Nghiên cứu bệnh loét (neoscytalidium dimidiatum) hại thanh long và thử nghiệm biện pháp phòng trừ

TRÍCH YẾU LUẬN VĂNTên tác giả: Trần Thị Hồng Thúy Tên Luận văn: Nghiên cứu bệnh loét Neoscytalidium dimidiatum hại thanh long và Phương pháp nghiên cứu Trong nghiên cứu này, 15 mẫu bệnh

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VI T Ệ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo

vệ lấy bất kỳ học vị nào.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Trần Thị Hồng Thúy

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết

ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Đức Huy đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo,

Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Trung tâm Kiểm dịch thực vật sau nhập khẩu I – Cục Bảo vệ thực vật và Chi cục Bảo vệ thực vật tỉnh Bình Thuận đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./.

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Trần Thị Hồng Thúy

MỤC LỤC

Lời cam đoan .i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng .vii

Danh mục đồ thị, hình ix

Trích yếu luận văn xi

Thesis abstract xiii

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục đích của đề tài 2

1.3 Yêu cầu của đề tài 2

Phần 2 Tổng quan nghiên cứu 3

2.1 Vai trò của thanh long 3

2.2 Tình hình sản xuất thanh long 4

2.2.1 Tình hình sản xuất thanh long trên thế giới 4

2.2.2 Tình hình sản xuất thanh long tại Việt Nam 6

2.3 Tình hình nghiên cứu bệnh hại Thanh Long 8

2.3.1 Bệnh hại thanh long trên thế giới 8

2.3.2 Bệnh hại thanh long ở Việt Nam 9

2.4 Tình hình nghiên cứu bệnh loét hại Thanh Long 10

2.4.1 Tình hình nghiên cứu bệnh loét trên thế giới 11

2.4.2 Tình hình nghiên cứu bệnh loét ở Việt Nam 14

2.5 Phòng trừ bệnh loét hại Thanh Long 17

2.5.1 Trên thế giới 17

2.5.2 Tại Việt Nam .

17 Phần 3 Vật liệu và phương phápnghiên cứu 21

3.1 Địa điểm nghiên cứu 21

3.2 Thời gian nghiên cứu 21

3.3 Đối tượng/ vật liệu nghiên cứu 21

3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 21

3.3.2 Vật liệu nghiên cứu 21

3.4 Nội dung nghiên cứu 22

3.5 Phương pháp nghiên cứu 22

3.5.1 Phương pháp điều tra, thu thập mẫu bệnh, xác định phổ ký chủ 22

3.5.2 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 23

3.5.3 Phương pháp lây nhiễm 29

3.5.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của bề mặt giá thể tới nảy mầm của bào tử nấm 31

3.5.5 Phương pháp xử lý số liệu 32

Phần 4 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 33

4.1 Kết quả điều tra bệnh hại trên Thanh Long 33

4.2 Kết quả thu thập mẫu bệnh loét trên cây thanh long tại bình thuận, long an và tiền giang 34

4.2.1 Đặc điểm hình thái của nấm gây bệnh loét trên cây thanh long 37

4.3 Kết quả giám định tên tác nhân gây bệnh loét bằng kỹ thuật pcr và giải trình tự vùng its của nấm 38

4.4 Kiểm tra tác nhân gây bệnh theo quy tắc koch ở phòng thí nghiệm và nhà lưới

39 4.4.1 Kiểm tra tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch ở điều kiện phòng thí nghiệm 39

4.4.2 Lây bệnh nhân tạo kiểm tra tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch ở nhà lưới

40 4.5 Khả năng nảy mầm của bào tử phân sinh Neoscytalidium dimidiatum 43

4.6 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và ph đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Neoscytalidium dimidiatum 44

4.6.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Neoscytalidium dimidiatum trên môi trường PGA 44

4.6.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Neoscytalidium dimidiatum trên môi trường PGA 47

4.7 Khảo sát hiệu lực ức chế nấm neoscytalidium dimidiatum bằng thuốc hóa học trên môi trường PGA 48

4.8 Khảo sát hiệu lực ức chế nấm bằng phương pháp trộn hỗn hợp dung dịch nano bạc/đồng và dung dịch nano bạc với môi trường 53

4.9 Khảo sát khả năng ức chế nấm neoscytalidium dimidiatum bằng phương

pháp tráng bề mặt hỗn hợp dung dịch nano bạc/đồng và dung dịch nano

bạc trên môi trường PGA 55

4.10 Đánh giá thời gian bào tử nảy mầm và tỷ lệ nảy mầm của bào tử Neoscytalidium dimidiatum khi được xử lý bằng dung dịch nano bạc, dung dịch nano bạc/đồng, nấm Trichoderma viride, Anvil %SC, Daconil 75WP VÀ Agri-fos 400SL 58

4.11 Xác định phổ ký chủ tự nhiên của nấm Neoscytalidium dimidiatum 59

4.12 Khảo sát khả năng phòng trừ nấm neoscytalidium dimidiatum của các loại thuốc hóa học và sinh học trong điều kiện nhà lưới 62

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 65

5.1 Kết luận 65

5.2 Kiến nghị 66

Tài liệu tham khảo 67

MAGAP Bộ Nông nghiệp, Chăn nuôi và Thủy sản Ecuador

WA Môi trường thạch nước cất

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Diện tích (ha) thanh long ở Philippines (2008-2014) 5 Bảng 2.2 Năng suất (tấn) thanh long ở Philippines (2008-2014) 5 Bảng 2.3 Diện tích, năng suất và sản lượng thanh long ở các tỉnh sản xuất thanh

long chính ở Việt Nam năm 2005 và 2010-2014 7 Bảng 2.4 Kết quả phòng chống bệnh loét trên cây thanh long trên địa bàn tỉnh

Bình Thuận (từ ngày 25/12/2015 đến ngày 15/4/2016) 20 Bảng 4.1 Danh mục các bệnh chính hại thanh long 33 Bảng 4.2 Kết quả thu thập mẫu bệnh loét tại một số vườn thanh long ở Bình

Thuận, Long An, Tiền Giang năm 2015 – 2016 .36

Bảng 4.3 Đặc điểm của tản nấm và sợi nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 7

ngày nuôi cấy trên môi trường PGA ở nhiệt độ phòng (25oC) .37 Bảng 4.4 Kết quả định danh nấm bằng PCR và giải trình tự 39 Bảng 4.5 Kết quả giải trình tự và tìm kiếm các chuỗi gần gũi trên ngân hàng

gene (GenBank) 39

Bảng 4.6 Tỷ lệ bệnh (%) cây thanh long bị nhiễm sau khi lây Nescytalidium

dimidiatum trong điều kiện không sát thương 41

Bảng 4.7 Tỷ lệ bệnh (%) cây thanh long bị nhiễm sau khi lây Neoscytalidium

dimidiatum trong điều kiện có sát thương sát thương 41

Bảng 4.8 Tỷ lệ nảy mầm của bào tử nấm Neoscytalidium dimidiatum 43 Bảng 4.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Neoscytalidium

dimidiatum trên môi trường PGA .45

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Neoscytalidium

dimidiatum trên môi trường PGA .47

Bảng 4.11 Kết quả thử hiệu lực ức chế nấm Neosytalidium dimidiatum bằng

thuốc Alvil 5SC trên môi trường PGA .49

Bảng 4.12 Kết quả thử hiệu lực ức chế nấm Neosytalidium dimidiatum bằng

thuốc Daconil 75 WP trên môi trường PGA 51

Bảng 4.13 Khả năng ức chế nấm Neoscytalidium dimidiatum trên môi trường

PGA được trộn dung dịch nano bạc 53

Bảng 4.14 Khả năng ức chế nấm Neoscytalidium dimidiatum trên môi trường

PGA được trộn dung dịch nano bạc/đồng 54

Bảng 4.15 Khả năng ức chế nấm Neoscytalidium dimidiatum trên môi trường

PGA được tráng dung dịch nano bạc 55

Bảng 4.16 Khả năng ức chế nấm Neoscytalidium dimidiatum trên môi trường

PGA được tráng dung dịch nano bạc/đồng 57

Bảng 4.17 Thời gian và tỷ lệ nảy mầm của bào tử Neoscytalidium dimidiatum trong

dung dịch nano bạc, nano bạc/đồng, nấm Tr ichoderma viride, Daconil,

Bình Thuận 34 Hình 4.3 Triệu chứng bệnh loét thanh long: A) Triệu chứng bệnh loét trên thanh

long thu tại ấp An Khương, xã Mỹ Tịnh An, Chợ Gạo, Tiền Giang; B) Triệu chứng bệnh loét trên quả thanh long thu tại xã Long Trì, Châu Thành, Long An; C) Triệu chứng vết màu nâu nhỏ, lồi, trên bề mặt có các chấm đen trên thanh long thu tại Hàm Thuận Nam, Bình Thuận; D) Vết bệnh to, trên bề mặt có các quả cành màu đen thu tại Hàm Thuận Bắc, Bình Thuận 36 Hình 4.4 Đặc điểm hình thái của nấm Neoscytalidium dimidiatum: A) Tản nấm

sau 7 ngày nuôi cấy trên PGA; B, C &D) Sợi nấm và bào tử nấm 38 Hình 4.5 Kiểm tra tác nhân gây bệnh trên cành thanh long theo quy tắc Koch: B,

C) có sát thương; D) không sát thương, E) lát cắt mô bệnh và F) sợi nấm xâm nhập qua tế bào biểu bì 40 Hình 4.6 Lây bệnh nhân tạo: A) Đối chứng và cây lây nhiễm, B)Triệu chứng

vết bệnh 7 ngày sau lây, C&D) Triệu chứng vết bệnh 15 ngày sau lây 43 Hình 4.7 Bào tử phân sinh: A) hình dạng bào tử phân sinh, B) bào tử nảy mầm,

C) sợi nấm trong mô bệnh 44 Hình 4.8 Kích thước tản nấm trên PGA: A) sau 03 ngày theo dõi ở 20 oC và

30oC; B) Kích thước tản nấm sau 06 ngày theo dõi ở 40 oC; C) Kích thước tản nấm sau 07 ngày theo dõi 46 Hình 4.9 A)Tản nấm Neoscytalidium dimidiatum 5 ngày sau cấy ở ngưỡng

pH4-pH 8; B) Đồ thị biểu diễn kích thước tản nấm sau 03 ngày nuôi cấy ở các ngưỡng pH khác nhau 48 Hình 4.10 A) Tản nấm sau 7 ngày trên môi trường PGA có bổ sung Daconil

75WP; B) Tản nấm sau 7 ngày trên môi trường PGA có bổ sung Anvil 5SC 53

Hình 4.11 Tản nấm sau các ngày nuôi cấy trên môi trường PGA tráng dung dịch

nano bạc 70 ppm: A) 1 ngày và B) 5 ngày 56 Hình 4.12 Tản nấm sau các ngày nuôi cấy trên môi trường PGA tráng dung dịch

nano bạc/đồng 70 ppm: A) 3 ngàyvà B) 5 ngày 57 Hình 4.13 Thử nghiệm khả năng nảy mầm của bào tử nấm Neoscytalidium

dimidiatum 59 Hình 4.14 Triệu chứng vết đốm màu nâu trên: A) xương rồng, B) cỏ bông trắng 61 Hình 4.15 Một số loài cỏ dại trên vườn thanh long 61 Hình 4.16 Triệu chứng loét sau khi lây nhiễm nhân tạo: A) đốm màu trắng, B)

đốm màu nâu đỏ và C) vết loét to trên có nhiều quả cành 64

Đồ thị 4.1 Kích thước tản nấm sau 03 ngày nuôi cấy ở các ngưỡng nhiệt độ khác

nhau 46

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Trần Thị Hồng Thúy

Tên Luận văn: Nghiên cứu bệnh loét (Neoscytalidium dimidiatum) hại thanh long và

Phương pháp nghiên cứu

Trong nghiên cứu này, 15 mẫu bệnh loét trên thanh long đã được thu thập tại 10 điểm trồng thanh long của Bình Thuận, Long An và Tiền Giang Triệu chứng bệnh ban đầu là những đốm tròn nhỏ lõm xuống so với mô khỏe, chính giữa vết đốm tròn là một chấm nhỏ màu đỏ tươi Vết bệnh phát triển mạnh nhô lên màu vàng cam cuối cùng vết bệnh nổi u lên có màu nâu Bệnh thường xuất hiện trên cành bánh tẻ và có thể liên kết với nhau tạo thành vết đốm Quả cành của nấm gây bệnh màu đen được hình thành trên

bề mặt vết bệnh Nấm gây bệnh được phân lập từ mẫu bệnh có triệu chứng điển hình bằng các môi trường: WA, PGA; Đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh học của nấm gây bệnh được quan sát trên môi trường PGA sau 7-10 ngày nuôi cấy Tính gây bệnh của

nấm N dimidiatum được lây nhiễm nhân tạo theo quy tắc Koch DNA của nấm được tách

chiết và đặc điểm phân tử của nấm được xác định bằng PCR và giải trình tự vùng ITS Thử nghiệm phòng trừ nấm này bằng thuốc trừ nấm và chế phẩm trên môi trường PGA và trong nhà lưới.

Kết quả chính và kết luận

Kết quả phân lập mẫu bệnh: trong nghiên cứu này 10 mẫu bệnh điển hình đã

được thu thập và phân lập được tác nhân gây bệnh thuần trên môi trường PGA Sợi nấm có màu nâu đến nâu sậm, mịn, dày, phân nhánh, có vách ngăn và tự tách ra thành bào tử đốt Bào tử có nhiều hình dạng khác nhau: elip, trứng, tròn, que.

Xác định tác nhân gây bệnh: dựa vào đặc điểm hình thái, tính gây bệnh theo

quy tắc Koch, đặc điểm vùng gen ITS, nấm gây bệnh được xác định là N dimidiatum

Đặc điểm sinh học: Nấm Neoscytalidium dimidiatum có khả năng phát triển

trong khoảng nhiệt độ và pH rộng: từ 15-40oC và pH=4-9 Trong đó thích hợp nhất là

30-35oC và pH= 7-8.

Thử nghiệm biện pháp phòng trừ: Qua quá trình thử nghiệm biện pháp phòng

trừ nấm N dimidiatum cũng cho thấy thuốc Anvil 5SC có khả năng ức chế sự sinh trưởng phát triển của N.dimidiatum Chế phẩm nano bạc, nano bạc/đồng và Agri-fos 400SL không có hiệu quả phòng trừ bệnh loét thanh long do N dimidiatum gây ra Trong quá trình nghiên cứu cũng chỉ ra được xương rồng là cây ký chủ phụ của N.

dimidiatum

THESIS ABSTRACT Master candidate: Tran Thi Hong Thuy

Thesis title: Studies on causal agent and control measures of Brown Spot Disease

(Neoscytalidium dimidiatum) on Dragon fruit

Major: Plant proctection Code: 60.62.01.12

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture

(VNUA)

Research Objectives: Identification of diseases on Dragon fruit; study on morphological

and molecular characterization of fungus that cause canker on dragon fruit and testing inhibitory control of some fungicide and preparations on PGA media and green house environment.

Materials and Methods: 15 canker samples of dragon fruit were collected from 10

cultivating location in Binh Thuan, Long An and Tien Giang At the early stage of the disease, the symptoms showed small, circular, orange sunken spots, and then develop into canker with brown color Disease appeared most often on the stem, may be gather into group and become spot Black pycnidia were erumpent from the surface of the cankers and stems subsequently rotted Fungus were isolated from particular disease samples using: WA, PGA media Morphology and biology characterization were

observed on PGA media after 7 to 10 days of culture Pathogenicity of N.

dimidiatum fungi was carried out by using Koch’s Postulate DNA of fungus were

isolated and molecular characterization was determined by using PCR and ITS region sequencing Testing of disease control was carried out using fungicides and preparations on PGA media and green house environment.

Main findings and conclusions:

Results of isolation: In this study, 10 samples of canker were collected, isolated

and identified as N dimidiatum on PGA medium Colonies that had grey to black,

wooly mycelium were formed The mycelia were branched and septate The arthroconidia were dark brown, thick-walled, one-celled, and ovate to rectangular.

Disease pathogen identification: The disease pathogen was identified as N.

dimidiatum base on morphology on PGA, pathogenicity test and molecular characteristics of ITS region.

Biology characterization:: Optimal temperature of N dimidiatum growth ranging

from 30-35oC and pH level from 7-8.

Testing of control method: The treatment of chemicals of Anvil 5SC was

significantly effective in controlling percentage of disease intensity on PGA medium Other products such as: nano silver, nano silver/copper and Agri-fos 400SL had no

effects on control of canker disease caused by N dimidiatum The study also identified that Dragon fruit is the sub host plant of N dimidiatum

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cây thanh long (Hylocereus undatus Haw.) có tên tiếng Anh là Pitahaya,

hay còn gọi là Dragon fruit, thuộc họ xương rồng, có nguồn gốc ở vùng sa mạcthuộc Mehico và Comlombia Thanh long được trồng ở các nước như TrungQuốc, Đài Loan và trong khu vực Đông Nam Á như Malaysia, Thái Lan,Philippines Thanh long được người Pháp đem vào trồng ở Việt Nam trên 100năm nay, nhưng mới được đưa lên thành hàng hóa từ thập niên 1980

Cây thanh long là cây ăn quả xuất khẩu chủ lực của nước ta có diện tích sảnxuất khoảng 30.000 ha được trồng tập trung chủ yếu ở Bình Thuận với diện tíchkhoảng 20.000 ha, ở Long An có trên 3.200 ha, Tiền Giang có khoảng 3.000 havới sản lượng khoảng 630.000 tấn/ năm Ở miền Bắc, cây thanh long mới đượctrồng ở một số vùng như Hòa Bình, Hà Tây, Phú Thọ với diện tích từ 20 – 30 ha.Quả thanh long sản xuất chủ yếu được dùng cho tiêu thụ tươi trong nước vàxuất khẩu Hiện tai, thanh long đã có mặt tại 30 quốc gia trên Thế Giới, mang lạikim ngạch xuất khẩu hàng năm khoảng 203,8 triệu USD (chiếm khoảng 61,4%giá trị trái cây tươi xuất khẩu) (Cục trồng trọt, 2014) Do đó, thanh long đangđược xem là cây ăn quả chiến lược quan trọng nhất của Việt Nam Tuy nhiên,việc xuất khẩu thanh long đến các thị trường nước ngoài luôn gặp nhiều trở ngạichủ yếu do sâu bệnh hại

Do hiệu quả kinh tế cao gấp nhiều lần của cây thanh long nên diện tích vàsản lượng cây thanh long ngày càng gia tăng Cùng với việc gia tăng diện tích,thâm canh, tăng vụ, tình hình sâu bệnh trên cây thanh long ngày càng trở nênphức tạp Trong những năm gần đây cây thanh long bị nhiều đối tượng dịch hạigây hại như bệnh thán thư, thối quả, thối cành và đặc biệt là bệnh loét gây thiệthại nghiêm trọng về năng suất, chất lượng quả, ảnh hưởng lớn đến tiêu thụ nộiđịa và xuất khẩu Đến nay, chưa có nghiên cứu chuyên sâu về bệnh loét cũng nhưchưa có giải pháp quản lý bệnh hiệu quả Bệnh ngày càng nặng và lây lan rộngảnh hưởng trực tiếp đến đời sống của hàng triệu nông dân trồng thanh long

Bệnh loét thanh long do Neoscytalidium dimidiatum diễn biến rất phức tạp, lây

lan nhanh trên diện rộng, phát triển mạnh vào mùa mưa Bệnh phát triển mạnhtrên cành non và trên quả gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chấtlượng sản phẩm, dẫn đến làm giảm giá trị thương phẩm Ở một số vườn thanh

long mới trồng, bệnh loét đã xuất hiện trên cành với tỷ lệ dao động từ 1 – 5%.Trên một số vườn thanh long kinh doanh, bệnh nặng hơn với tỷ lệ bệnh dao động

từ 10 – 50%

Trên thế giới đã có một số nghiên cứu và công bố về nấm Neoscytalidium

dimidiatum (N dimidiatum) gây bệnh loét trên thanh long, nhưng tại Việt Nam

có rất ít công bố cũng như nghiên cứu chuyên sâu về bệnh dẫn đến chưa có giảipháp quản lý bệnh hiệu quả, làm cho tình trạng bệnh ngày càng nặng, lây lanngày càng rộng gây thiệt hại lớn về năng suất, chất lượng, ô nhiễm môi trường vàảnh hưởng tới xuất khẩu Xuất phát từ thực trạng trên chúng tôi tiến hành thực

hiện đề tài: “Nghiên cứu bệnh loét (Neoscytalidium dimidiatum) hại thanh long

và thử nghiệm biện pháp phòng trừ”.

Xác định thành phần bệnh hại trên cây thanh long; nghiên cứu đặc điểmsinh học, phân tử của nấm gây loét trên cây thanh long và thử hiệu lực ức chếnấm bằng một số loại thuốc trừ nấm và chế phẩm trên môi trường PGA và trongnhà lưới

1.3 YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI

thanh long chính ở các tỉnh Đông và Tây Nam bộ

rDNA-ITS của nấm

chủ của nấm gây bệnh loét trên cây thanh long

nano bạc/đồng, chất kích kháng và một số thuốc trừ nấm

PHẦN 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.1 VAI TRÒ CỦA THANH LONG

Thanh long là cây ăn quả nhiệt đới cho năng suất cao, có giá trị xuất khẩumang lại hiệu quả kinh tế cao Tại Việt Nam, thanh long đã góp phần thay đổicuộc sống của nhiều nông dân ở các tỉnh như Bình Thuận, Long An, TiềnGiang.Thanh long là cây ăn quả ngon, là thực phẩm quan trọng đối với con người.thanh long có hàm lượng chất dinh dưỡng cao, trung bình một quả thanh longchứa khoảng 60 đơn vị calo, 60mg natri, 8g đường và 1g chất xơ Không giốngnhư các loại trái cây khác, ngoài các chất dinh dưỡng kể trên, thanh long cònchứa 2g chất béo không bão hòa và 2g protein Hầu hết hàm lượng chất béo vàprotein được tìm thấy trong hạt Thanh long chứa một hàm lượng đáng kểvitamin C, carotin, canxi, một số loại vitamin B, một số chất dinh dưỡng và chấtchống oxy hóa khác Những dưỡng chất này giúp hệ thống tiêu hóa trong cơ thểhoạt động tốt hơn, tăng cường hệ miễn dịch, năng lượng dồi dào Ngoài ra, ănthanh long còn rất tốt cho da và thị lực thậm chí có thể giúp nhanh khỏi và giảmmức độ nghiêm trọng của cảm lạnh thông thường Đối với những người đang cốgắng để tăng lượng chất xơ trong khẩu phần ăn hàng ngày, thanh long có thể làmột lựa chọn thay thế tuyệt vời Các chất xơ hòa tan có trong thanh long có thểgiúp mọi người giảm cân, giảm lượng đường trong máu, nuôi dưỡng ruột và ngănngừa ung thư ruột kết Thanh long cung cấp đầy đủ chất xơ, giúp giảmcholesterol, kiểm soát trọng lượng và loại bỏ các độc tố một cách hiệu quả chocon người Thanh long được chứa đầy đủ các chất chống oxy hóa, giúp bảo vệcác tế bào của cơ thể trước sự tấn công của các gốc tự do, đẩy lùi tốc độ lão hóa

và thậm chí là ngăn chặn bệnh ung thư Hàm lượng anthocyanin có trong thanhlong là rất cao Anthocyanin là một loại chất chống oxy hóa Nó có thể giúp mọingười ngăn chặn xơ cứng mạch máu, bệnh tim và nguy cơ xuất huyết não Đồngthời, anthocyanin có thể chống lại các gốc tự do để trì hoãn sự lão hóa của cơ thểcon người và ngăn chặn sự hình thành của bệnh mất trí nhớ do tuổi già Hàmlượng sắt có trong thanh long cũng là cao, sắt là nguyên liệu cần thiết để sản xuấthemoglobin trong cơ thể con người vì vậy chúng ta có thể bổ sung sắt để ngănchặn bệnh thiếu máu bằng cách ăn thanh long Ngoài ra protein chay chứa trongquả thanh long có thể được tích hợp tích cực với các kim loại nặng trong cơ thểcon người để loại bỏ các độc tố và bảo vệ thành dạ dày

2.2 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT THANH LONG

2.2.1 Tình hình sản xuất thanh long trên thế giới

Thanh long là loài thực vật bản địa tại Mexico, các nước Trung và Nam Mỹ.Hiện nay, loài cây này cũng được trồng ở các nước trong khu vực Đông Nam Ánhư Việt Nam, Malaysia, Thái Lan, Philippines, Indonesia, miền nam TrungQuốc, Đài Loan và một số khu vực khác Thanh long được đưa vào trồng ởIndonesia từ năm 1997 ở các đảo Sumatra, Java và Kalimantan; Các giống phổbiến là giống vỏ đỏ - ruột đỏ và vỏ đỏ -ruột trắng được trồng chủ yếu ở đôngJava, trung Java, tây Java, Bali, Riau, Kepulauan, tây Sumatra, bắc Sumatra,đông Kalimantan và nam Sulawesi Đến cuối năm 2014, diện tích trồng thanhlong ở Kalimantan là 1.500ha Năng suất trung bình khoảng 24 đến 30tấn/ha/năm (Muas and Jumjunidang, 2015)

Mặc dù không phải là loài bản địa nhưng thanh long là một trong nhữngloại trái cây được trồng phổ biến ở và trở thành mặt hàng xuất khẩu tiềm năng ởJohor, Perak, Negeri Sembilan, Pahang, Pulau Pinang và Sabah, Malaysia Giữanăm 2006 đến năm 2009, diện tích trồng thanh long tăng cao Diện tích canh tácđạt đỉnh cao vào năm 2008 với 2.200 ha so với 920 ha vào năm 2006 Năng suấtbình quân là 12,5 tấn/ha và cao nhất là 15.700 tấn vào năm 2009 Tuy nhiên,diện tích trồng giảm dần từ năm 2011 (1.525ha) và đến năm 2013 chỉ còn 452 ha.Nguyên nhân của sự giảm sút này là do sự bùng phát của bệnh thối mềm do vi

khuẩn Xanthomonas campestris trong điều kiện mưa nhiều kèm theo ẩm độ cao.

(Zainudin and Ahmad, 2015)

Zaw Htun Myint (2015) cho biết trong một thập kỷ qua, cây thanh long đãđược mở rộng diện tích trồng ở Myanmar với tổng cộng 100 ha Trong đó, 46 hatại Naung Cho Thibaw, 28 ha ở Pyin Oo Lwin, Kyaukse, meiktila; 12 ha ởOattwin; 4 ha ở Aunglan; 4 ha ở Naypyitaw; 6 ha ở Taikyi và Hlegu

Đầu những năm 90 thanh long đã được đưa vào trồng ở Philippines và trongnhững năm qua đã phát triển và mở rộng diện tích canh tác lên đến 267 ha với

năng suất 1.573 tấn (Leonardo et al., 2015).

20 12

20 13

20 14

2 0

2 2

2 3

2 3 Ot

3 0

9 1

1 2

12 9, Tổ

1 0

1 9

2 4

26 7,

2 0

2 0

2 0

2 2

2 8

2 8 Ot

1 5

2 3

2 3 Tổ

8 1

14 14

15 73

Tại Đài Loan, thanh long được đưa vào trồng từ năm 1980 và ngày càngđược mở rộng Diện tích trồng thanh long ở Đài Loan năm 2013 là 1.191 ha và1.587 ha năm 2014, chủ yếu tập trung ở vùng trung tâm (53,6%) và đồng bằng phíanam (35,6%); trong đó, Chương Hóa: 118ha, Nam Đầu: 45ha, Đài Trung: 33ha.Năng suất đạt khoảng 25 tấn/ha; Tổng sản lượng trong năm 2013 là 27.654 tấn.Ngoài tiêu dùng trong nước thì thanh long cũng được xuất khẩu sang Trung Quốc,

Nhật Bản, Singapore, Hồng Kong, Canada (Liu et al., 2015; Jiang and Yang,

2015)

Các khu vực sản xuất thanh long chính ở Ecuador là ở tỉnh Bolívar(Echandia); Guayas (Guayaquil); Los Ríos (Quinsaloma, Windows); Loja(Vilcabamba); Manabi (Rocafuerte, San Isidro); Morona Santiago (Palora);Pichincha (Pedro Vicente Maldonado, Puerto Quito, San Miguel de los Bancos,Nanegal, Nanegalito, Puerto Quito); Santa Elena (Santa Elena); Santo Domingo

de los Tsáchilas (La Concordia); Napo (Tena); Pastaza (Puyo), năng suất trungbình 10 tấn/ha (MAGAP, 2014)

Nicaragua là nước sản xuất thanh long chính của Trung Mỹ với diện tích800-1000 ha

Dựa vào đặc điểm thân cành, vỏ quả và màu sắc thịt quả, thanh long đượcchia thành 3 nhóm với tên khoa học như sau:

- Hylocereus undatus thuộc chi Hylocereus, ruột trắng, vỏ hồng hoặc đỏ.

- Hylocereus polyrhizus thuộc chi Hylocereus, ruột đỏ, vỏ hồng hoặc đỏ.

- Hylocereus megalanthus, trước đây được coi là thuộc chi Selenicereus,

ruột trắng vỏ vàng

2.2.2 Tình hình sản xuất thanh long tại Việt Nam

Thanh long được trồng tập trung chủ yếu ở 3 tỉnh: Bình Thuận, Long An vàTiền Giang với tổng diện tích gần 30 nghìn ha, trong đó chủ yếu ở Bình Thuận

24 nghìn ha, Long An 5.408 ha (2.120 ha mới trồng) và Tiền Giang 4.200ha.Theo số liệu của Cục trồng trọt, Bộ NN&PTNT, hiện nay, diện tích thanhlong cả nước đạt hơn 28.700 ha, trong đó diện tích cho thu hoạch là 23.820 ha sảnlượng ước 520.000 tấn/năm Bình Thuận là tỉnh sản xuất thanh long lớn nhất vớidiện tích trên 21.000 ha, tổng sản lượng khoảng 400.000 tấn, chiếm hơn 71% diệntích thanh long toàn quốc Bình Thuận cũng là địa phương đẩy mạnh SX thanhlong theo tiêu chuẩn VietGAP, GlobalGAP với diện tích năm 2013 đạt trên 7.300ha

Hình 2.1 Các vùng sản xuất thanh long chính ở Việt Nam (màu đỏ)

Bảng 2.3 Diện tích, năng suất và sản lượng thanh long ở các tỉnh sản xuất

thanh long chính ở Việt Nam năm 2005 và 2010-2014

2 0

2 0 T

2 2

2 5 Nă

2 3

2 3 Sả

51 92

58 37

1 8

1 9 Nă

2 2

2 1 Sả

40 08

43 01

1 6

2 1 Nă

3 6

3 6 Sả

6 1

7 8

2 3

3 0 Nă

2 4

2 4 Sả

5 6

7 5

Bắt đầu từ năm 2005, sản xuất thanh long ở Việt Nam ngày càng được mởrộng Theo Cục Bảo vệ thực vật, tính đến ngày 26/6/2016, diện tích trồng thanhlong ở Việt Nam khoảng 40.000 ha với năng suất trung bình là 998000 tấn mỗinăm (PPD, 2016)

80-86% thanh long sản xuất ở Việt Nam phục vụ cho xuất khẩu Tính đếnthời điểm hiện nay, thanh long Việt Nam đã xuất khẩu tới 40 quốc gia và vùnglãnh thổ Năm 2013, kim ngạch xuất khẩu (chính ngạch) trái cây tươi đạt 307triệu USD thì thanh long chiếm tới 61,4% Ngoài một số thị trường truyền thốngnhư Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia, Malaysia, Hà Lan… thanh long đang từngbước xâm nhập vào một số thị trường mới là Ấn Độ, New Zealand, Úc, Chi Lê,Nhật Bản tạo được sự đa dạng hóa trong cơ cấu thị trường xuất khẩu thanh longcủa Việt Nam

2.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH HẠI THANH LONG

2.3.1 Bệnh hại thanh long trên thế giới

Nguyên nhân chính gây giảm năng suất và sản lượng thanh long ởIndonesia trong những năm gần đây là sự bùng phát bệnh hại, hàng trăm ha trồngthanh long đã bị phá hủy Các bệnh chủ yếu là đốm màu trắng/vàng do

Alternaria sp và Pestalotiopsis sp.; thối thân do Fusarium sp., Sclerotium sp và

Phytopthora sp.; bệnh thán thư do Colletotrichum gloeosporioides (C gleosporioides) và bệnh loét do Neoscytalidium dimidiatum (N dimidiatum)

(Muas and Jumjunidang, 2015)

Theo Masratul et al (2015), thanh long hiện đang được trồng ở hầu hết các

tiểu bang ở Malaysia Cùng với sự gia tăng về diện tích canh tác thì tỷ lệ nhiễmbệnh hại cũng tăng lên Thanh long ở Malaysia bị nhiễm nhiều bệnh hại do nấm

như bệnh thán thư gây ra bởi C gloeosporioides và Colletotrichum truncatum (C.

truncatum), thối thân do Curvularia lunata (C.lunata) với tỷ lệ bệnh lên đến 41%,

loét do N dimidiatum, thối do Fusarium semitectum (F semitectum)và thối cành

do Fusarium proliferatum (F proliferatum) (Masratul et al., 2013).

Mẫu thanh long bị bệnh được thu thập từ tháng 10 năm 2012 đến tháng 5năm 2014 tại các địa điểm khác nhau ở Chanthaburi, Rayong, Ratchaburi vàNakhon Ratchasima (Thái Lan) Kết quả khảo sát đã xác định được ba loài bệnhgây hại chủ yếu là bệnh thán thư, thối quả và loét thân; tỷ lệ bệnh cao nhất làbệnh thán thư trên gốc, bệnh thán thư trên quả, thối quả và loét thân với tỷ lệtương ứng lần lượt là 23,4%, 22,5%, 13,5% và 58,2% Tác nhân gây bệnh từ cáctriệu chứng nêu trên được phân lập trên môi trường thạch đường khoai tây (PGA),dựa trên các đặc điểm hình thái, đặc điểm phân tử và lây bệnh nhân tạo, các tác

nhân gây bệnh đã được xác định là Bipolaris cactivora gây thối quả, C.

gloeosporioides và C truncatum gây bệnh thán thư trên thân và quả và N dimidiatum là tác nhân gây bệnh loét - một bệnh mới được tìm thấy trong các

khu vực trồng thanh long Đây là báo cáo đầu tiên về bệnh hại do C truncatum

và N dimidiatum gây ra trên thanh long ở Thái Lan (Athipunyakom et al., 2015).

Vào những năm 1990 ở Mexico, đã bước đầu có những nghiên cứu về tácnhân gây bệnh thối mềm thân thanh long Theo đó, có ít nhất hai loài vi khuẩngây ra bệnh thối mềm thân Triệu chứng thối mục đã xuất hiện 15 ngày sau khi

lây nhiễm nhân tạo, tác nhân gây bệnh được xác định là Botryosphaeria dothidea (B.dothidea)và Fusiciccum sp (Valencia et al., 2013) Một bệnh thối mềm đặc

biệt gây hại trên thân cây và quả thanh long tại Malaysia đã được nghiên cứu bởi

Masyahit et al (2009); Nhóm nghiên cứu đã kết luận rằng, tác nhân gây bệnh thối mềm có màu vàng và nâu là Enterobacter cloacae;

Ở Ecuador, thanh long bị nhiễm nhiều bệnh hại bao gồm: C.

gloeosporioides, Fusarium oxysporum (F oxysporum), Erwinia carotovora (E carotovra) (MAGAP, 2015), Lasiodiplodia theobromae, Aspergillus flavus (A flavus) (CABI, 2016).

Trong báo cáo vắn tắt về cây thanh long, Ortiz-Hernández., and

Carrillo-Salazar., (2012) đã liệt kê được bệnh hại trên thanh long bao gồm: E carotovora,

Xanthomonas campestris, Dothiorela sp., C gloesporoides, Alternaria sp, Curvularia sp., Phoma sp., Cladosporium sp., Vollutella sp., Helminthosporium

sp., Corynespora sp., Bipolaris cactivora, dothidea, Capnodium sp, Fusarium

sp, Helminthosporium cactovorum, Drechslera cactivora, Glomerella cingulata,

Pectobacterium carotovorum subsp carotovorum và N dimidiatum; Quả thanh

long sau thu hoạch cũng bị nhiều tác nhân gây hại như: Fusarium lateritium,

Aspergillus niger.

Trong một cuộc điều tra khảo sát bệnh hại thanh long tại Đài Loan, một sốcây đã được tìm thấy với triệu chứng là những vết đốm nhẹ lan rộng toàn thâncây gây ra bởi Cactus Virus X thuộc Potexvirus Các nghiên cứu tiếp theo đã xácđịnh được thêm 02 loài virus gây hại trên thanh long là Zygocactus virus X

(ZyVX) và Pitaya Virus X (PiVX) (Li et al., 2015).

2.3.2 Bệnh hại thanh long ở Việt Nam

Theo thống kê của Cục bảo vệ thực vật (2010), thanh long bị nhiễm nhiều

loài nấm bệnh gây hại bao gồm: Erwinia chrysanthemi, Enterobacter cloacae,

Pectobacterium carotovorum, Xanthomonas campestris, Phytophthora cactorum, Alternaria alternata, Alternaria cheiranthi, Aspergillus avenaceus, Aspergillus awamori, Aspergillus clavatus, Aspergillus flavus var columnaris, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus niger, Aspergillus tubingensis, Bipolaris cactivora, Botrytis cinerea, Capnodium sp., Cladosporium herbarum, Cladosporium oxysporum, Colletotrichum capsici, Colletotrichum coccodes, Colletotrichum gloesporioides, Colletotrichum musae, Colletotrichum truncatum, Curvularia crustacea, Curvularia lunata, Curvularia oryzae, Diplodia sp., Fusarium equiseti, Fusarium lateritium, Fusarium oxysporium, Fusarium semitectum, Fusarium solani, Fusarium verticillioides, Gloesporium agaves,

Haplariopsis fagicola, Lasiodiplodia theobromae, Mucor hiemalis, Penicillium charlesii, Neoscytalidium dimidiatum, Phoma sp., Phytophthora cactorum, Phytophthora nicotianae, Pythium aphanidermatum, Pythium irregulare, Rhizoctonia solani.

2.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH LOÉT HẠI THANH LONG

Trong những năm gần đây thanh long bị bệnh loét (loét) gây hại nặng bởi

nấm Neoscytalidium dimidiatum (N dimidiatum) Đây là một bệnh có ảnh hưởng

lớn nhất đến năng xuất chất lượng sản phẩm gây thiệt hại lớn cho người trồngthanh long Trước vấn đề cấp thiết trên nhiều nhà khoa học trên thế giới đã

nghiên cứu và tìm hiểu về nấm N dimidiatum.Khóa phân loại của Ellis (1976)

dựa vào đặc điểm hình thái bào tử, cành bào tử, kích thước bào tử và hình thái

tản nấm, đã xác định tác nhân gây loét trên thanh long là do nấm Scytalidium

dimidiatum (Penz.) B Sutton & Dyko (1989), hiện nay nấm còn được gọi tên là

N dimidiatum (Penz.) Crous & Slippers (2006).

Đặc điểm vị trí phân loại của nấm N dimidiatum (Agrios 2005), (Crous &

Loài: Neoscytalidium dimidiatum

N dimidiatum thuộc ngành nấm túi (Ascomycota), Ascomyta có cơ thể sinh

dưỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp, có vách ngăn, một tế bào thường

có một nhân đôi khi có nhiều nhân, dạng chuyên hóa dạng sợi bắt đầu đứt đoạn

ra tạo thành cơ thể đơn bào hình tròn, bầu dục chứa nhiều nhân hay một nhân.Vách tế bào cấu tạo bằng chitin hay glucan, đa số hoại sinh gây mục gỗ, hoạisinh trên đất, trong nước, trên cạn, thực vật động vật, một số lại ký sinh gâybệnh trên thực vật, động vật, người gây nên những thiệt hại lớn Ascomyta sinhsản sinh dưỡng bằng sự chia đôi tế bào nảy chồi, đứt đoạn sợi nấm, bào tử áo,bào tử màng dày, sinh sản vô tính bằng bào tử đính (conidia), và sinh sản hữutính bằng bào tử túi Các bào tử khác tính (+, -) sợi nấm đơn bội, phân nhánhthành hệ sợi nấm hình thành các cặp cơ quan sinh sản, giao phối sinh chất, hìnhthành sợi sinh túi đa bào, sau đó phân chia nguyên nhiễm kết hợp thành nhân

lưỡng bội rồi giảm nhiễm tạo thành bào tử túi Chu trình sống của Ascomytagồm 3 giai đoạn: giai đoạn đơn bội, giai đoạn song hạch và giai đoạn lưỡng bội,trong đó giai đoạn đơn bội chiếm ưu thế Một số Ascomyta hình thành quả thểtrong đó có quả thể kín, quả thể mở lỗ và quả thể hở.

Chi N dimidiatum được mô tả đầu tiên của Crous & Slippers vào năm 2006 Trước đây N dimidiatum có nhiều tên gọi khác nhau như: Fusicoccum

dimidiatum, Scytalidium dimidiatum, Scytalidium lignicola, Hendersonula toruloidea N dimidiatum có cơ thể dạng sợi, đơn bào, phân nhánh có vách ngăn

sinh sản bằng hình thức sinh dưỡng đứt đoạn sợi nấm tạo cơ thể đơn bào hìnhtròn, bầu dục, chứa một hay nhiều nhân

2.4.1 Tình hình nghiên cứu bệnh loét trên thế giới

Trong năm 2008-2009, ở hầu hết các đồn điền trồng thanh long ở Malaysiaxuất hiện một bệnh mới gây loét cành thanh long Các triệu chứng quan sát thấy

là trên cành các đốm tròn nhỏ màu cam lõm xuống, quả cành màu đen và sau đócành bị mục nát Khảo sát 20 đồn điền ở Malaysia, triệu chứng loét cành đềuđược phát hiện ở tất cả 20 đồn điền khảo sát Trong tổng số 40 chủng nấm phânlập, Dựa trên các đặc điểm hình thái, giải trình tự vùng ITS và lây bệnh nhân tạo

trở lại cây thanh long cho thấy tác nhân gây bệnh là nấm Neoscytalidium

dimidiatum Đây cũng là báo cáo đầu tiên về bệnh loét hại thanh long gây ra bởi

N dimidiatum ở Malaysia (Masratul et al., 2013).

Bệnh loét được coi là bệnh gây hại nghiêm trọng nhất trên thanh long tại

Malaysia và được báo cáo đầu tiên bởi Masratul et al (2013b) N dimidiatum

phát triển nhanh trên môi trường, tốc độ tăng trưởng trung bình là 3,00 cm/ngàytrên môi trường PGA và MEA Bào tử đính có hình ellip đến hình trứng, hìnhque hoặc có dạng hình tròn, trong suốt với một đầu tròn, ban đầu là một váchngăn, sau thành màu nâu và có 2 vách ngăn khi thành thục, kích thước 10.99 ±0.35 x 5.02 ± 0.44 µm , các tế bào ở giữa màu đậm hơn các tế bào ở cuối Sợinấm vô tính phân nhánh, màu nâu, bào tử đốt có 0-1 vách ngăn Dựa trên trình tựDNA của vùng ITS, tất cả các mẫu phân lập có độ tương đồng 99% tương tự với

N dimidiatum (FJ648577) Bên cạnh ký chủ là thanh long, N dimidiatum đã

được báo cáo là tác nhân gây bệnh loét trên Citrus sinensis và Mangifera indica Theo Lan et al (2012), vào tháng 7 năm 2011 một bệnh trên thanh long đã

được tìm thấy tại thành phố Conghua và thành phố Yunfu tỉnh Quảng Đông,Trung Quốc, đặc trưng của bệnh là những đốm nhỏ màu nâu khi bệnh xuất hiện

Các điểm liên tục được mở rộng, và hình thành các vết loét rộng trên thân Nó

được xác định là do nấm N dimidiatum gây nên.

Đến năm 2012, Brown đã công bố báo cáo đầu tiên về nấm N dimidiatum

gây hại trên thanh long tại tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc Tháng 7 năm 2013,bệnh loét cũng đã xuất hiện tại Trạm Giang, tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc.Căn cứ vào đặc điểm hình thái và phân tích phân loài bằng trình tự ITS đã xác

định được nguyên nhân gây bệnh là nấm N dimidiatum gây ra.

Trong nghiên cứu của Chuang et al (2012) tại viện nghiên cứu sở nông

nghiệp, Đại học quốc gia Đài Loan, Trung Quốc, vào tháng 9 năm 2009 và

2010 loét đã xuất hiện ở một số cây thanh long tại Đài Loan Triệu chứng củabệnh là các vết nhỏ, tròn, vết bệnh lõm, màu cam Bệnh được xác định do nấm

N dimidiatum gây ra.

Tháng 7 năm 2013, Yi et al (2015) đã quan sát thấy bệnh thối màu nâu

trên thanh long ruột trắng ở Trạm Giang, Quảng Đông, Trung Quốc Căn cứvào đặc điểm hình thái và giải trình tự vùng ITS xác định được tác nhân gây

bệnh là nấm N dimidiatum.

Theo Ni et al (2013) nghiên cứu về nấm N dimidiatum trên thanh long

tại Đài Loan đã chỉ ra rằng: triệu chứng đầu tiên xuất hiện sau 2 tuần và quảcành hình thành sau 6 tuần kể từ thời điểm tiến hành lây bệnh nhân tạo Nhiệt

độ tối ưu cho sự tăng trưởng sợi nấm N dimidiatum và nảy mầm của bào tử là

N dimidiatum được báo cáo lần đầu tiên tại Australia liên quan đến bệnh

chết mầm của xoài (Ray, 2010) Tại Australia đã tiến hành khảo sát về sức khỏe cây trồng do Bộ nông nghiệp và thực phẩm Tây Australia kết hợp với kiểm dịch viên Australia thực hiện Tháng 8 năm 2008 trong cuộc khảo sát này các nhà nghiên cứu đã tiến hành phân lập các triệu chứng chết mầm trên cây xoài và rễ của cây sung, sau khi tiến hành phân lập đã phát hiện nguyên nhân gây bệnh làm

chết mầm, thối rễ, thối cây là do nấm Neoscytalidium spp gây ra

Neoscytalidium spp tiếp tục được phân lập và tiến hành giải trình tự một phần

DNA của vùng ITS kết quả xác định là do N dimidiatum (Fusicoccum

dimidiatum, Torula dimidiata, Scytalidium dimidiatum, Hendersonula toruloidea)

gây ra Trong cuộc khảo sát, N dimidiatum cũng được phân lập từ các mẫu xoài

lấy tại Derby, trong tháng 9 năm 2008, Broome vào tháng 9 năm 2008 và Đảo Bathurst, Northern Territory vào tháng 10 năm 2008 Sau khi phân lập các nhà

khảo sát đã tiến hành lây bệnh nhân tạo và tái phân lập theo quy tắc Koch đã thuđược kết quả tốt Tiến hành kiểm tra lại các chủng thu thập với các cuộc điều tra

trước (2005) các nhà khảo sát đã phát hiện rằng N dimidiatum đã xuất hiện và

gây hại tại Australia trong thời gian dài trước đó (phân lập từ cây có múi (Toruladimidiata (1914)) Theo báo cáo này, yếu tố nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sựphát triển gây hại của bệnh

N dimidiatum là loài nấm có phạm vi phân bố và có nhiều ký chủ: cây

dương mai, hạt dẻ, sung, vả, cây có múi, chuối, mận, và nhiều cây trồng khác ở

Mỹ (Farr et al., 1989) N dimidiatum còn gây hại trên xoài (Reckhaus, 1987) và nhất là trên thanh long (Brown, 2012) N dimidiatum gây nên các triệu chứng

như héo cành, chết mầm, thối, chảy gôm và làm cây chết Yếu tố quan trọng nhất

ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm N dimidiatum là độ ẩm (Punithalingam and

Waterson, 1970; Reckhaus, 1987; Elshafie and Ba-Omar, 2001)

Theo Polozzi và cộng sự (2008), vào tháng 9 năm 2008 một căn bệnh mới

đã được phát hiện và chú ý ở phía Sicily, Italy trong vườn cây cam ngọt 2 tuổi đãxuất hiện một bệnh mới với triệu chứng điển hình là chồi kém phát triển và thốitrên thân, cành, gốc ghép, vết thối chảy gôm Trong một thời gian ngắn xuất hiệnkhối bào tử của nấm màu đen dưới lớp vỏ cây và trên bề mặt vết thối Sau khi

phân lập trên môi trường PGA, xác định nấm có đặc điểm giống nấm Scytalidium

với các đặc điểm như sợi nấm màu nâu phân nhánh có vách ngăn, bào tử hìnhtrứng, elip, đỉnh tròn có 0 – 2 vách ngăn, màu nâu Sau khi phân lập tiến hànhkiểm tra bằng phương pháp PCR, DNA được chiết suất từ sợi nấm sau đó sửdụng các mồi V9G và ITS4 để khuếch đại operon rRNA hạt nhân kéo dài đầu 3'của gen 18S rRNA, các miếng đệm bên trong sao chép, gen rRNA 5.8S, và mộtphần của kết thúc 5' của gen 28S rRNA Sau khi phân tích trình tự DNA trên cơ

sở đặc điểm hình thái và các dữ liệu phân tử, bệnh đã được xác định là do nấm N.

dimidiatum gây ra.

Nghiên cứu về bệnh chết mầm cây nho ở ở Basrah, Iraq; Dựa vào đặc điểmhình thái, kết quả giải trình tự DNA của rDNA vùng ITS và lây nhiễm trở lại

trong điều kiện nhà kính, Abdullah et al (2012) đã xác định được tác nhân gây bệnh chết mầm cây nho là Lasiodiplodia theobromae và Neoscytalidium

dimidiatum Đây cũng là báo cáo đầu tiên về sự gây hại của N.dimidiatum trên

cây nho ở miền nam Iraq Sợi nấm N dimidiatum có màu nâu đến nâu đậm và

hình thành quả cành màu nâu sẫm đến màu đen trên cây nho bị bệnh

California là bang sản xuất 99% quả óc chó của Mỹ Tháng 8 năm 2012 tạiTulare County, có khoảng 5000 trong tổng số 90000 cây óc chó trong vườn ươm

bị chết bởi vết loét màu đen xung quanh gốc ghép Các vết loét xuất hiện ở phầntrên gốc ghép, sau đó lan rộng xuống các gốc ghép và chồi, dẫn đến cây bị chết

Các loại nấm phân lập từ vết loét đã được xác định là Lasiodiplodia citricola và

Neoscytalidium dimidiatum dựa trên đặc điểm hình thái và so sánh trình tự DNA.

Theo Chen et al (2013) thì đây là báo cáo đầu tiên về cái chết của cây óc chó ghép do L citricola và N dimidiatum trên thế giới.

N dimidiatum cũng được xem là tác nhân gây bệnh cơ hội và thông thường

bệnh xuất hiện có liên quan đến stress hoặc qua vết thương của cây ký chủ

(Slippers et al., 2004) Ngoài ra, N dimidiatum cũng được ghi nhận là nấm có

khả năng ký sinh hoặc nấm gây bệnh tiềm ẩn như theo báo cáo của Von Arx

(1987) dựa trên trường hợp nghiên cứu của cây xoài (Mangifera indica) bị nấm

N dimidiatum tấn công nhưng không biểu hiện triệu chứng và khi gặp điều kiện

thuận lợi thì triệu chứng mới xuất hiện

2.4.2 Tình hình nghiên cứu bệnh loét ở Việt Nam

Dịch hại chính trên thanh long gồm: Bệnh đốm trắng, (loét), bệnh thán thư,bệnh thối cành, thối quả, ruồi đục quả, rệp sáp,… trong đó bệnh đốm trắng gâythiệt hại nặng nhất (PPD, 2014)

Tại Bình Thuận, bệnh đốm trắng trên thanh long xuất hiện từ những năm

2009 -2010, và chỉ xuất hiện rải rác, cục bộ chủ yếu ở Cẩm Hang, thôn Đại Lộc,Hàm Hiệp, Hàm Thuận Bắc Từ cơn bão số 1 năm 2012 bệnh này đã xuất hiệntrở lại ở một số xã thuộc huyện Hàm Thuận Nam và Hàm Thuận Bắc và đến naylây lan rộng ở các vùng trồng thanh long của tỉnh gây thiệt hại lớn Năm 2012diện tích nhiễm là 827,5 ha trong đó nhiễm nặng từ 10 % trở lên là 785 ha tậptrung chủ yếu ở Hàm Thuận Bắc và Hàm Thuận Nam Năm 2013 diện tích nhiễm

là 8403 ha tăng 98,5 % so với năm 2012 tập trung chủ yếu ở các huyện HàmThuận Bắc, Bắc Bình và Hàm Thuận Nam (Chi cục BVTV Bình Thuận, 2014).Năm 2011, Viện Cây ăn quả miền Nam đã phân lập và xác định tác nhân

gây bệnh loét trên thanh long do nấm N dimidiatum gây ra Nấm này còn có tên khác là Scytalidium dimidiatum hay Scytalidium lignicola, Hendersonula

toruloidea, bệnh chủ yếu xuất hiện và tấn công mạnh vào mùa mưa, nhiệt độ

thuận lợi cho bệnh tấn công và lây lan mạnh Bệnh lây theo gió và nguồn nước

nhiễm bệnh Qua theo dõi thấy bệnh hại nặng ở những vườn có mực nước ngầmcao, những vườn vệ sinh kém, rậm rạp và bị che mát nhiều, vườn sử dụng nhiềuphân đạm hay bón phân chuồng chưa ủ hoai, vườn sử dụng nhiều chất kích thíchtăng trưởng hay vườn bón thiếu trung vi lượng đều có tỉ lệ bệnh cao hơnbình thường và khi có bệnh thì khó phòng trừ hơn Vết bệnh ban đầu là nhữngđốm tròn nhỏ màu trắng, hơi lõm, về sau chuyển sang màu vàng cam và khi bệnhphát triển nặng đốm bệnh trở thành vết loét có màu nâu, hơi nổi lên và gây ảnhhưởng nặng đến sinh trưởng của cây, năng suất và giá trị thương phẩm của quả.Bệnh thường gây hại trên bẹ non, nụ bông, quả non và giai đoạn chuẩn bị thuhoạch.

Bệnh loét thanh long, được các nhà nông dân còn gọi là bệnh đốm tắc kè,bệnh ma do đặc điểm hình dạng, màu sắc và giai đoạn phát triển của vết bệnh.Loét được coi là “bệnh lạ chưa có tên trong y văn”, hiện bệnh chưa có thuốc trịđặc hiệu Tại Việt Nam, bệnh loét xuất hiện rải rác vào năm 2008 ở BìnhThuận với diện tích và tỉ lệ nhiễm rất ít Năm 2009, khi những ổ dịch đầu tiênđược phát hiện ở Bình Thuận thì một số nhà chuyên môn nhận định trên báo chírằng: “Đây là bệnh do sinh lý, do thâm canh kém và thắp đèn quá mức” (Báođiện tử nông nghiệp) Mặc dù cũng có vài báo cáo công bố sơ lược về tác nhângây loét trên thanh long ở Việt Nam nhưng vẫn còn tồn tại nhiều vấn đề nghiêncứu cần làm sáng tỏ thêm ( Nguyễn Thành Hiếu và cs., 2011)

Năm 2014, tiếp tục nghiên cứu về bệnh đốm trắng thanh long, NguyễnThành Hiếu và cs đã phân lập tổng số 56 mẫu bệnh, bao gồm 42 mẫu cành và 14mẫu quả tại 2 tỉnh Tiền Giang và Long An, định danh thông qua việc trích DNA

và khuyếch đại vùng rDNA-ITS, giải trình tự gen 28S rRNA và tra cứu trênBLAST SEARCH; kiểm tra theo quy trình Koch cho thấy tác nhân gây bệnh đốm

trắng trên thanh long là do nấm N dimidiatum gây ra; Nấm N dimidiatum có khả

Theo nghiên cứu của Viện Bảo vệ thực vật, triệu chứng ban đầu xuất hiện ởphần gốc của bẹ non mới mọc Sau đó xuất hiện trên nụ bông, quả non Triệuchứng là những vết đốm tròn nhỏ màu trắng, vết bệnh lõm sâu vào trong và trũngthấp so với bề mặt bẹ; về sau, vết bệnh chuyển sang màu vàng cam và phát triểnthành màu nâu nổi lên trên bề mặt Bệnh tồn tại quanh năm trên đồng ruộng, mùakhô tập trung chủ yếu ở các đoạn gốc cành, khi mùa mưa tới thì bệnh lan sangcác cành non mới ra, hoa và quả Theo kết quả điều tra của viện Bảo vệ thực vật,bên cạnh sự xâm nhiễm của bệnh loét thì các bệnh khác đã xuất hiện và gây hạiđồng thời như bệnh thán thư, bệnh thối vi khuẩn

Đến đầu mùa mưa năm 2012 bệnh lây lan mạnh, với diện tích gần 1.000 ha,

tỷ lệ nhiễm nặng từ 10% trở lên chiếm trên 80% và bệnh đã có mặt ở khắp cácvùng trồng thanh long tập trung của Việt Nam như Bình Thuận, Tiền Giang vàLong An, đến tháng 6/2013 diện tích nhiễm bệnh loét đã lên đến gần 3.000 ha, tỷ

lệ gây hại từ 20 – 50%

Theo thống kê đến cuối năm 2013, diện tích thanh long bị nhiễm bệnh loétnhẹ ở tỉnh Bình Thuận là 800 ha, nặng 400 ha, trong tổng số 21 nghìn ha TiềnGiang, với gần 3.000 ha thanh long thì có đến 2.420 ha nhiễm bệnh loét nhẹ, diệntích nhiễm nặng 80 ha Long An, nhiễm loét nhẹ 766 ha, nặng 41 ha, trong tổng

số gần 2.700 ha và đang có xu hướng lây lan nhanh

Chỉ tính trong nửa đầu năm 2014, diện tích thanh long trồng mới ở các địaphương khoảng 3.376 ha, đưa diện tích thanh long toàn tỉnh Bình Thuận lên23.927 ha Với tốc độ phát triển nhanh như vậy, đồng nghĩa với tình hình sâubệnh hại xảy ra trên thanh long ngày càng phức tạp, nhất là bệnh loét, thán thư,gây nhiều thiệt hại cho nông dân Cụ thể, đến giữa tháng 7/2014, diện tích bịnhiễm bệnh loét trong toàn tỉnh là 4.785 ha, ảnh hưởng lớn đến người sản xuất ở

5 huyện và TP Phan Thiết Vào mùa mưa, bệnh loét trên thanh long thường pháttriển mạnh và lây lan nhanh Bệnh gây hại trên bẹ non, nụ bông, trái non và giaiđoạn chuẩn bị thu hoạch Lúc đầu triệu chứng trên bẹ/trái là những chấm nhỏ li tinhư kim, phát triển thành đốm tròn nhỏ màu trắng, vết bệnh trũng thấp so với bẹ,

về sau vết bệnh có màu vàng cam và phát triển nhô lên những vết ghẻ màu nâu

và đôi khi gây thối nhũn nếu bị bệnh tấn công nặng

Theo thống kê của Chi cục BVTV tỉnh Bình Thuận, đến cuối năm 2015,tổng diện tích thanh long nhiễm bệnh loét 1.675 ha, trong đó nhiễm nhẹ 1.600 ha,nhiễm trung bình 75 ha và không có diện tích nhiễm nặng Diện tích nhiễm bệnhgiảm 3.073 ha so cùng kỳ năm 2014 Đến thời điểm 24/11/2015, tổng diện tíchnhiễm bệnh loét là 4.799 ha Trong đó nhiễm nhẹ 3.818 ha (tỷ lệ bệnh < 5%);nhiễm trung bình 981 ha (tỷ lệ bệnh 5 - 25 %) Cụ thể, diện tích thanh longnhiễm bệnh ở huyện Hàm Thuận Bắc 2.808 ha, Hàm Thuận Nam 1.411 ha, BắcBình 516 ha Song song với bệnh loét, cây thanh long còn xuất hiện bệnh thánthư với diện tích nhiễm 561 ha, giảm 35 ha so với tuần trước và tăng 128 ha socùng kỳ năm 2014, phân bố trên toàn vùng trồng thanh long của tỉnh

Trong 06 tháng đầu năm 2016, tính đến ngày 21/6, toàn tỉnh có 2.035 hathanh long nhiễm bệnh loét Trong đó, có 1.669 ha nhiễm nhẹ (tỷ lệ bệnh từ 5 -

10%), 336 ha nhiễm trung bình (tỷ lệ bệnh từ 10 - 20%), 30 ha nhiễm nặng (tỷ lệbệnh từ 20 - 50%) Trong đó, huyện Hàm Thuận Bắc 1.019 ha, Hàm Thuận Nam

dimidiatum Sự nảy mầm của bào tử N dimidiatum bị ức chế bởi 80% Metiram,

50% Trifloxystrobin, Pyraclostrobin, azoxystrobin, azoxystrobin +Difenoconazole và Iminoctadine

Để kiểm soát có hiệu quả bệnh loét thanh long, Wang et al (2016) đã thử nghiệm hiệu lực của các loại thuốc hóa học đối với N dimidiatum trong điều kiện

phòng thí nghiệm , kết quả cho thấy Flusilazole 40EC, Difenoconazole 10WG,Carbendazim 50WP và Diniconazole 50 EC ở các nồng độ tương ứng lần lượt là0.0507mg / L, 0,131 7mg / L, 0,183 2mg / L và 0,173 1mg / L có hiệu quả caotrong việc chống lại tác nhân gây bệnh

2.5.2 Tại Việt Nam

Trước thực trạng dịch bệnh ngày càng gây hại nghiêm trọng, Viện Nghiêncứu cây ăn quả miền Nam đã tiến hành nghiên cứu, khảo nghiệm bằng nhiềuphương pháp khoa học, chuyển giao kỹ thuật và triển khai tập huấn “Quy trìnhquản lý tổng hợp sâu bệnh hại quan trọng trên thanh long” cho 480 nông dân ởBình Thuận và 79 nông dân ở Tiền Giang

Ngoài ra, Viện còn cử nhiều cán bộ đi kiểm tra, theo dõi định kỳ tại một số

xã trồng thanh long ở huyện Chợ Gạo, Tiền Giang Đồng thời đưa ra quy trình

“Quản lý bệnh loét trên thanh long tạm thời” để giúp nhà vườn nắm bắt và ứngdụng vào sản xuất

Tại buổi làm việc, lãnh đạo Viện Nghiên cứu cây ăn quả miền Nam đã đềxuất với Bộ NN-PTNT cho Viện tiếp tục nghiên cứu điều kiện phát sinh, pháttriển của dịch bệnh loét, nghiên cứu biện pháp vệ sinh vườn, xây dựng và chuyểngiao mô hình sản xuất phân hữu cơ vi sinh, sử dụng thuốc BVTV…Trước tìnhhình gây hại và lây lan của bệnh loét, Cục Bảo vệ thực vật đã ban hành quy trình

kỹ thuật (tạm thời) phòng chống bệnh loét, góp phần bảo vệ và phát triển sảnxuất cây thanh long theo hướng sản xuất an toàn, bền vững Cụ thể, về biện pháp

canh tác, nông dân cần vệ sinh cỏ dại, tỉa cành cho vườn thông thoáng Thườngxuyên kiểm tra vườn; không tưới nước vào chiều tối vì sẽ tạo điều kiện ẩm độcho bào tử nấm gây bệnh nảy mầm Loại bỏ những cành, quả bị bệnh, thu gomchôn lấp, rắc vôi bột tiêu hủy Bón phân cân đối; tăng cường bón lân, kali vàphân hữu cơ hoai mục để tăng sức đề kháng cho cây Đặc biệt, tuyệt đối khôngđược lấy giống giâm chiết cành từ những khu vực bị bệnh; không vận chuyểncành, quả bị bệnh từ khu vực có bệnh sang khu vực khác Về biện pháp hóa học,khi phát hiện bệnh loét mới xuất hiện, có thể sử dụng thuốc BVTV để phòng trừ;tạm thời sử dụng các loại thuốc gốc Mancozeb hoặc gốc đồng như CuprousOxide, Copper Hydroxide Sử dụng thuốc phải theo nguyên tắc 4 đúng và đảmbảo thời gian khuyến cáo trên bao bì.

Đánh giá hiệu quả của một số loại thuốc hóa học đối với bệnh đốm trắng gây hại trên thanh long của Nguyễn Thành Hiếu và cs., (2014) đã chỉ ra rằng: Trong điều kiện in vitro có 8 loại thuốc có khả năng ức chế hoàn toàn sự phát triển nấm N.dimidiatum là Cyat (Trifloxystrobin), Tilt supper (Propiconazole + Difenoconazole), Map super (Difenoconazole + Propiconazole), Map Unique (Tebuconazole + Tricyclazole), Sagorain (Difenoconazole + Propiconazole), Viroval (Iprodione), Ridomyl gld (Metalaxyl-M + Mancozeb) và Dithan (Mancozeb) Cũng trong nghiên cứu này, kết quả khảo sát hiệu quả của 20 loại thuốc đối với bệnh đốm trắng trên thanh long trên cành ở ngoài sản xuất cho thấy Dithan M45 có hiệu quả tốt nhất, kế đến là Ridomyl gold, Saiporra, Vicarben, Map Hero và Viroval Tương tự, Saipora (Carbendazim + Hexaconazole) cho hiệu quả tốt nhất, làm giảm chỉ số bệnh trên trái dưới 10%, kế đến là Rydomil gold (metalaxyl-M + Mancozeb), Dithan (Mancozeb) và Vicarben (Carbendazim)(Nguyễn Thành Hiếu và cs., 2014)

Báo cáo về Xây dựng mô hình quản lý tổng hợp bệnh đốm trắng (N.

dimidiatum) hại thanh long tại Bình Thuận, Viện BVTV (2014) đã có kết luận

như sau:

- Để phòng trừ bệnh hiệu quả cần: Quản lý tổng hợp, áp dụng các biện pháp;tỉa cành làm giảm tỷ lệ bệnh so với đối chứng (tỷ lệ bệnh có 18,3 % trong khi đóđối chứng là 80,5 %) Biện pháp thu gom và tiêu hủy cành bệnh cũng có tác độnglàm giảm tỷ lệ bệnh, tỷ lệ bệnh ở công thức thu gom và tiêu hủy cành bị bệnh là52,5 % khác hẳn so với đối chứng là 81,3 % Quản lý dinh dưỡng cũng góp phầnvào giảm tỷ lệ bệnh: Công thức bón phân tỷ lệ bệnh ở giai đoạn 1 tháng là

38,34 % và ở 3 tháng là 51,13 % so với nông dân là 63,64 % sau 1 tháng và71,71 % sau 3 tháng Chỉ số bệnh cũng giảm so với nông dân ở giai đoạn 3 thángchỉ số bệnh là 16,67 % còn của nông dân là 33,33 %.

- Biện pháp sử dụng thuốc hóa học, kết hợp với chất bám dính, giảm ảnhhưởng của mưa lớn đã có hiệu quả phòng trừ bệnh; Hoạt chất Mancozeb có hiệulực phòng trừ cao nhất, khi kết hợp với TB888 và rỉ đường hiệu lực của thuốc đãtăng cao hơn so với việc sử dụng thuốc đơn thuần ở cả hai vụ chính và nghịch.Tỷ

lệ bệnh tại công thức hỗn hợp Mancozeb với TB888 và rỉ đường vụ chính và vụnghịch giảm hơn hẳn so với nông dân

- Mô hình sử dụng chế phẩm sinh học ( 2 lần MXA-8/ lứa quả) trên thanhlong ruột đỏ 6 năm tuổi: Chính vụ: Tỷ lệ thanh long loại 1 của mô hình giá bán(15.000đ/kg) đạt 55,29% , loại 2 (3.000đ/kg) là 31,76%, tỷ lệ thanh long các loại

ở CT đối chứng, nhân dân sử dụng các loại hóa chất có loại 1 đạt 37,50 %, loại 2

là 53,12% Mô hình ứng dụng 2 lần MXA-8 trong lứa quả đầu tiên mang lại hiệuquả kinh tế cao hơn đối chứng 2.029.091đ/ ha Trái vụ : tỷ lệ thanh long của môhình loại 1 (45.000đ/kg) đạt 76,21%, loại 2 (10.000đ/kg) là 21,24% loại 3 (bỏ đi)

là 2,55% tỷ lệ thanh long đối chứng loại 1: 61,5%, loại 2 là 27,28%, loại 3 (bỏ đi)

là 11,14% mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn đối chứng 13.199.800 đồng/ ha

- Đối với thanh long ruột đỏ 2 năm tuổi: Chính vụ: tỷ lệ thanh long của môhình loại 1: 42%, loại 2 là 50%, loại 3 (bỏ đi) là 8%, ở công thức đối chứng tỷ lệthanh long loại 1: 40%, loại 2 là 45%, loại 3 (bỏ đi) là 15% Chênh lệch giữa môhình và đối chứng nông dân là 6,840,000 đồng/ha/lứa, hiệu quả kinh tế trong môhình cao hơn đối chứng Trái vụ tỷ lệ thanh long của mô hình vụ loại 1 là 73,12%

và đối chứng là 58,89%, loại 2 trên mô hình là 24,7% và đối chứng là 32,2%, loại

3 là 2,2% và bên đối chứng là 8,9% hiệu quả kinh tế trong mô hình cao hơnđốichứng 21,500,000 đồng/ ha

Bảng 2.4 Kết quả phòng chống bệnh loét trên cây thanh long trên địa bàn tỉnh Bình Thuận

(từ ngày 25/12/2015 đến ngày 15/4/2016)

- - 2

0

3

-

3 H

- - 1 3

1

-

9 H

- - 3

6

3

-

3 Ph

-an

13 - - 1

3

0 2

- - 0

2

1

-

1 La

-Gi

17 - - 1

7

0 4

- - 0

4

1

-

1 H

-à

-0 To

0 0 1 9

1

20

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU

3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

(Bình Thuận), Long An và Tiền Giang

môn Bệnh cây - Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam và Trung tâmKiểm dịch thực vật sau nhập khẩu I – Cục Bảo vệ thực vật

môn Bệnh cây, Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam và nhà lướicủa Trung tâm Kiểm dịch thực vật sau nhập khẩu I – Cục Bảo vệ thực vật

3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Từ tháng 8/2015 đến tháng 9/2016

3.3 ĐỐI TƯỢNG/ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.3.1 Đối tượng nghiên cứu

3.3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.3.2.1 Mẫu bệnh và các giống thanh long

long ruột trắng và ruột đỏ tại một số vùng trồng thanh long chính

ở Bình Thuận, Long An và Tiền Giang

cây thanh long khỏe của cả giống ruột trắng và ruột đỏ (thu thập từBình Thuận)

3.3.2.2 Dụng cụ, hóa chất

tủ định ôn, giấy quỳ, cân điện, buồng cấy vi sinh, đĩa petri, ống nghiệm,đĩa petri, dao mổ, que cấy nấm, khay đựng mẫu, bình phun,…

- Hóa chất và vật liệu để điều chế môi trường nuôi phân lập và cấy nấm(WA, PGA): Agar, khoai tây, đường glucose, cồn, nước cất, và các hóa chấtcần thiết khác.

PCR như đệm CTAB, cặp mồi chung ITS4 và ITS5

Nano STV)

(Chlorothalonil 75%) và Anvil 5SC (Hecxaconazole 50g/l )

3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

thanh long

và giải trình tự vùng ITS của nấm gây bệnh

kháng và chế phẩm Nano Bạc

long khỏe Tính tỷ lệ bệnh sau khi lây bệnh nhân tạo

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1 Phương pháp điều tra, thu thập mẫu bệnh, xác định phổ ký chủ

3.5.1.1 Phương pháp điều tra, thu thập mẫu bệnh

Theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra dịch hại câytrồng (QCVN 01-38: 2010/BNNPTNT (Bộ Nông nghiệp và PTNT ban hành kèmtheo Thông tư 71/2010/TT-BNNPTNT ngày 10/12/2010)

Thu thập mẫu thân, quả Thanh long có triệu chứng tại các vườn Thanh longtại Bình Thuận, Long An.Nguyên tắc chung cho việc thu mẫu bệnh hại: Mẫubệnh hại được thu thập theo 02 tài liệu:

- Roger Shivas and Dean Beasley ( 2005).

- McMaugh ( 2005) Hướng dẫn điều tra dịch hại thực vật ở Á Châu và khuvực Thái Bình Dương, ACIAR

3.5.1.2 Phương pháp điều tra, xác định phổ ký chủ

Thu thập các cây trồng xung quanh vườn trồng thanh long có triệu chứnggiống loét, phân lập, xác định nấm gây bệnh và lây bệnh nhân tạo theo quy tắcKoch

Các mẫu bệnh thu thập còn mới và có triệu chứng điển hình

3.5.2 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

3.5.2.1 Phân lập nấm gây bệnh

a) Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã sử dụng các loại môi trường nhântạo WA và PGA

Môi trường WA (Water agar)

Agar :20 gram

Nước cất :1000ml

Môi trường PGA - Potato Glucose Agar

Khoai tây: 200 gram

Glucose: 20 gram

Agar: 20 gram

Nước:1000 ml

b) Phân lập, nuôi cây, quan sát hình thái tản nấm Neoscytalidium dimidiatum trên môi trường nhân tạo

Mẫu bệnh loét được thu thập từ vùng trồng thanh long như Bình Thuận,Tiền Giang và Long An Trên quả và thân bị bệnh, lấy phần mô tiếp giáp giữavùng bệnh và vùng khỏe Các mẫu được rửa dưới vòi nước chảy, khử trungbằng cồn 70o trong 30-60 giây, sau đó rửa sạch bằng nước cất vô trùng Thấmkhô mẫu bệnh bằng giấy thấm vô trùng, dùng dao đã khử trùng cắt vết bệnhthành các miếng nhỏ 5x5mm, đặt vào môi trường WA Khi nấm đã phát triển

với kích thước 1-2cm, lấy phần đầu sợi nấm cấy truyền sang môi trường PGA.(Nấm được làm thuần bằng cách cấy đỉnh sinh trưởng của sợi nấm từ môitrường WA sang môi trường PGA (Burgess và cs., 2009).

Kiểm tra dưới kính hiển vi để xác định nấm gây bệnh Toàn bộ quá trìnhphân lập được thực hiện trong điều kiện vô trùng và cách ly trong buồng cấy Tiếptục cấy chuyển trên môi trường PGA để sử dụng làm nguồn nấm sử dụng cho các

giá độ thuần khiết của nấm qua quan sát mắt thường, đánh giá các chỉ tiêu về sựphát triển của sợi nấm và hình thành bào tử qua quan sát kính hiển vi quang học

Mô tả hình thái của tác nhân gây bệnh loét thanh long: dựa vào khóa phânloại của Ellis (1976)

3.5.2.2 Xác định nấm bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự vùng

ITS

a) Mẫu bệnh: Chọn các mẫu nấm đại diện theo vùng và theo giống cây trồng

(tổng cộng 6 mẫu) được nuôi cấy trên môi trường PGA từ 3 – 5 ngày ở nhiệt độ

(Cetyltrimethyl ammonium bromide) của Doyle & Doyle (1987)

Bước 3: Cho vào ống 500µl CTAB+ βME Nghiền nhỏ mẫu, lắc nhẹ