Qì ■’' ĩằế SE - ! ■ ■ , , - ỉ' :đ ìỉọ c 0.1Jồr: iA: yj' ; J, ■ • ** - 'v *• Li.- V i v ■ ỉ' '"'"■'.'ỉ' o i ! ; V a~ ■■■ ■ ■ỉ > ■■ ' ' •-ú V ịjt - 4-4’i- C \ ? i U ; ’: * u •' >/ Ộ I V , k i?iĩ ■ ầ 'i : : V ■ : ;■ ■ ■- - ỉìv-i- * " • - , - ■ ' Ạ ■ t • 'Ị-'- -1' - ? *tì ’ị • - -tẹ ịmì':: ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI OHOGHN BÁO CÁO TỔNG KÉT KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐÈ TÀI KH&CN CAP ĐẠI HỌC QUÓC GIA-2014 Tên nhiệm vụ: Bảo tồn lưu giữ nguồn gen Vi sinh vật Mã số đề tài: Chủ trì nhiệm vụ: PGS TS Dương Văn Họp I ĐA! HỌC QUỐC GIA HÀ N Ơ TRUNG TẦM í HỊNG ÍÌN THƯ V IỆN \_ W Q Ế £ W Q A Q £ — Hà Nội, 2015 PHẦN I THÔNG TIN CHUNG 1.1 Tên nhiệm vụ: Bảo tồn lư u g iữ nguồn gert Vì sinh vật 1.2 Mã số: 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài TT Chức danh, hoc vi, ho tên Đơn vị cơng tác Vai trò thưc hiên đề tài • • PGS TS Dương V ăn Hợp Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật (VTCC) Chủ trì TS Đào Thị Lương VTCC Thư ký TS Nguyễn Kim N ữ Thảo VTCC Thành viên TS Trịnh Thành Trung VTCC Thành viên TS Lê Thị Hoàng Yến VTCC Thành viên ThS Trần Thị Lệ Q uyên VTCC Thành viên ThS Trịnh Thị Vân A nh VTCC Thành viên CN Nguyễn Thị Kim Quy VTCC Thành viên CN Nguyễn Thị Anh Đào VTCC Thành viên 10 CN Hà Thị Hằng VTCC Thành viên 11 KS Nguyễn M ạnh H ùng VTCC Thành viên 12 CN Bùi Nguyễn Hải Linh VTCC Thành viên 13 CN N guyễn Thị Vân VTCC Thành viên 14 TS Nguyễn Thị Hồi Hà C hủ trì nhánh 15 ThS Phạm Thị Bích Đào Phòng Sinh học TảoViện V SV&CNSH 16 TS Đinh Thúy Hằng C hủ trì nhánh 17 ThS Nguyễn Thị Hải Phòng Sinh thái V i sinh vật- VSV&CNSH Thành viên Thành viên 1.4 Đon vị chủ trì: Viện V i sinh vật Cơng nghệ Sinh học 1.5 Thòi gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng năm 2014 đến tháng 05 năm 2015 1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến tháng .năm 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng năm 2014 đến tháng 05 năm 2015 1.6 Những thay đổi so v ó i thuyết minh ban đầu (nếu có): K hông (về mục tiêu, nội dung, phư ng pháp, kết nghiên cứu tổ chức thực hiện; Nguyên nhân; Ỷ kiến cùa Cơ quan quản lý) 1.7 Tồng kinh phí phê duyệt đề tài: 1340 triệu đồng PHÀN II TÒNG QUAN KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u Đặt vấn đề Việt Nam xếp hạng thứ 16 giới đa dạng tài nguyên sinh vật 10 trung tâm đa dạng phong phú giới, Liên hiệp quốc đánh giá cao việc thực mục tiêu thiên niên kỷ (xóa đói giảm nghèo, thích nghi với biến đổi khí hậu) nhờ thành cơng lĩnh vực nông nghiệp, lương thực Tuy nhiên đa dạng tài nguyên bị đe dọa nghiêm ưọng thiên tai, việc khai thác bừa bãi thiếu ý thức người, thói quen canh tác lạc hậu, gia tăng dân số kèm theo q trình thị hóa diễn mạnh mẽ khắp vùng nước, đặc biệt biến đổi khí hậu, nước biển dâng mà Việt Nam ừong quốc gia giới bị ảnh hưởng nghiêm ừọng Phát triển công nghệ sinh học công nghiệp sinh học hướng Đảng Nhà nước ưu tiên ừong chiến lược phát triển khoa học công nghệ quốc gia Trong chiến lược phát triển công nghệ sinh học quốc gia, cơng tác CỊUẩn lý nguồn gen có chất lượng chiếm vị trí đặc biệt quan trọng, nguồn gen vừa vật liệu khởi đầu vừa đổi tượng cho nghiên cứu khoa học sống nói chung cơng nghệ sinh học nói riêng Vì bảo tồn làm giàu nguồn gen vi sinh vật khâu then chốt cho phát triển công nghệ sinh học quốc gia ừên giới Đe thực chiến lược phát triển công nghệ sinh học, Bộ Khoa học Công nghệ (1997) xây dựng chương trinh quản lý nguồn gen quổc gia bao gồm đối tượng: thực vật, động vật, thuốc vi sinh vật Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật (VTCC) đơn vị đầu nước quản lý nguồa gen vi sinh vật quốc gia xét chất lượng số lượng Để nâng cao chất lượng quản lý nguồn gen bước tiếp cận trình độ qc tế, hàng năm VTCC giao nhiệm vụ kinh phí tương ứng đê thực nhiệm vụ, bảo tôn, đánh giá định danh, xây dựng sở liệu nguồn gen vi sinh vật theo thị 10 CP quản lý nguồn gen quốc gia Mục tiêu - Thu thập, làm giàu đánh giá mức độ đa dạng nguồn gen sở phân lập chủng vi sinh vật vùng sinh thái đặc hữu Việt Nam, nhằm tìm kiếm đại diện khác có giá trị khoa học (các taxa mới) giá trị ứng dụng (có enzyme, chất kháng sinh, có đặc tính quý, chịu nhiệt độ cao, pH ) - Đưa đaợc kết đánh giá giải pháp nâng cao chất lượng công tác bảo quản nguồn gen vi sinh vật theo phương pháp khác tỷ lệ sống mức độ tạp nhiễm - Nâng cao chất lượng tư liệu hóa nguồn gen bảo quản để đưa vào catalogue tiếp cận chuẩn quốc te - Đánh giá ban đầu số nguồn gen làm tiền đề cho khai thác nguồn gen có giá trị Phưong pháp nghiên cứu - N ghiên cứu phân lập chủng vi sinh vật từ vùng sinh thái đặc hữu: Phân lập vi khuẩn theo phương pháp pha loãng sừ dụng cho vi khuẩn (Trung cộng sự, 2011) Phân lập xạ khuẩn sử dụng phương pháp pha loãng RC Phân lập nấm men theo Landell cộng (2006) Phân lập nấm sợi theo phưcmg pháp Crous cộng (2009) - Đánh giá nguồn gen: + N uôi cấy vi sinh vật ưên môi trường chuẩn đặc hiệu khác nhau: NaST21Cx, humic acid vitamin agax-HVA (Hayakawa & Nonomura^ 1987); LB, MRS, NA, ORI, PSA, Fred Waksman, Horikoshi-I, A shby (Dũng cộng sự, 2012); CMA, LCA, PDA, M E A , thạch- khoai tây- cà rốt, YM (Kurtzman cộng sự, 2011), YS, YG, CKS (Shirling & Gottlieb, 1966) + Quan sát hình thái khuẩn lạc, nhuộm tế bào, soi tế bào, bào tử mô tả cấu trúc hiển vi theo phương pháp khác nhau: Nấm men (Kurtzman cộng sự, 2011); nấm sợi (Seifert cộng sự, 2011); vi khuẩn (Garrity, 2005); xạ khuẩn (Shirling & Gottlieb, 1966) + Giải trình tự xác định vị trí phân loại phát sinh dựa vào đoạn gen có ý nghĩa cho phân loại (rDNA 16S, gen chức cho vi khuẩn, xạ khuẩn; rDNA vùng ITS, 28S cho nâm men, nấm sợi rDNA đoạnl8S cho vi tảo ) theo phương pháp Rooney cộng (2009), Kieser cộng (2000), Fawleys cs., (2004), Kurtzman and Robnnet (1998), White cộng (1990) So sánh xử lý số liệu dùng chương trình máy tính CLƯSTAL X Thompson cộng (1997) phần mềm M EGA Các trinh tự tham khảo lấy từ liệu GenBank công cụ Eztaxon-e Cây phát sinh chủng loại xây dựng theo Kimura (1980), sử dụng phương pháp Saitou vấ Nei (1987); phân tích bootstrap thực từ 1000 lân lặp lại ngâu nhiên + Nghiên cứu đa dạng xạ khuẩn biển dựa vào kỹ thuật điện di biến tính (Myers cs, 1985) + Xác định hoạt tính sinh học: enzyme, kháng vi sinh vật theo phương pháp Crous cộng (2009), Dũng cộng (2012), Kurtzman cộng (2011) - Bảo quản vi sinh vật: Các nhóm vi sinh vật bảo quản theo phương pháp chuẩn quốc tế tài liệu thực Nhật Bản, H àn Quốc, Tháĩ Lan, (Thạch nghiêng, lạnh sâu, đông khô ni tơ lỏng) theo phương pháp K um ar cộng (2013) - Tư liệu hóa nguồn gen: Phần mềm lưu giữ sở liệu: M icrosoít Access 2010 phần mềm thiết kế website: Joomla, phiên 1.0.12 Tổng kết kết nghiên cứu 4.1 Điều tra khảo sát thu thập nguồn gen vi sinh vật 4.1.1 Đ a dạng nấm men Côn Đảo- Bà Rịa Vũng tàu Từ 38 mẫu tươi, hoa, quả, rụng đất thu thập đảo Côn Đảo, phân lập 54 chủng nấm men s ố lượng chủng nấm men phân lập nhiều mẫu tươi thấp mẫu đất Phân loại 54 chủng nấm men dựa vào hình thái khuẩn lạc, tế bào phân tích trình tự rDNA 26S đoạn D1/D2, chúng thuộc 13 chi, 28 lồi, có 15 chủng nghi ngờ thuộc 13 lồi mói Có 39 chủng nấm túi thuộc chi với 11 loài biết (8 chi) loài thuộc chi Nấm đảm có 15 chủng thuộc chi, 13 lồi (4 lồi biết thuộc chi loài thuộc chi) Trong chi Candida chiếm số lượng chủng phân lập nhiều (26 chủng) Candida rugosa chiếm nửa số lượng chủng tìm thấy chi này, Cryptococcus, đa dạng số loài có số lượng lồi nghi ngờ cao (7 loài/8 chủng) chi Đa dạng phân bố nấm men khác loại mẫu thu thập Kết m inh chứng thêm cho đa dạng sinh học Việt Nam tiềm phát lồi cơng bố cho quốc tế 4.1.2 Nghiên cứu đa dạng nấm sợi Vườn Quốc gia Ba Bể Từ 273 chủng n ấm phân lập từ 17 m ẫu rụng vườn Q uốc gia B a Bể, dựa vào quan sát h ình thái khuẩn lạc quan sinh bào tử củ a chúng, chúng tô i loại bỏ chủng có h ình thái hồn to n giống có m ộ t m ẫu phân lập K ết lựa chọn 62 chủng nâm để tiế n hành p hân tích trìn h tự 28S đoạn D 1D để nghiên cứu đa dạng vi nấm tôn lớp rụng vư n quốc gia Ba B e K et cho th chúng thuộc lớp, bộ, họ, 21 chi 35 loài T rong số 21 chi 14 chi đơn lồi, chi đa lồi Chi Trichoderm a chi có số lư ợ ng loài cao n h ấ t, gồm loài T rong đó, chi Fusarium có lồi nh n g lại chi có số đ a dạng sinh học cao nhất, H ’Fusarium=0 ,582, H T richoderm a~ 0,499 Trong số 21 chi nấm phát V ườn Quốc gia B a Bể có tới chi lần ph át V iệt N am Hai số ch i m ô tả chi tiế t m ặt hình thái xây dựng chủng loại phát sinh, chúng th u ộ c lớp S o rd ario m y cetes Pezizom ycetes Trong số 35 loài nấm phân lập từ v n quốc gia Ba Bể lồi F usarium so la n i có tần suất xuất cao nh ất (47,2% ), tiếp đến F usarium e q u ise ti (41,3% ), đến loài A sp erg illu s o ryza e (29,4% ), A sp e rg ìllu s ja p o n ic u s v R a d ia tisp o y u n n a e n sis (23,5% ) lồi lại có tần suất b gặp < 20% 4.1.3 Nghiên cứu đa dạng vi khuản từ thực phẩm lên men tỉnh ph ía bắc Việt Nam (Đa dạng thành phần vi khuẩn ỉactic lạp sườn) Lạp sườn lên men loại thực phẩm lên men truyền thống từ thịt lợn đồng bào dần tộc thiểu số vùng Tây Bắc M ặc dù lạp sườn bắt đầu thương mại hóa thành sản phẩm bán cửa hàng siêu thị nghiên cứu thành phần vi sinh vật lạp sườn bị bỏ ngỏ Trong nghiên cửu này, tiến hành đánh giá đa dạng vi khuẩn lactic mẫu lạp sườn lấy tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn Sơn La Bằng kỹ thuật giải trình tự đoạn 16S rDNA, 63 chủng vi khuẩn lactic phân lập ưên môi trường MRS phân loại vào 13 loài thuộc chi 13 loài thuộc chi Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, ĨVeisselỉa (Bảng 2) Trong số đó, 39 (61,9%) chủng phân loại vào loài thuộc chi Lactobacillus L brevis, L curvatus, L pentosus, L plantarvm subsp plantarum L sakei subsp sakei; (14,2%) chủng phân loại vào loài Lactococcus L garvieae L lactỉs subsp lactis\ (12,7%) chủng phân loại vào loài ÌVeisselỉa w heỉlenica w viridescens; (6,3%) chủng phân loại vào loài Enterococcus E /aecỉum E hermanniensis; (3,1%) chủng phân loại vào loài Pediococcus p pentosaceus chủng phân loại vào chi Leuconostoc loài L citreum Phân tích tần xuất bắt gặp chủng nem chua cho thấy L sak subsp sakei có mặt sản phẩm lạp sườn (tần xuất 77%) có m ặt lạp sườn tỉnh Mặc dù w vỉridescens có mặt ừong sản phẩm lạp sườn (tần xuất 22,2%) lại sản phẩm khơng có L sakei subsp sakei Bên cạnh vi khuẩn lacíic, vi khuẩn hiếu khí dị dưỡng có mặt ừong nem chua đạt nồng độ 106 CFU/g Một số lồi vi khuẩn có nguy gây bệnh đường ruột cho người Citrobacter ýreundiỉ, Escherichia colỉ, Shigeỉỉa /lexn eri phát lạp sườn Trình tự gene chủng LM 0708 LM 0709 giống tương đông cao với L brevỉs ATCC 14869 (98,03%), L spicheri LTH 5753T (98,03%), L acỉdifarinae LMG 22200 (97,87%), L zymae LM G 22198 (97,67%), L namurensis LMG 23584T (97,53%), L hammesii TM W 1.1236 (97,53%), L senmaizukei L13 (97,34%) L parabrevịs LMG 11984 (96,77%) Do tính tương đồng ừình tự đoạn 16S rD N A so với loài biết thấp nên chủng LM 0708 LM 0709 nghi ngờ lồi Nghiên cứu cơng bố Quốc tế loài vi khuẩn này, giảm trừ vi sinh vật tạp nhiễm có nem chua tìm hiểu vai ừò lồi vi khuẩn lactic ừong hình thành chất lượng hương, vị cấu trúc lạp sườn cần làm rõ tương lai 4.1.4 Nghiên cứu ãa dạng xạ khuẩn từ vùng sinh thái (Đánh giá tỉnh đa dạng \à hoạt tính sinh học xạ khuẩn rừng ngập mặn Xuân Thủy- Nam Định) Xạ khuẩn nhóm vi sinh vật sản sinh nhiều chất ứao đổi thứ cấp có hoạt tính sinh học dùng nhiều ngành công nghiệp X khuẩn biển nguồn tìm kiếm thuốc giá trị, nhiên xạ khuẩn biển chưa nghiên cứu nhiều Vì thế, chúng tơi tiến hành nghiên cứu độ đa dạng hoạt tính sinh học xạ khuẩn rừng ngập m ặn Xuân Thủy, m ột ừong rừng ngập m ặn lớn phía Bắc Việt Nam Kết nghiên cứu kết hợp phương pháp nuôi cấy không nuôi cấy cho thấy đa dạng xạ khuẩn rừng ngập mặn Trong phương pháp nuôi cấy, phương pháp phân lập khác sử dụng Tổng số 92 chủng xạ khuẩn phân lập, thuộc chi: Streptomyces (70 chủng), M icrom onospora (20 chủng), Actinomadura (2 chủng) Đặc biệt, chủng (X TÌ3-A -04, X T13-A -11, XT13-A-12) có khả lồi có mức độ tương đồng rADN 16S 98% với loài biết M ặt khác, kết DGGE phương pháp không nuôi cấy cho thấy tồn chi xạ khuẩn khác, bao gồm Saccharopolyspora, Actinoplanes, Norcardioides, Janibacter Friedmanniella Đồng thời, kêt đánh giá khả sinh enzyme (amylase, cellulase, chitinase, proteinase) khả kháng vi sinh vật kiểm định (E coỉi, s aureus, s cerevisiae, F oxysporum) chủng xạ khuẩn phân lập từ rừng ngập mặn Xuân Thủy cho thấy nguồn tìm kiếm hoạt chất sinh học đáng quan tâm 4.1.5 Sổ lượng vi sinh vật bồ sung vào VTCC năm 2014 Tổng số chủng vi sinh vật bổ sung vào VTCC năm 2014 253 chủng bao gồm 75 chủng vi khuẩn phân lập từ lạp sườn Cao Bằng, Lạng Sơn, Mộc Châu; 78 chủng nấm men phân lập từ đất, tươi, hoa, rụng từ đảo Côn Đảo đảo Phú Quốc, 100 chủng nấm sợi phân lập từ mẫu đất, nước, rong rêu, rụng tươi thu thập từ vùng biển từ Thanh Hóa đến Cà Mau 4.2 Đánh giá nguồn gen vi sinh vật 2.1 Đánh giả nguồn gen v s v Bảo tàng giống v s v (VTCC) Ở VTCC, việc tư liệu hoá với thône tin quan ừọng liên quan đến nguồn gen bảo quản theo chuẩn Quốc tế tiến hành hàng năm Các thơng tin tư liệu hố giúp người sử đụng có thơng tin cần thiết chủng vi sinh vật với mục đích ni cấy, bảo quản, khai thác M ặt khác trao đổi cịuỐc tế, thơng tin tư liệu hố theo chuẩn Quốc tế yêu cầu bát buộc cho trao đổi hợp tác Quốc tế Trong năm 2014, VTCC tiến hành tư liệu hoá để đưa vào cataloge với 300 chủng v s v bao gồm 75 chủng xạ khuẩn, 75 chủng vi khuẩn, 75 chủng nấm sợi 75 chủng nấm men Việc định danh chủng nghiên cứu thực dựa vào kết hợp phương pháp phân loại truyên thông phương pháp sinh học phân tử cụ thê như: N ghiên cứu đặc điêm sinh học, phân loại băng hình thái đặc tính sinh lý sinh hố cho phép xác định đên tên chi N ghiên cứu sâu mức độ phân tà chủng vi sinh vật bàng phương pháp sinh học phân tử (giải trình tự rDNA: 16S, 28S) giúp cho khả phân loại đến loài VTCC sử dụng phương pháp hoá sinh vi sinh để xác định đặc tính quí chùng như: K sinh enzym, tích luỹ sinh khối, lên men, sinh chất kháng sinh Các chủng nghiên cứu điều kiện ni cay để lựa chọn mơi trường, pH, nhiệt độ, hiếu khí, kị khí 4.2.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn kỵ khỉ thuộc nhóm khử sul/ate khử sắt đưa vào cataỉogue VTCC Đặc điểm sinh lý ba chủng vi khuẩn SR2, SR3 R-HL6 nghiên cứu so sánh với lồi có độ tương đồng cao trình tự gen 16S rD N A cơng bố Tên khoa học mã số trinh tự gen 16S rDNA chủng GenBank tương ứng là: Desuỉ/om icrobium sp SR2 (KP059285), Desuỉ/obulbus sp SR3 (KP059286) Geobacter sp R-HL6 (KP059287) 4.2.3 Phăn loại 10 vi tảo biển dị dưỡng họ Thraustochytrìds phân lập từ rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam Định Từ bốn vị trí thu mẫu rừng ngập m ặn Xuân Thủy, N am Định, phân lập, tuyển chọn lưu giữ mười chủng VTBDD có ký hiệu PT269, PT270, PT273, PT274, PT279, PT284, PT285, PT287, PT81, PT84 thuộc bốn chi Aurantiochytrium, Schizochytrium, Aplanochytrium Thraustochytrium họ Thraustochytrids Sau 24 giờ, khuẩn lạc chủng VTBDD PT269, PT284, PT285 phát triển lan rộng khơng đồng lệch m ột phía, đến 72 khuẩn lạc tạo lớp bề mặt, lớp trung tâm nâng lên, hình thành viền gợn sóng Khuẩn lạc bốn VTBDD PT274, PT279, PT81 PT84 hình tròn, kích thước khơng thay đơi q lớn 72 nghiên cứu, khơng có viên Vê màu săc, từ 24- 72 chủng VTBDD PT81 PT84 chuyển từ trắng sang vàng nâu Trong PT269, PT273 màu trắng ngà VTBDD PT270; PT284 có màu kem Đặc biệt, chủng VTBDD PT274 không thay đổi màu sắc Sau 72 không thấy thay đổi hình dạng màu sắc khuẩn lạc Mười chủng VTBDD vói hình dạng tế bào khác tạo thành bốn nhóm khác biệt Nhóm thứ bạo gồm chủng VTBDD PT269, PT279, PT284, PT287 sinh sản theo phương thức phận đôi liên tiếp tế bào phát triển biến đổi thành dạng amip Nhóm thứ hai chủng VTBDD PT274 sinh sản theo hai phương thức thông qua phát tán động bào tử hai doi giữ lại m ột phần tế bào (tế bào sinh dưỡng) sinh sản theo cách phân đôi liên tiếp Nhóm thứ ba bao gồm hai chủng VTBDD PT273, PT285 tế bào chúng không trải qua phân đơi liên tiếp mà trực tiếp hình thành túi bào tử, bào tử phân cắt ứong tế bào mẹ phát triển thành động bào tử đơn Nhóm thứ tư gồm chủng VTBDD PT270, PT81, PT84 sinh sản theo phương thức phân đôi liên tiếp, phát triển thành động bào tử đơn Chủng PT269, PT279, PT285, PT287 PT81 hình thành lưới ngoại chất Dựa đặc điểm hình thái phân tích giải trình tự 18S rDNA xác định chủng VTBDD PT269, PT279, PT284, PT287 thuộc chi Aurantiochytrium (tương đồng 99% với Aurantiochytrium sp JF266572) Chủng VTBDD PT270, PT81 PT84 thuộc chi Schìiochytrium (tương đồng 99% với Schizochytrỉum sp DQ525180) Còn chùng VTBDD PT274 thuộc chi Apỉanochyừium (tương đồng 99% với Aplanochytrium sp AF348521) Hai chủng VTBDD PT273 PT285 lại thuộc chi Thraustochytrmm (tương đồng 100% với Thraustochyừium sp BP3 DQ834732) 4.2.4 Nghiên cứu hoạt chắt sinh học dịch ni xạ khuẩn phân lập Việt Nam có khả khảng Xanthomonas oryzae pv oryzae Chủng Streptomyces toxytricini VTCC-A-2776 sàng lọc từ 2690 chủng xạ khuẩn lưu giữ VTCC, có khả kháng 10 nòi Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lúa Việt Nam Kết nghiên cứu cho thấy chủng Streptomyces toxyữicini VTCC-A-2776 cho lượng chất kháng Xoo cao sau ngày nuôi cấy lắc 28°c Hai chất (chất chất 2) có độ tinh cao hoạt tính kháng Xoo mạnh từ chủng tách dung môi ethylacetate, tinh Sep-pak C18 (lOg) HPLC Kết phân tích khối phổ cho thấy hai chất xác định ừọng lượng phân tử 778.3 dẫn xuất chất kháng sinh factumycin Trong đó, chất có nồng độ ức chế tối thiểu Xoo thấp chất Hai hoạt chất xác định bền với nhiệt độ bảo quản lâu dài, tạo ưu cho việc ứng dụng vào thực tiễn Trong thí nghiệm tiếp theo, cấu trúc hóa học hai chất cần xác định xác phương pháp phân tích hóa học khác 13C- NMR, 'H-NMR 4.3 Bảo quản vi sinh vật 4.3.1 Bảo quản vi sinh vật VTCC Công tác bảo quản chủng vi sinh vật đóng vai ừò quan trọng ừong việc giữ vi sinh vật sống sót cao, khơng bị tạp nhiễm đặc tính di truyền hoạt tính sinh học khơng bị thay đổi Vì vậy, cơng tác bảo quản vi sinh vật cần thực bời cán chuyên sâu, đào tạo Trên giới, công tác bảo quản vi sinh vật quy mô lớn thực trung tâm nguồn gen quốc gia Các phương pháp bảo quản sử dụng phổ biến kể đến bao gồm: phương pháp cấy truyên, phương pháp đông khô giữ nhiệt độ thâp Tuy nhiên, thực tê khơng có phương pháp bảo quản vạn dùng chung cho nhóm vi sinh vật mà nhóm vi sinh vật chi thích hợp với vài phương pháp bảo quản định VTCC bảo quản vi sinh vật theo tiêu chuẩn quốc tế giữ lạnh sâu (~80°C), giữ nitơ lỏng(-196°C) bảo quản đông khô s ố lượng chủng bảo quản tăng lên hàng năm Bảo tàng lưu giữ bảo quản 9482 chủng phương pháp giữ ừong lạnh sâu (-80°C), 2079 chủng vi khuẩn, 3.250 chủng xạ khuẩn, 1.403 chủng nẩm men 2.750 chủng nẩm sợi số lượng chủng đưa vào catalogue Online bảo quản bàng phương pháp giữ lạnh sâu (-80°C), nitơ lỏng (-196°C), đông khô 3400 chủng: 960 chùng nấm men (189 loài, 56 chi), 1024 chủng nấm sợi (203 loài, 48 chi), 667 chủng xạ khuẩn (332 loài, 39 chi) 749 chủng vi khuẩn (162 loài, 49 chi) 4.3.2 Xây dicng phương phá p bảo quản vi khuẩn kỵ khí mao quản điều kiện lạnh sâu Ba chủng vi khuẩn kỵ khí thuộc nhóm khử sulíate (SR2, SR3) khử Fe (R-HL6) bảo quản điều kiện kỵ khí ° c ống mao quản thủy tinh lạnh sâu (-20°C ); có mã số catalogue VTCC tương ứng là: VTCC-B2080 Desul/omicrobium sp SR2; VTCC-B2081 Desuựobulbus sp SR3; VTCC-B2082 Geobacter sp R-HL6 Lưu giữ bảo quản 25 chủng kỵ khí thuộc nhóm có đặc điểm sinh lý khác điều kiện thích hợp phòng thí nghiệm 4 Kiểm tra đánh giá chất lượng nguồn gen catalogue bảo quản theo phư ơng pháp khác Đối với công tác bảo quản giống, yếu tố quan trọng cần bảo đảm khả sống sót, khơng nhiễm, với định danh giữ hoạt tính chủng ban đầu Với điều kiện Việt Nam, công tác bảo quản giống ln gặp nhiều khó khăn khí hậu nóng ẩm, điều kiện sở vật chất, nguồn điện, Chính vậy, chúng tơi thực nghiên cứu kiểm tra đánh giá chất lượng định kỳ chủng bảo quản theo tiêu chí năm thời gian bảo quản, đa dạng loài lựa chọn số chủng đưa vào catalogue Online bảo quản VTCC Nghiên cứu thực nhăm đánh giá chât lượng bảo quản chủng giống VTC.C điều kiện Việt Nam, rút kinh nghiệm kịp thời cải tiến, lựa chọn phương pháp thích hợp cho loại v s v để đảm bảo việc bảo quản an toàn nguồn gen Trong tổng số 3100 chủng vi sinh vật đưa vào catalogue Online từ năm 2013, chọn 400 chủng (100 chủng nấm men, 100 chủng nấm sợi, 100 chủng vi khuẩn 100 chủng xạ khuân) bảo quản từ năm 2006 để kiểm tra, đánh giá kết bảo quản bàng phương pháp khác (giữ -80°c, nitơ lỏng, đông khô) K êt cho thây bảo quản băng phương pháp đơng khơ có hiệu cao (89%), sau đến phương pháp bảo quản ni tơ lỏng (-196°C) 87% phương pháp lạnh sâu (-80°C) 86% Do vậy, cần phải nghiên cứu thêm phương pháp bảo quản ừong ni tơ lỏng đông khô bảo quản vi sinh vật công đoạn thực hiện, chất lượng ống, m ôi trường để chủng bảo quản tốt ừong điều kiện V iệt Nam Các kết cho thấy muốn bảo quản vi sinh vật an toàn cần phải có nhiều phương pháp bảo quản đồng thời 4.5 Xây dựng s liệu nguồn gen VTCC Tổng số chủng vi sinh vật bảo quản VTCC, quản lý ừên máy tính sử dụng phần mềm ACCESS 9482 chửng, có 2079 chủng vi khuẩn, 3250 chủng xạ khuẩn, 2750 chủng nấm sợi 1403 chủng nấm men Trên sở liệu có, catalogue giống Bảo tàng với 3400 chủng (749 chủng vi khuẩn, 667 chủng xạ khuẩn, 1024 chủng nấm sợi 960 chủng nấm m en) xây dựng đưới hình thức catalogue điện tử nhằm cung cấp thông tin nguồn gen vi sinh vật tới địa chi quan tâm nước Các chủng đưa vào catalogue thu gọn ừong khuôn khổ chủng nghiên cứu sâu Thông tin chi tiết trang website: http://w w w Ámbt vnu edu vn/vtcc// 4.6 H oat đơng khác tai VTCC • • ỡ • Bảo tàng giống chuẩn v s v trì thực hợp tác nghiên cứu vi sinh vật với quan nghiên cứu nước Các nội dung họp tác bao gồm cung cấp chủng vi sinh vật, định danh vi sinh vật thơng qua phân tích trình tự gen m ã hóa cho RN Ar nơi lưu giữ chủng giống số bảo tàng nước 4.6.1 Cung cấp chủng giống cho quan nước VTCC nơi cung cấp chủng vi sinh vật có chất lượng cao cho tổ chức cá nhân sử dụng nơi lưu giữ chủng có giá trị vốn sản phẩm từ hoạt động nghiên cứu khoa học nước Trong năm 2014, có 23 đom vị nước từ công ty, trường đại học, trung tâm viện sử dụng 53 chủng Bảo tàng dùng cho mục đích như: chủng nghiên cứu, chủng giảng dạy, chủng kiểm định chủng sản xuất 4.6.2 Định danh vi sinh vật cho quan, sở sản xuất nước VTCC có đội ngũ cán nghiên cứu đào tạo phân loại vi sinh vật nước tiên tiến có bảo tàng tiếng Nhật Bản, Mỹ, Đức, Hà Lan V TC C nơi quan nghiên cứu tin tưởng gừi mẫu định danh Năm 2014, có đơn vị nước gửi 23 chủng vi sinh vật đến định danh Bảo tàng, gồm nhóm nấm men, nấm sợi, vi khuẩn xạ khuẩn 4.6.3 Trao đổi chủng chuẩn bào quản chủng nước ngồi VTCC nơi có đủ điều kiện sờ vật chất ứình độ chun mơn để lưu giữ chủng giống vi sinh vật VTCC thành viên Liên đồn Bảo tàng vi sinh vật Quốc tế (WFCC), tiến hành trao đổi chủng chuẩn với trung tâm nguồn gen Quốc tế địa chi tin cậy cho việc lưu giữ nguồn gen cho tổ chức, cá nhân yêu cầu Hiện nay, VTCC bảo quản 61 chủng vi sinh vật trao đổi từ bảo tàng Nhật Bản 4.6.4 Lưu giữ chủng quan ữong nước VTCC nơi quan nước tin tưởng gửi chủng vi sinh vật đến để bảo quản - Lưu giữ 393 chủng nấm sợi Công ty c ổ phần giám định khử trùng FCC - Lưu giữ 100 chủng nấm sợi Viện 69- Bộ Tư lệnh Lăng Hồ Chủ tịch 4.7 Các cơng trình công bố đào tạo - Công bổ: ừên tạp chí khoa học nước ngồi, báo tạp chí khoa học nước, hội nghị quốc tế, hội nghị ừong nước - Đào tạo: Tham gia đào tạo Trường Đại học Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN tiến sĩ, thạc sĩ cử nhân - Thực tập nước ngồi:Thơng qua dự án hợp tác với viện Công nghệ Thẩm định Quốc gia Nhật Bản, VTCC cừ cán thực tập phương pháp đại ừong nghiên cứu phân loại vi sinh vật Đánh giả kết đạt kết luận 5.1 Đánh giá kết nghiên cứu đạt - Tỉnh giả trị khoa học + Kế thừa chọn lọc kỹ thuật nhất, nghiên cứu tập trung vào đối tượng có ý nghĩa khoa học (đa dạng thành phần loài) đặc hữu cùa Việt Nam (các khu vực sinh thái khác nhau) + Phát cơng bố chủng, lồi cho khoa học cho Việt Nam - Giá trị thực tiễn khả ứng dụng + Cung cấp chửng chuẩn, chủng nghiên cứu, chủng tham chiếu, chủng kiểm định cho hoạt động công nghệ sinh học liên quan đến vi sinh vật + Cung cấp chủng sản xuất nghiên cứu cho nghiên cứu, triển khai ứng dụng liên quan đến vi sinh vật P H À N V I T À I L IỆ U T H A M K H Ả O TIẾNG VIỆT Đào Thị Lương, Trần Thị Lệ Quyên, Dương Văn Hợp (2008) Nghiên cứu đa dạng sinh học nấm men phân lập từ vùng ô nhiễm dioxin sân bay quân Đà Nằng Tạp chí Di truyền ứ n g dụng Chuyên san Công nghệ Sinh học, 4: 1-8 Đỗ Mạnh Hào, Phạm Thế Thư (2010), "Một số kết nghiên cứu vi sinh vật vùng ven biển Hải Phòng", Tạp chí Khoa học Công nghệ biển, (2), pp.51-65 Nguyễn Thị Hoài Hà cộng sự, Phân lập, sàng lọc vi tảo biển dị dưỡng họ Thraustochytrid giàu hợp chất sinh học rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam Định, báo cáo quỹ gen 20132014 Nguyễn Thị Thu Thủy (2010), “Nghiên cứu đặc điểm sinh học vi tào Ankistrodesmus phân lập từ rừng ngập mặn Xuân Thuỳ, Nam Định thăm dò khả kháng tế bào ung thư biểu mơ”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Trần Thị Lệ Quyên, Đào Thị Lương, Hà Thị Hằng, Dương Văn Hợp (2011) Nghiên cứu đa dạng nấm men phân lập Vườn Quốc gia Cát Tiên núi Langbiang, tỉnh Lâm Đồng Hội nghị Khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ 4, Hà Nội, 21/10/2011 Nhà xuất Nông nghiệp, 841-849 Trần Thị Lệ Quyên, Đào Thị Lương, Hà Thị Hằng, Dương Văn Hợp (2013) Nghiên cứu đa dạng nấm men phân lập vùng nhiễm chất độc hóa học dioxin thuộc khu bảo tồn M ã Đà - Đồng Nai Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ 29 (1): 4556 TIẾNG ANH Apt KE, Behrens PW (1999), Commercial developments in microalgal biotechnology, J Phycol, (35): 215-226 Bergman LW (2001) Growth and Maintenance o f Yeast In Methods in Molecular Biology, Vol 177, Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols Edited by: PN MacDonald © Humana Press Inc., Totowa, NJ Bligh EG and Dyer WJ (1959), A rapid method for total lipid extraction and puriíication, Can.J.Biochem.Physiol., (37): 911-917 Bodegom VP (2007), Microbial Maintenance: A Critical Review on Its Quantiíìcation Microbial Ecology, (53): 513-523 Boetius A, Ravenschlag K, Schubert KJ, Rickert D, Wiđdel F, Gieseke A, Amann R, Jùrgensen BB, Witte u and Pfannkuche o (2000), A marine microbial consortium apparently mediating anaerobic oxidation o f methane, Nature, (407), 623-626 Bruntner c , Binder T, Pathom-aree w , Goodfellow M, Bull AT, Potterat o , Puder c , Horer s, Schmid A, Bolek w , W agner K, Mihm G, and Fiedler HP (2005), Frigocyclinone, a novel angucyclinone antibiotic produced by a Streptomyces griseus strain from Antarctica, J Antibiot (Tokyo), 58(5): 346-349 Caccavo JR, Schamberger FPC, Keiding K, Nielsen PH (1997), Role o f hydrophobicity in adhesion o f the dissimilatory Fe(III)-reducing bacterium Shewanella alga to amorphous Fe(IIII) oxide Appl Environ Microbiol 63:3837-3843 C aư FJ, Chill D and Maicỉa N (2002), The lactic acid bacteria: a literature survey Crit Rev Microbiol, (28): 281-370 457 Cavaìliier ST, Allsopp MTEP and Chao EE (1994), Thraustochytrids are chromists, not fungi: 1!&S rR N A signatures o f heterokonta, Philos Trans R Soc Lond., B, Biol Sci., 346(1318): 3587-397 Chaiss;awang M, Verduyn c , Chauvatcharin s , Suphantharika M (2012), Metabolic networks annid bioenergetics o f Aurantiochytrìum sp B-072 during storage lipid íbrmation, Braz J NMíicrobiol., 43(3): 1192-1205 Chao) SH , Tomii Y, W atanabe K and Tsai YC (2008), Diversity o f lactic acid bacteria in fe'eỉnntented brines used to make stinky tofu Int J Food Microbiol, (123): 134-141 Chao) SH , W u RJ, W atanabe K and Tsai YC (2009), Diversity o f lactic acid bacteria in suantssíai ;anđ fu-tsai, traditional íermented mustard Products o f Taiwan Int J Food Microbiol, (11.35 ): 203-210 Chatrain RD, Janso J, Bem an V, Feng X, and Carter GT (2004), Diazepinomicin, a new anmtirmicTobial alkaloid from marine, (67): 1431-1433 Chatcdium rong w , Yongmanitchai w , Limtong s and Worawattanamateekul w (2006) ĩnrmproviement o f Astaxanthin Content in DHA-Rich Schizochytrium sp Isolated in TTThailland, Biosci Biotechnol Biochem C hem Y S , W u HC, Li YH, Leong KH, Pua XH, Weng MK and Yanagida F (2012), Diversity o t f ' laictic acid bacteria in sian-sianzih (íermented clams), a traditional fermented food in TYaìiw/an J Sci Food Agric, (92): 321-327 Chem Y S, W u HC, Lo HY, et (2012), Isolation and characterisation o f lactic acid bacteria fr