Băng 1,1Kb gen PRSVN có kèm với Nos ter, băng 2,9Kb phần vector pRSETA dòng có băng ADN tơng ứng ~ 690bp 590 bp đợc cắt từ gen PRSVN Kết cắt với enzim nh trình tự gen qui định Nh cấu trúc pRSETA-PRSVN nhận đợc xác Plasmid pRSETA-PRSVN đợc biến nạp lại vào chủng E.coli BL21(DE3) ®Ĩ biĨu hiƯn gen PRSVN.Dßng M: Protein marker 200; 118; 78; 47.1; 31.4; 25.5; 13.8; 8.3 kD - Sau protein tổng số đợc cố định màng, lai với kháng thể phát nhuộm BCIP/NBT , băng protein ~40kD xuất dòng mà không thấy xuất dòng mẫu đối chứng âm Băng protein tơng ứng với băng protein CP PRSV Malaysia dòng Điều cho thấy protein qui định gen PRSVN PRSV Việt Nam đợc biểu Nh gen PRSVN đợc đa vào pCAMBIA2300 có khả dịch mã sang protein bình thờng 3.2.4 Kết luận 12 mẫu đu đủ bị nhiễm PRSV thu từ 12 địa phơng khác đợc tách ARN tỉng sè vµ sµng läc PRSV.Trong sè mÉu sµng läc, xác định đợc dòng PRSV Gen PRSVN (gen CP) đợc xác định trình tự so sánh với trình tự gen CP khác ngân hàng gen, mức độ giống từ 86,7% đến 96,8 % Trình tự đợc kiểm tra cắt với enzyme giới hạn Gen PRSVN đợc khẳng định nhân lên đoạn đặc hiệu cho gen CP PRSV mức độ biểu sản phẩm protein Gen PRSVN đợc đa vào vector chuyển gen pCAMBIA2300 đợc biến nạp vào chủng Agrobacterium LBA 4404 v chuyển gen  Để chuyển gen vào đu đủPhương pháp sử dụng Ti plasmid A.tumefaciens Ti plasmid Arhizogenes làm vectơ đưa ADN vào tế bào Ti plamid gồm hai thành phần: T- DNA vùng Vir - T- DNA chuyển từ Agrobacterium vào tế bào thực vật, nhờ mà gắn gen muốn chuyển vào T- DNA để đưa vào tế bào T- DNA chứa gen điều hoà sinh trưởng cục (auxin, cytokinie), gen tổng hợp chất Opine gen gây khối u Đoạn cuối có 25 cặp bazơ lặp lại, đoạn vùng xâm nhập vào phân tử ADN thực vật Trong plasmid vị trí TDNA giới hạn bờ trái bờ phải - Vùng Vir phụ trách khả lây nhiễm Chúng gồm nhóm từ VirA đến VirG VirE có tác dụng làm tăng tần số biến nạp  Để thiết kế vector dùng biến nạp: trước hết cắt gen điều hòa sinh trưởng cục bộ, sau gắn thêm gen thị (kháng thuốc chất diệt cỏ) với đoạn điều khiển phù hợp để chọn thể biến nạp cuối gắn gen cần biến nạp  Các plasmid Agrobacterium sử dụng công nghệ gen thực vật - gồm có loại: vector liên hợp vector nhị thể Vector liên hợp (Cointegrated vector): Vector liên hợp dựa tái tổ hợp plasmid Một vector liên hợp gồm có: vị trí để ghép gen quan tâm, thường vị trí có nguồn gốc từ plasmid vi khuẩn E.coli Gen thị kháng sinh giúp cho chọn lọc vi khuẩn E.coli, Agrobacterium gen chọn lọc hoạt động tế bào thực vật Như vector liên hợp hình thành từ plasmid mang trình tự ADN mong muốn plasmid có chứa vùng vir gen vùng bờ lặp lại T-ADN Sau tái tổ hợp, vector liên hợp tạo - dùng cho chuyển gen vào thực vật Vector nhị thể (Binary vector): Vector nhị thể hệ thống dùng plasmid riêng biệt: cung cấp T-ADN độc tính gây khối u, plasmid Ti plasmid có khả thâm nhập vào tế bào thực vật (mang gen vir) Plasmid thứ mang gen chọn lọc thực vật gen ghép vào gen thực vật Khi plasmid đưa vào chủng Agrobacterium có chứa Ti plasmid, sản phẩm mang gen vir đưa T-AND vào tế bào thực vật, T-ADN nằm phân tử ADN khác  Sử dụng Agrobacterium để chuyển gen thu nhiều kết quả, đặc  Ưu điểm: - Gen bị đào thải - Số lượng Do tránh tượng ức chế lẫn câm - lặng lẫn Tồn bền vững thể thực vật phụ thuộc chặt chẽ vào hệ thống protein Vir, phương pháp khác gen mục tiêu tái tổ hợp chuyên biệt nhờ hai trình tự IS hai đầu dễ dàng bị tách sau  Nhược điểm: - Có phổ công giới hạn - Gây khối u cho khỏa tự hai mầm lại không gây khối u cho mầm (do mầm thuộc nhóm tiến hố nhất, tích lũy nhiều chế kháng bệnh hai mầm bị thương tế bào có xu hướng hóa gỗ khơng phân chia mạnh để tái tạo tiếp hợp chất phenol hai mầm ) TÀI LIỆU THAM KHẢO http://doc.edu.vn/tai-lieu/luan-van-xac-dinh-gioi-tinh-cay-du-du-caricapapaya-l-bang-ky-thuat-pcr-voi-cac-cap-primer-duoc-thiet-ke-dua-vao-vung-10286 http://www.2lua.vn/article/benh-dom-vong-du-du-va-cach-phong-tri-1 http://www.khoahocchonhanong.com.vn/CSDLKHCN/modules.php? name=News&op=viewst&sid=457 http://trongraulamvuon.com/kinh-nghiem-lam-vuon/sau-benh-tren-cay-dudu/ http://ddphuongvi.blogspot.com/2013_06_01_archive.html Nguyễn Thị Nhẫn (2004) Nghiên cứu quy trình nhân nhanh in vitro đu đủ (Carica papaya L.) Tạp chí KHKT Nơng Nghiệp, 2(3): 174-175 Y.K Chan, H.K Lee and I Rusna Irradiation-induced variations in M2 populations of Eksotika papaya J Trop Agric and Fd Sc 35(1)(2007): 49– 57 Dr Roderick A Drew Christopher O'Brien Development of PRSV-P resistant papaya genotypes by introgression of genes from wild Carica species ... 2002) 1.6 Các giống đu đủ trồng Việt nam: Ở Việt nam ba giống đu đủ địa phương truyền thống đu đủ thịt đỏ, đu đủ thịt vàng đu đủ thịt vàng cam nhiều giống đu đủ nhập nội từ nước từ Viện Cây ăn nhiệt... thành loại nước giải khát sinh tố đu đủ, nước giải khát có gas từ đu đủ, kem đu đủ, mứt đu đủ Một số ý sử dụng đu đủ làm thức ăn:  Không nên ăn hạt đu đủ hạt đu đủ có chứa chất độc gọi carpaine... Ưu điểm giống đu đủ nội địa dễ gieo ươm từ hạt, hạt tự mọc bứng đem trồng Các giống đu đủ nội địa khơng thích nghi thâm canh diện tích lớn  Các giống đu đủ nhập nội: Đu đủ có nhiều loại giống