Nghiên cứu tạo đột biến in vitro và đánh giá sinh trưởng, phát triển, sai khác di truyền của các dòng đột biến giống hoa cẩm chướng quận chúa (dianthus caryophyllus l )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM VŨ HỒNG HIỆP NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN IN VITRO VÀ ĐÁNH GIÁ SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN, SAI KHÁC DI TRUYỀN CỦA CÁC DÒNG ĐỘT BIẾN GIỐNG HOA CẨM CHƯỚNG QUẬN CHÚA (DIANTHUS CARYOPHYLLUS L.) CHUYÊN NGÀNH : KHOA HỌC CÂY TRỒNG MÃ SỐ : 62.62.01.10 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI – 2014 Cơng trình hồn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn: PGS.TS NGUYỄN THỊ LÝ ANH Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Thị Phương Thảo Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phản biện 2: PGS.TS Lê Huy Hàm Viện Di truyền Nông nghiệp Phản biện 3: TS Đặng Văn Đông Viện Nghiên cứu Rau Luận án bảo vệ hội đồng chấm luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi , ngày tháng năm 2014 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Học viện Nơng nghiệp Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cẩm chướng bốn loài hoa cắt cành trồng phổ biến giới, chiếm 17% tổng sản lượng hoa cắt (Nguyễn Thị Kim Lý, 2012) Đây loại hoa có nhiều triển vọng sản xuất nội tiêu xuất Việt Nam Ở nước ta nay, chủ yếu trồng giống cẩm chướng nhập nội từ nước ngồi khơng chủ động chi phí sản xuất cao, đặc biệt mở rộng sản xuất xuất khơng có quyền giống Vì vậy, việc nghiên cứu chọn tạo giống hoa cẩm chướng đáp ứng nhu cầu thị trường, phù hợp với điều kiện sinh thái có quyền Việt Nam yêu cầu bӭc thiết Đối với hoa việc chọn tạo giống tập trung chủ yếu tạo giống có màu sắc Điều thực thông qua đường lai xa gây tạo đột biến Tuy nhiên hoa cẩm chướng nước ta việc lai xa khó thực khả thụ phấn thụ tinh khó Vì việc tạo giống có màu sắc thực thơng qua đường gây tạo đột biến Phương pháp chọn tạo giống gây tạo đột biến phát triển từ kỷ 20 ngày phát triển rộng rãi mang lại thành tựu to lớn công tác chọn tạo giống trồng Hơn nữa, việc gây tạo đột biến nhân tạo kết hợp với nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro trở thành công cụ hữu hiệu giúp giảm thiểu chi phí thời gian chọn tạo giống trồng Kỹ thuật làm tĕng tần số xuất đột biến với tính trạng có giá trị kinh tế lồi thực vật nói chung hoa nói riêng, góp phần không nhỏ cho việc cải tiến giống trồng (Okamura, 2006; Shu, 2009; IAEA, 2009, 2013) Xuất phát từ vấn đề nêu thực đề tài “Nghiên cứu tạo đột biến in vitro đánh giá sinh trưởng, phát triển, sai khác di truyền dòng đột biến giống hoa cẩm chướng Quận Chúa (Dianthus caryophyllus L.)” Mục tiêu đề tài Nghiên cứu phương pháp xử lý đột biến in vitro nhằm xác định phương pháp xử lý đột biến hiệu tạo dòng biến dị di truyền làm nguồn nguyên liệu cho công tác chọn tạo giống hoa cẩm chướng Yêu cầu đề tài - Xác định khả nhân giống in vitro cho cẩm chướng giống Quận Chúa, làm sở cho việc tái sinh tạo hoàn chỉnh mẫu xử lý đột biến in vitro tác nhân gây đột biến - Xác định hiệu xử lý gây tạo đột biến cho hoa cẩm chướng nuôi cấy mô mang lại hiệu cao: + Xác định nồng độ, thời gian xử lý EMS thích hợp cho chồi nhân in vitro hoa cẩm chướng + Xác định liều lượng xử lý tia gamma nguồn 60Co thích hợp cho chồi nhân in vitro hoa cẩm chướng + Xác định hiệu xử lý phối hợp EMS tia gamma nguồn 60Co cho chồi nhân in vitro hoa cẩm chướng - Phân lập thể đột biến qua hệ nhân chồi in vitro - Sàng lọc dạng biến dị cẩm chướng sau xử lý điều kiện tự nhiên - Đánh giá sai khác di truyền số dòng đột biến có triển vọng phân lập thị SSR - Xác định phương pháp khử trùng mẫu, môi trường nhân nhanh, môi trường rễ giá thể thích hợp cho số dòng đột biến có tiềm tuyển chọn Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 4.1 Ý nghĩa khoa học Kết nghiên cứu đề tài cung cấp dẫn liệu khoa học có giá trị việc ứng dụng nhân giống in vitro phương pháp tạo giống thông qua xử lý đột biến in vitro hoa cẩm chướng Các kết nghiên cứu đề tài sở để tiếp tục nghiên cứu tạo dòng đột biến làm nguồn nguyên liệu di truyền cho việc chọn tạo giống cẩm chướng Đồng thời tư liệu có giá trị cho việc nghiên cứu lĩnh vực công nghệ sinh học chọn tạo giống trồng 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Đề tài xây dựng quy trình nhân giống in vitro cho số dòng, giống hoa cẩm chướng, góp phần giải khó khĕn thực tiễn nhân giống nay; ứng dụng thành công phương pháp xử lý đột biến in vitro xây dựng quy trình xử lý gây tạo đột biến kết hợp nuôi cấy in vitro cho hoa cẩm chướng tác nhân EMS chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co; tạo vật liệu khởi đầu phục vụ cho công tác nghiên cứu chọn tạo giống hoa cẩm chướng chọn lọc số dòng đột biến có triển vọng Những đóng góp luận án Các kết nghiên cứu xác định tác nhân gây đột biến EMS tia gamma cho hiệu cao việc gây tạo biến dị có tiềm làm vật iệu cho công tác chọn tạo giống hoa cẩm chướng Đề tài tạo dòng đột biến có tiềm đánh giá đặc điểm sinh trưởng phát triển dòng đột biến mầu sắc hoa điều kiện tự nhiên Các dòng đột biến đánh giá sai khác di truyền thị phân tử SSR xác định mối quan hệ di truyền với mẹ Đề tài xây dựng quy trình nhân giống in vitro cho dòng đột biến có triển vọng (dòng H6 dòng H7) số dòng đột biến nêu trên, phục vụ cho nghiên cứu để phát triển hai dòng thành giống hoa cẩm chướng Giới hạn đề tài - Thời gian nghiên cứu từ nĕm 2009 – 2013 - Địa điểm nghiên cứu: Viện Sinh học Nông nghiệp – Học viện Nông nghiệp Việt Nam Bố cục luận án Nội dung luận án thể 130 trang, gồm: trang mở đầu, 34 trang tổng quan, 17 trang vật liệu nội dung phương pháp nghiên cứu, 73 trang kết thảo luận, trang kết luận kiến nghị 126 tài liệu tham khảo, 32 tài liệu tiếng Việt, 94 tài liệu tiếng Anh Kết nghiên cứu có 34 bảng số liệu 41 hình Phần phục lục hình ảnh minh họa kết xử lý số liệu Chương TỔNG QUAN TÀI Liệu Cẩm chướng loại hoa có giá trị kinh tế cao, chiếm tỷ lệ lớn loài hoa cắt cành giới (chiếm 17%) loài hoa xuất nước ta Việc đẩy mạnh sản xuất nâng cao chất lượng sản phẩm hoa cẩm chướng Việt Nam nhiều hạn chế, đề quyền giống khó khĕn việc tiếp cận thị trường hoa giới Đột biến đóng vai trò quan trọng chọn giống trồng, nhờ vào trình đột biến mà tạo nhiều giống hoa mới, đặc sắc có suất cao, khả chống chịu tốt, kháng sâu bệnh, lĩnh vực hoa cảnh nói riêng ngành chọn giống nói chung Xử lý gây tạo đột biến kết hợp ni cấy in vitro có nhiều ưu điểm so với phương pháp chọn giống truyền thống: tần số đột biến cao khả thu nhận thể đột biến đồng kiểu gen dễ dàng hơn; xử lý số lượng lớn tế bào, mô, mà khơng đòi hỏi diện tích lớn; sử dụng nhiều phận khác (tế bào, mô sẹo, chồi in vitro, đoạn thân, hạt, …); có khả rút ngắn thời gian so phương pháp truyền thống (chỉ cần - hệ) Các kết nghiên cứu tác giả chọn tạo giống đột biến hoa cẩm chướng cho thấy việc ứng dụng kỹ thuật gây tạo đột biến nhân tạo trồng nói chung hoa cẩm chướng nói riêng mang lại hiệu lớn Có nhiều giống hoa cẩm chướng với tính trạng tạo nhờ xử lý gây tạo đột biến Vì vậy, nói rằng, phương pháp chọn giống cẩm chướng loại hoa nói chung xử lý đột biến phương pháp đầy triển vọng công tác chọn tạo giống hoa cho sản xuất Chương ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu - Mắt ngӫ chồi in vitro hoa cẩm chướng thơm giống Quận Chúa (Tên khoa học Dianthus caryophyllus “Princess”; tên thương mại Princess) - Các thiết bị dụng cụ hóa chất ni cấy mơ tế bào - Phản ứng PCR-SSR tiến hành 20 mồi SSR hãng Bioneer (theo Smulders et al., 2003, Tetsuya et al., 2009) - Hóa chất dùng nghiên cứu sinh học phân tử Tris bazơ, agarose, isopropanol, Ethanol, chloroform, isoamylalcohol, CH3COONa, SDS, CTAB, Nacl, ETDA,… - Các hóa chất cho phản ứng PCR gồm deoxynucleotit triphosphat (dNTPs) Sigma, Taq-DNA polymeraza Fermentas 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Nghiên cứu nhân giống in vitro cho cẩm chướng giống Quận Chúa - Nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp khử trùng đến tỷ lệ sống mẫu - Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến hệ số nhân, sinh trưởng chồi in vitro: + Nghiên cứu ảnh hưởng BA kinetin môi trường MS đến hệ số nhân, sinh trưởng chồi in vitro + Nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp cytokinin auxin đến hệ số nhân, sinh trưởng chồi in vitro - Nghiên cứu ảnh hưởng α-NAA than hoạt tính mơi trường MS tới khả rễ chồi in vitro - Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống sinh trưởng in vitro vườn ươm 2.2.2 Nghiên cứu phương pháp xử lý gây tạo đột biến in vitro cho cẩm chướng - Nghiên cứu xử lý EMS cho hoa cẩm chướng in vitro - Nghiên cứu xử lý tia gamma nguồn 60Co cho hoa cẩm chướng in vitro - Nghiên cứu xử lý kết hợp EMS tia gamma nguồn 60Co cho cẩm chướng in vitro 2.2.3 Nghiên cứu phân lập d̩ng chồi in vitro biến dị sau xử lý đánh giá sinh trưởng phát triển d̩ng chồi - Nghiên cứu phân lập dạng chồi biến dị mặt hình thái - Nghiên cứu khả rễ dạng chồi phân lập sau xử lý - Nghiên cứu khả sinh trưởng phát triển dạng chồi điều kiện vườn ươm 2.2.4 Nghiên cứu sinh trưởng phát triển phân lập d̩ng biến dị cẩm chướng sau xử lý điều kiện tự nhiên Cây cẩm chướng sau xử lý đưa trồng nhà lưới, theo dõi phân lập dạng biến dị 2.2.5 Nghiên cứu đánh giá sai khác di truyền số dòng biến dị có triển vọng phân lập thị SSR Chọn lọc số dòng biến dị có tiềm đánh giá sai khác di truyền mӭc độ phân tử thị SSR 2.2.6 Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cho số dòng đột biến tuyển chọn - Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng đến tỷ lệ sống mẫu - Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến hệ số nhân, sinh trưởng chồi in vitro - Nghiên cứu ảnh hưởng auxin môi trường MS tới khả rễ chồi in vitro - Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống sinh trưởng in vitro vườn ươm 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm Các thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với lần nhắc lại 2.3.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitro môi trường MS (Murahige and Skoog, 1962) với 6,5 g/l agar, 30 g/l saccarose 100 mg/l innositol) có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng Các thí nghiệm nhân nhanh, tạo hồn chỉnh mẫu nuôi cấy nhiệt độ 20 – 220C, cưӡng độ chiếu sáng 2.000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giӡ/ngày Các cơng thӭc thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, cơng thӭc thí nghiệm bố trí 150 mẫu, chia làm lần nhắc lại 2.3.3 Phương pháp gây t̩ạo đột biến in vitro Phương pháp gây tạo đột biến tiến hành theo quy trình Novak and Brunner (1992) có cải tiến Mỗi cơng thӭc thí nghiệm xử lý lần nhắc lại lần 60 mẫu với liều lượng xử lý sau: - Xử lý gây tạo đột biến tác nhân EMS: Mẫu xử lý 50Gᵧ xuất dạng chồi: A, F, G, H, I K Ở liều hấp thu thấp 10Gᵧ thu dạng chồi A, F, H Đặc biệt tĕng liều lượng xử lý lên 60Gᵧ thu dạng chồi I K Ở liều lượng xử lý cao, tỷ lệ chồi biến dị cao nhiên số dạng chồi biến dị lại giảm Đặc biệt dạng chồi G, H (chồi có khả sinh trưởng phát triển tốt) có xu hướng giảm mạnh Bҧng 3.4 Tỷ lӋ chӗi biến dӏ dҥng chӗi sau xử lý tia gamma nguӗn 60Co Liều Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Tỷ lệ hấp thu A F G H I K biến (Gᵧ) (%) (%) (%) (%) (%) (%) dị (%) 10 20 30 40 50 60 70 96,20 89,68 64,04 52,99 41,54 22,34 0,00 0,00 3,80 6,53 9,53 10,72 18,00 25,12 0,00 0,00 0,00 0,00 7,39 13,69 8,92 8,37 0,00 0,00 0,00 3,79 7,39 8,93 6,77 8,37 0,00 0,00 0,00 0,00 6,35 6,54 10,16 13,71 16,67 0,00 0,00 0,00 5,29 7,14 14,61 22,09 83,33 0,00 3,80 10,32 35,96 47,01 58,46 77,66 100,0 0,00 Từ kết nghiên cứu xây dựng mơ hình tốn học biểu diễn mối quan hệ liều lượng xử lý tia gamma nguồn 60Co tỷ lệ chồi biến dị -8 -6 -4 Y= 7,255.10 x6 - 15,533.10 x5 + 12,865.10 x4 - 5,05.10 x3 -2 + 0,92x2 - 4,639x + 3,80 Trong đó: Y tỷ lệ chồi biến dị (%); X liều hấp thu (Gᵧ) 3.2.3 Nghiên cứu xử lý kết hợp EMS chiếu x̩ tia gamma nguӗn 60Co cho hoa cẩm chướng in vitro 3.2.3.1 Nghiên cứu ̫nh hưởng xử lý kết hợp EMS tia gamma nguồn 60Co tới sinh trưởng chồi in vitro hoa cẩm chướng Kết thí nghiệm cho thấy tĕng liều xử lý lên tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi giảm dần Trong cơng thӭc thí nghiệm, tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi đạt cao công thӭc CT1 (Tỷ lệ mẫu sống 87,33%, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi 89,33%), tỷ lệ mẫu sống thấp công thӭc CT12 (Tỷ lệ mẫu sống 24,67%, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi 60,00%) 3.2.3.2ảnh hưởng xử lý kết hợp EMS tia gamma nguồn 60Co đến phát sinh biến dị hình thái chồi in vitro Sau xử lý phân lập dạng chồi (Dạng A, dạng F, dạng G, dạng L, dạng M, dạng N, dạng O dạng P) Dạng A Dạng E Dạng G Dạng L Dạng M Dạng N Dạng O Dạng P Hình 3.3 Các dҥng chӗi sau xử lý kӃt hӧp EMS tia gamma nguӗn 60Co Số liệu thực nghiệm cho thấy có phụ thuộc tuyến tính tỷ lệ chồi biến dị hình thái vào liều lượng xử lý, liều lượng cao tỷ lệ chồi biến dị lớn Sự biến động số dạng chồi biến dị có xu hướng tương tự xử lý riêng rẽ EMS chiếu xạ tia gamma Khi tĕng liều xử lý tỷ lệ chồi biến dị có xu hướng tĕng lên, nhiên số dạng chồi lại có xu hướng giảm công thӭc xử lý với liều lượng cao Đặc biệt dạng chồi G (chồi có khả sinh trưởng phát triển tốt) xuất công thӭc CT4 đến CT10 Công thӭc CT5 xuất nhiều dạng chồi, dạng chồi tiềm có tỷ lệ cao (Dạng G: 9,12%) Xử lý kết hợp EMS tia gamma xuất nhiều dạng chồi biến dị hơn so với xử lý riêng rẽ hai tác nhân (Nguyễn Thị Lý Anh cs., 2009) 16 Bҧng 3.5 Tỷ lӋ chӗi biến dӏ dҥng chӗi Nồng Liều Dạng Dạng Công độ hấp thụ A F (%) thӭc EMS gamma (%) (%) (Gᵧ) 0,00 ĐC 95,92 4,73 0,0 0,0 CT1 86,79 5,33 0,1 10 79,65 11,63 CT2 0,1 20 71,26 8,48 0,1 30 CT3 72,66 7,98 0,2 10 CT4 57,50 18,40 CT5 0,2 20 37,89 13,27 0,2 30 CT6 45,96 15,48 CT7 0,3 10 34,34 18,49 0,3 20 CT8 29,49 16,36 0,3 30 CT9 39,62 25,52 0,4 10 CT10 28,90 27,87 0,4 20 CT11 27,77 0,4 30 CT 12 in vitro sau xử lý kӃt hӧp EMS tia gamma nguӗn 60Co Tỷ lệ Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng chồi G L (%) M N O P (%) biến dị (%) (%) (%) (%) 0,00 0,00 (%) 0,00 4,08 0,00 0,00 0,00 0,00 4,08 0,00 8,50 0,00 0,00 0,00 0,00 13.21 0,00 10,18 4,84 0,00 0,00 0,00 20,35 0,00 10,95 6,17 0,00 0,00 0,00 28,74 3,26 8,36 7,26 0,00 0,00 5,37 27,34 9,12 11,30 8,72 0,00 0,00 6,90 42,50 6,90 13,80 9,20 6,90 0,00 9,32 62,11 6,60 11,18 11,18 2,49 4,78 9,39 54,04 7,16 11,13 11,45 6,26 6,54 9,95 65,66 5,44 12,04 12,04 6,02 7,38 8,90 70,51 4,36 12,26 11,12 0,00 7,82 10,36 60,38 0,00 15,65 7,82 3,91 8,96 8,62 71,10 0,00 18,15 0,00 8,62 72,23 16 3.3 Nghiên cứu khҧ sinh trưởng dҥng chӗi in vitro 3.3.1 Nghiên cứu kh̫ rễ d̩ng chồi in vitro cẩm chướng sau xử lý Trong môi trường rễ, trừ dạng chồi G, dạng chồi biến dị có khả rễ thấp so với dạng chồi bình thưӡng Khả rễ cao dạng G (100%) thấp dạng chồi C (37,78%), đặc biệt dạng chồi I dạng chồi M khơng có khả sống cấy sang mơi trường rễ 3.3.2 Nghiên cứu sinh trưởng phát triển d̩ng chồi in vitro cẩm chướng sau xử lý điều kiện khí canh Các dạng chồi biến dị có khả sống sinh trưởng thân thấp nhiều so với dạng chồi bình thưӡng Tỷ lệ sống dạng chồi khác nhau, cao chồi dạng G (100%) sau chồi dạng A, B, H, D, E, F, L, P, K, Chồi dạng C, K có khả sống thấp (Dạng C: 3,33%; dạng K: 13,33%) Chồi dạng I, M, O khơng có khả sống điều kiện vườn ươm 3.3.3 Nghiên cứu sinh trưởng phát triển d̩ng chồi in vitro cẩm chướng sau xử lý giai đo̩n đồng ruộng Hầu hết dạng chồi khả điều kiện vườn ươm (dạng C, K, P) bị chết sau trồng ruộng Khả sống sinh trưởng dạng chồi giai đoạn ngồi đồng ruộng có tương đồng với giai đoạn phòng thí nghiệm giai đoạn khí canh Cụ thể dạng chồi G, A có khả sinh trưởng phát triển tương đối tốt, cho tỷ lệ sống cao 80%, thân phát triển tốt Các dạng chồi D, E, F, H, L, N có tỷ lệ sống thấp 3.4 Nghiên cứu ҧnh hưởng xử lý gây tạo đột biến đến phát sinh biến dị cẩm chướng giai đoҥn đồng ruộng Để đánh giá hiệu tác động tác nhân gây đột biến tiến hành phân lập dạng biến dị mặt hình thái khả sinh trưởng phát triển cẩm chướng giai đoạn đồng ruộng Qua theo dõi phân lập số dạng biến dị thời gian sinh trưởng, hình thái màu sắc hoa phân nhóm sau: 17 Nhóm 1: Biến dị hình thái lá: cuộn, hình ống Nhóm 2: Chồi nách phát triển Nhóm 3: Biến dị màu sắc hoa: H1: Hoa màu tím; H2: Hoa màu phấn hồng viền tím; H3: Hoa màu trắng viền đỏ; H4: Hoa màu trắng sọc tím; H5: Hoa màu trắng viền tím nhẹ, số cánh hoa khơng có viền tím; H6: Hoa trắng viền phấn hồng; H7: Hoa màu tím nhạt viền tím đậm Đối chứng Lá hình ống Đầu cuộn Chồi nách phát triển Hình 3.10 Một số dҥng biến dӏ vӅ hình thái thơn Đối chứng H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 Hình 3.4 Hình ҧnh số dҥng biến dӏ vӅ màu sắc hoa 3.4.1ảnh hưởng xử lý EMS đến phát sinh biến dị cẩm chướng giai đo̩n đồng ruộng Khi xử lý EMS xuất nhóm biến dị, có dạng biến dị màu sắc hoa (H1, H2, H4, H5, H7), dạng H3, H6 không xuất xử lý EMS Ở công thӭc xử lý nồng độ cao thời gian dài, biến dị hình thái thân xuất nhiều hơn, biến dị hoa tĕng chủ yếu dạng H5 (dạng biến dị khơng có lợi) Trong cơng thӭc thí nghiệm cơng thӭc CT7 (xử lý EMS nồng độ 0,4% thời gian giӡ) cho biến dị màu sắc hoa nhiều Đặc biệt dạng hoa H7 xuất công thӭc 18 3.4.2 Ҧnh hưởng xử lý chiếu xҥ tia gamma nguồn 60Co đến tỷ lệ biến dị cẩm chướng sau xử lý giai đoҥn đồng ruộng Kết nghiên cứu cho thấy xử lý chiếu xạ gamma xuất nhóm biến dị (biến dị hình thái biến dị màu sắc hoa), biến dị khả phát triển chồi nách mạnh không xuất Trong nhóm biến dị màu sắc hoa thu dạng (H4, H5, H6), dạng H1, H2, H3 H7 không xuất xử lý chiếu xạ gamma riêng rẽ Trong cơng thӭc thí nghiệm công thӭc CT3 (xử lý liều 30Gᵧ) cho biến dị màu sắc hoa nhiều Đặc biệt dạng hoa H7 xuất công thӭc 3.4.3ảnh hưởng xử lý kết hợp EMS chiếu x̩ tia gamma nguồn 60Co đến tỷ lệ biến dị cẩm chướng sau xử lý giai đo̩n đồng ruộng Kết nghiên cứu cho thấy việc xử lý kết hợp EMS chiếu xạ gamma làm tĕng tỷ lệ biến dị lên nhiều so với xử lý riêng rẽ EMS gamma Tỷ lệ biến dị đạt cao công thӭc CT5 (24,66%) thấp công thӭc CT1 (4,0%) Xử lý kết hợp EMS chiếu xạ gamma cho kết xuất nhóm biến dị (biến dị hình thái lá, biến dị phát triển chồi nách biến dị màu sắc hoa) Tuy nhiên, nhóm biến dị màu sắc hoa thu dạng (H1, H3, H4, H5 H7), dạng H2 H6 không xuất Kết nghiên cứu cho thấy xử lý kết hợp làm xuất thêm dạng (H3) Kết thực nghiệm cho thấy, dạng biến dị màu sắc tập chung chủ yếu dạng chồi A (dạng chồi bình thưӡng), số xuất dạng chồi B, F, G, H Dạng biến dị H5 chiếm tỷ lệ cao dạng chồi F Các dạng chồi D, E, L xuất biến dị hình thái khả phát triển chồi nách mạnh 3.4.4 Đặc điểm hình thái số d̩ng biến dị màu sắc hoa sau xử lý giai đo̩n đồng ruộng Về đặc điểm hình thái số dạng biến dị màu sắc hoa tiêu khác có khác Trong giai đoạn phát triển khác nhau, cá thể 19 dòng đột biến có tốc độ tĕng trưởng tương tự Trong giai đoạn 20 chuyển sang giai đoạn sinh trưởng sinh thực dòng bắt đầu có tốc độ phát triển khác dẫn đến chiều cao trung bình dòng bắt đầu có thay đổi Chiều cao dạng H1, H3, H4, H6, H7 dạng đối chứng tương đối đồng Dạng H5 có chiều cao trung bình thấp (98 ± 9,23cm) Kích thước hoa nở dao động từ 5,2 đến 7,1 cm Dạng H2, H3, H4 có kích thước lớn dạng đối chứng dạng lại Cấu trúc cánh hoa có khác biệt, bề mặt cánh hoa dạng đối chứng, H4 H5 gấp nếp, dạng H1, H2, H3, H6, H7 bề mặt cánh hoa phẳng; Rìa cánh hoa dạng H2 dạng H7 có khác biệt so với đối chứng dạng lại (rìa cánh hoa rĕng cưa nhẹ, nông) Độ rộng cánh hoa ngồi dạng đột biến có khác nhau, dạng H2, H3 H4 có độ rộng cm, dạng lại biến động từ 2,1 đến 2,8 cm Số lượng vòi nhụy dạng khơng có khác nhiên độ dài vòi nhụy dạng H1 dạng H3 vòi nhụy dài 3.5 Nghiên cứu đánh giá sai khác di truyền số dòng cẩm chướng kỹ thuұt SSR 3.5.1 Kết qu̫ phân tích nhân b̫n DNA với cặp mồi Kết phân tích đánh giá sai khác di truyền giống hoa cẩm chướng mӭc độ phân tử, DNA mẫu hoa cẩm chướng (gồm dòng đột biến H1, H2, H3, H4, H6, H7 giống Quận Chúa) nhân phương pháp PCR với 20 mồi SSR thu tổng số 150 bĕng với kích thước chiều dài nhỏ khoảng 100bp bĕng có kích thước lớn khoảng 1200bp Kết nghiên cứu cho thấy: Các dòng đột biến có khác biệt mặt di truyền so với giống gốc, sai khác lớn dòng H3 (hệ số tương đồng di truyền H3-H1: 0,5098) thấp dòng H4 (hệ số tương đồng di truyền H4-ĐC: 0,8293) Trong 20 cặp mồi SSR lựa chọn để nghiên cứu, mồi CB001a, CDB221 không phân biệt sai khác mặt di truyền dòng, giống hoa cẩm chướng nghiên cứu Mồi CB016a 21 cho sai khác mẫu đối chứng dòng khác, khơng có sai khác dòng biến dị nghiên cứu Mồi DCA221, CB047a, sử dụng để phân biệt dòng H7 với dòng khác đối chứng Cặp mồi cho kết đa hình cao CB004a, CB026a với tổng số bĕng thu tương ứng 13 11 3.5.2 Kết qu̫ phân tích hệ số PIC với cặp mồi Kết cho thấy hệ số PIC dao động từ 0,0 (các cặp mồi có đơn hình) đến giá trị cao 0,83 cặp mồi CB004a Hệ số PIC trung bình 20 cặp mồi dòng cẩm chướng nghiên cứu 0,26 cho thấy locus gen đa dạng 3.5.3 Đánh giá độ di truyền dòng cẩm chướng nghiên cứu Các dòng, giống cẩm chướng nghiên cứu có tỷ lệ dị hợp tử (H%) thay đổi từ 14,29% đến 29,41% Tỷ lệ dị hợp tử cao dòng đột biến H3 (29,41%) dòng H2, H6, H1, H4, ĐC H7 Tỷ lệ dị hợp tử thấp dòng H7 (14,29%) Kết cho thấy dòng, giống cẩm chướng nghiên cứu có độ di truyền cao 3.5.4 ảệ số đồng d̩ng mối quan hệ di truyền dòng, giống cẩm chướng Kết nghiên cứu cho thấy hệ số tương đồng di truyền dòng đột biến giống Quận Chúa dao động khoảng 0,5098 đến 0,8293 Mӭc sai khác di truyền lớn dòng H1-H3 (khoảng cách di truyển 0,4902) Cặp giống ĐC dòng H4 có tương đồng di truyền cao (khoảng cách di truyền 0,1707) Từ sơ đồ hình mối quan hệ di truyền mẫu giống cẩm chướng cho thấy mӭc độ sai khác di truyền giống có khác Ở mӭc tương đồng 0,75 chia dòng, giống cẩm chướng thành nhóm: Nhóm 1: Gồm giống ĐC dòng H4; Nhóm 2: Dòng H1; Nhóm 3: Dòng H2; Nhóm 4: Dòng H3; Nhóm 5: Dòng H6; Nhóm 6: Dòng H7 Kết phân tích DNA hồn tồn phù hợp với khác biệt dòng, giống nghiên cứu mặt hình thái đặc điểm thân lá, màu sắc, cấu trúc cánh hoa 22 Hình 3.5 Mối quan hệ di truyền dòng, giống cẩm chướng 3.6 Nghiên cứu nhân giống in vitro số dòng đột biến đѭӧc tuyển chọn 3.6.1ảnh hưởng chế độ khử trùng đến tỷ lệ sống mẫu Ở dòng H6 H7, cơng thӭc thí nghiệm, cơng thӭc sử dụng HgCl2 0,1% thời gian phút cho hiệu tốt (tỷ lệ mẫu sống đạt 76,33%; tỷ lệ mẫu nhiễm có 7,67%; thời gian phát sinh chồi sớm) 3.6.2 Đánh giá kh̫ nhân nhanh in vitro dòng cẩm chướng đột biến chọn lọc sau xử lý in vitro Kết cho thấy dòng H6, cơng thӭc bổ sung 0,5 mg/l kinetin + 0,5 mg/l BA thích hợp cho việc nhân nhanh in vitro Đối với dòng H7, cơng thӭc bổ sung 1,0 mg/l kinetin thích hợp cho việc nhân nhanh in vitro 3.6.3 Nghiên cứu ̫nh hưởng auxin đến kh̫ tạo in vitro hồn chỉnh hai dòng cẩm chướng H6 H7 Mơi trường tạo rễ tối ưu dòng H6 H7 có khác Đối với dòng H6 cơng thӭc (MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,25 mg/l α-NAA) tốt rễ dòng đột biến này, với dòng H7 môi trường tốt cho rễ in vitro MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,75 mg/l α-NAA Trên môi trường chồi in vitro không rễ thuận lợi mà chồi sinh trưởng phát triển tốt 23 3.6.4 Nghiên cứu ̫nh hưởng phương pháp đến tỷ lệ sống sinh trưởng in vitro vườn ươm Qua kết nghiên cho thấy công thӭc cho tỷ lệ sống cao đồng thời sinh trưởng phát triển tốt Trong loại giá thể nghiên cứu phương pháp địa canh sử dụng giá thể đất + trấu hun (1:1) cho dòng H6 H7 cho kết tốt Kết LUẬN VÀ Đӄ NGHӎ KӃt luận 1) Để nhân giống in vitro cho hoa cẩm chướng giống Quận Chúa sử dụng quy trình ni cấy sau: Khử trùng mẫu dùng HgCl2(0,1%) thời gian phút; giai đoạn nhân nhanh dùng mơi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l kinetin; giai đoạn tạo hồn chỉnh dùng mơi trường dinh dưỡng MS có bổ sung 0,5 g/l than hoạt tính + 0,25 mg/l α-NAA; thích ứng in vitro điều kiện tự nhiên phương pháp địa canh sử dụng giá thể đất + trấu hun (1:1) cho hiệu tốt 2) Xử lý gây tạo đột biến in vitro tác nhân gây đột biến EMS tia gamma làm giảm khả sống, khả phát sinh chồi, sinh trưởng đoạn thân mang mắt ngӫ cẩm chướng giống Quận Chúa (tỷ lệ sống giảm so với đối chứng từ 8,89 đến 78,89% xử lý EMS; từ 6,67 đến 98,0% xử lý chiếu xạ tia gamma; từ 8,00 đến 70,66% xử lý kết hợp EMS chiếu xạ tia gamma nguồn 60 Co 3) Xử lý gây tạo đột biến in vitro tác nhân gây đột biến EMS tia gamma nguồn 60Co làm làm tĕng tỷ lệ biến dị cho cẩm chướng nuôi cấy in vitro (từ 2,0 đến 18,66 lần so với đối chứng xử lý EMS; từ 2,67 đến 16,67 lần so với đối chứng xử lý chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co; từ 1,5 đến 9,24 lần so với đối chứng xử lý kết hợp EMS chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co) 4) Để gây tạo đột biến cho hoa cẩm chướng in vitro giống Quận Chúa đạt hiệu cao phương pháp xử lý hóa chất EMS, nồng độ thời gian xử lý thích hợp 0,4% thời 24 gian giӡ; phương pháp xử lý tia gamma nguồn 60Co, xử lý với liều 25 hấp thu 30 Gγ; phương pháp xử lý kết hợp EMS tia gamma nguồn 60Co nên xử lý EMS nồng độ 0,2% thời gian giӡ kết hợp chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co với liều hấp thu 20 Gγ Trong phương pháp gây tạo đột biến in vitro nghiên cứu, phương pháp xử lý gây tạo đột biến in vitro hóa chất EMS cho hiệu tốt hơn, cho tỷ lệ biến dị cao xuất nhiều biến dị có tiềm 5) Đề tài chọn lọc dòng đột biến màu sắc có tiềm phát triển thành giống (dòng H1, H2, H3, H4, H6 H7) Đánh giá sai khác di truyền dòng đột biến thị phân tử SSR cho thấy, dòng đột biến màu sắc có khác biệt mặt di truyền so với giống gốc Trong dòng H3 có sai khác di truyền lớn (hệ số tương đồng di truyền H3 - H1: 0,5098) sai khác di truyền thấp dòng H4 (hệ số tương đồng di truyền H4 - ĐC: 0,8293) 6) Do có khác cấu trúc di truyền nên cảm ứng với môi trường nuôi cấy in vitro dòng H6 H7 có khác Để nhân giống in vitro cho dòng đột biến H6 H7 sử dụng môi trường sau: Đối với dòng H6: Khử trùng mẫu dùng HgCl2(0,1%) thời gian phút; môi trường nhân nhanh phù hợp MS + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l kinetin; mơi trường phù hợp để tạo hồn chỉnh MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,25 mg/l α-NAA Khi đưa vườn ươm nên trồng sử dụng giá thể đất + trấu hun (1:1); Đối với dòng H7: Khử trùng mẫu dùng HgCl2 (0,1%) thời gian phút; môi trường nhân nhanh tạo hồn chỉnh thích hợp là: MS + 1,0 mg/l kinetin MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,75 mg/l α-NAA Khi đưa ngồi vườn ươm nên trồng sử dụng giá thể đất + trấu hun (1:1) ĐỀ nghӏ 1) Bổ sung kết nghiên cứu ni cấy in vitro vào quy trình vi nhân giống hoa cẩm chướng 2) Ứng dụng dòng đột biến gây tạo vào cơng tác chọn giống hoa cẩm chướng 3) Mở rộng phổ xử lý EMS tia gamma cho giống khác để tìm chế độ xử lý thích hợp cho giống nhằm tạo nguồn vật liệu cho ý nghĩa cho công tác chọn tạo giống cẩm chướng DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Vũ Hoàng Hiệp Nguyễn Thị Lý Anh (2013) Ảnh hưởng xử lý đột biến in vitro chiếu xạ gamma hoa cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.), Báo cáo khoa học Proceedings, Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học tồn quốc 2013, Quyển 2: Cơng nghệ sinh học Vi sinh, công nghệ sinh học Thực vật, NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ: 817 - 821 Vũ Hoàng Hiệp Nguyễn Thị Lý Anh (2013) Ảnh hưởng xử lý đột biến in vitro Ethyl methane sulphonate (EMS) kết hợp chiếu xạ tia gamma đến biến dị hoa cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.), Tạp chí Khoa học phát triển, 8: 1092 - 1100 ... 201 3) Xuất phát từ vấn đề nêu thực đề tài Nghiên cứu tạo đột biến in vitro đánh giá sinh trưởng, phát triển, sai khác di truyền dòng đột biến giống hoa cẩm chướng Quận Chúa (Dianthus caryophyllus. .. nhân giống in vitro phương pháp tạo giống thông qua xử l đột biến in vitro hoa cẩm chướng Các kết nghiên cứu đề tài sở để tiếp tục nghiên cứu tạo dòng đột biến l m nguồn nguyên liệu di truyền. .. in vitro - Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến tỷ l sống sinh trưởng in vitro vườn ươm 2.2.2 Nghiên cứu phương pháp xử l gây tạo đột biến in vitro cho cẩm chướng - Nghiên cứu xử l EMS cho hoa cẩm