Thực tập vi sinh đại cương bài giảng

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC  BÀI GIẢNG THỰC TẬP VI SINH ĐẠI CƯƠNG Biên soạn: ThS LÊ THỊ VU LAN KS PHẠM MINH NHỰT - 2008 - NỘI DUNG THỰC HÀNH -Bài số 1: Các quy tắc an tồn phòng thí nghiệm vi sinh vật Bài số 2: Các thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh phương pháp khử trùng Bài số 3: Thực hành pha môi trường dinh dưỡng Bài số 4: Phân lập – Nuôi cấy – Bảo quản vi sinh vật Bài số 5: Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi sinh vật kính hiển vi BÀI SỐ 1: CÁC QUY TẮC AN TỒN TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT -Thao tác an toàn yêu cầu quan trọng kiểm nghiệm vi sinh vật Khi làm việc với vi sinh vật, thường thao tác với số lượng lớn đậm đặc tế bào vi sinh vật (ở mức 109 tế bào/ml) Nhiều chủng vi sinh vật tác nhân gây bệnh nên cần luôn cẩn thận với tất chủng thao tác Mặt khác, nhân viên kiểm nghiệm phải sử dụng nhiều loại hóa chất, có acid hóa chất có độc tính Do vậy, cần tn thủ số quy tắc an toàn để đảm bảo an toàn cho thân cho người khác phòng thí nghiệm sau: - Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật - Không ăn uống, hút thuốc phòng kiểm nghiệm Mang trang thao tác với vi sinh vật - Mặc áo blouse thời gian làm việc - Trước bắt đầu làm cần sát trùng mặt bàn giấy lau tẩm cồn 700 dung dịch chất diệt khuẩn khác (lysol 5%, amphyl 10%, chlorox 10%), để khô Thực tương tự cho hai tay Chú ý chưa đốt đèn cồn đèn Bunsen tay chưa khô cồn Lặp lại việc sát trùng sau hồn thành cơng việc - Cần ghi tên chủng, ngày tháng thí nghiệm lên tất hộp petri, ống nghiệm môi trường, bình ni cấy - Khi lỡ tay làm đổ, nhiễm vi sinh vật nơi làm việc, dùng khăn giấy tẩm chất diệt khuẩn lau kỹ, sau thực khử trùng lại bàn làm việc - Cẩn thận thao tác với đèn cồn đèn Bunsen Tắt lửa chưa có nhu cầu sử dụng sau thực xong thao tác Lưu ý tránh đưa tay, tóc qua lửa Cần có cách bảo vệ tóc thích hợp trường hợp tóc dài - Sử dụng bóp cao su thao tác ống hút định lượng (pipette), không hút miệng - Khi làm vỡ dụng cụ thủy tinh, cẩn thận mang găng tay thu gom tất mảnh vỡ vào túi rác riêng - Tách riêng chất thải rắn chất thải lỏng - Tất chất thải rắn, môi trường chứa nhiễm vi sinh vật cần hấp khử trùng trước thải bỏ vào bãi rác Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vật cần ngâm vào dung dịch chất diệt khuẩn (nước javel) trước rửa tái sử dụng - Cần gói ràng băng keo đặt chồng đĩa petri lên - Không mở hộp petri dùng mũi ngửi để tránh nhiễm vi sinh vật vào đường hô hấp - Khi đốt que cấy có dính sinh khối vi sinh vật, cần đặt vòng đầu que cấy vào chân lửa để tránh văng nhiễm vi sinh vật vào khơng khí - Sát trùng rửa tay trước rời phòng thí nghiệm BÀI SỐ 2: CÁC THIẾT BỊ PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG I MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU Kiến thức lý thuyết: Củng cố kiến thức sau: - Ảnh hưởng nhân tố vật lý, hóa học tồn phát triển vi sinh vật + Nhân tố vật lý bao gồm: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, pH + Nhân tố hóa học bao gồm: acid, base, muối kim loại, cồn - Nguyên nhân gây nhiễm dụng cụ tiếp xúc với khơng khí, dụng cụ hay vật phẩm có vi sinh vật Kỹ thực hành: Hình thành rèn luyện kỹ năng: - Bao gói dụng cụ làm nút cho ống nghiệm - Khử trùng dụng cụ môi trường nồi hấp áp suất cao tủ sấy II MỘT SỐ DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH Các dụng cụ thủy tinh a Ống nghiệm: sử dụng để chứa môi trường nuôi cấy vi sinh vật, có nút gòn khơng thấm nước hay nhựa chịu nhiệt Nút gòn Ống nghiệm Hình 1: Ồng nghiệm b Đĩa petri: gồm nắp lớn đáy nhỏ úp lồng vào nhau, đường kính 8cm, 10cm, 12cm Hình 2: Đĩa petri c Ống hút (pipette) - Ống hút có chia độ - Ống hút Pasteur Nếu khơng có sẵn pipette Pasteur ta chế tạo từ ống thủy tinh đường kính 7mm, dài khoảng 25cm với đầu đốt tròn cạnh nhét gòn không thấm nước Để khoảng ống thủy tinh đẻn cồn, xoay thủy tinh chảy ra, mang khỏi lửa kéo tay ta có pipette Pasteur Gòn khơnĐ Ốn g è g thấmn hút nướcc Pas ồteur n Hình 3: Cách làm pipette Pasteur d Micropipettes (Pipetman) Đây pipet xác, cho phép ta hút lượng chất xác Hình 4: Micropipette e Các dụng cụ thủy tinh khác - Becher - Bình cầu đáy đáy tròn - Bình tam giác (Erlen) - Bình Roux Các dụng cụ thiết bị khác a Dây cấy - Dây cấy thẳng: sử dụng để cấy sâu hay ly trích vi sinh vật mơi trường đặc - Dây cấy vòng: dùng cấy ria vi sinh vật trên mặt thạch hay phân lập vi sinh vật môi trường lỏng môi trường đặc - Dây cấy thước thợ: dùng để cấy loại nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn Những loại dây cấy thường làm kim loại không bị oxy hóa nhiệt độ cao b Tủ ấm: dùng để ủ vi sinh vật theo dõi tăng trưởng vi sinh vật Hình 5: Tủ ấm c Lò Pasteur (xem phần sau) d Autoclave (xem phần sau) e Nồi chưng cách thủy III BAO GÓI DỤNG CỤ Nguyên tắc - Dụng cụ bao gói phải đảm bảo khô Quan sát tiêu ban c6 djnh m)t phuong phap ph6 bi�n nghiên cuu vi sinh v�t h;c có uu di�m sau: - Tuy thao tác phuc t�p nhung tieu ban c6 mau s&c dyp, gi· duQc lau - Cho phép ta quan sát rõ ràng hình d�ng c u t�o cua t� bào, d� dang d�m s6 luQng vi sinh v�t - Không sQ lay nhi�m làm vi�c v6i vi sinh v�t gay b�nh Các bước tiến hành tiêu cố định a Làm vết bôi - Ch;n lame s�ch khô - L y sinh kh6i vi sinh v�t cho vào gi·a lame - D� v�t b6i kh6 t\X nhiên khơng khí - Chú ý: • LuQng vi sinh v�t l y vua phai • V�t b6i tròn g;n, th�t mong • Các t� bào vi sinh v�t duQc dan d�u d� quan sat b Cố định vết bôi - Vi�c c6 djnh v�t b6i nh�m cac m,c dich sau: • Gi�t ch�t vi sinh v�t d� chung d� b&t màu an toàn ti�p xuc • G&n ch?t vi sinh v�t vao lame d� luc rua kh6ng bj tr6i m�u - Các cách c6 djnh:  C6 djnh b�ng nhi�t • La phuong phap don gian ph6 bi�n nh t • Dùng kyp g6 hay kyp s&t d� kyp lame • Ho m?t du6i cua lam ng;n lua dèn c6n, tranh kh6ng d� qua n6ng  C6 djnh b�ng h6a ch t: • Cách phuc t�p nhung kh6ng gay bi�n d�ng t� bào, không gây bi�n d6i c u truc t� bao va kh6ng lam dut cac tiên mao • Dùng hóa ch t la ruQu va aceton d� c6 djnh v�t b6i • Cách c6 djnh: ¬ Nhúng v�t b6i vao ruQu V6i ruQu ethylic ngam - 15 phút, v6i ruQu methylic ngam - phút ¬ Ngâm v�t b6i vào dung djch aceton 15 phut ¬ Nho vài gi;t ruQu 95% lên v�t b6i D6t chay d�y t&t Làm nhu v�y vài lfrn r6i d� kh6 Nhuộm màu tiêu cố định a Nguyên tắc - Su d,ng thu6c nhu)m c6 kha nang thfim th u qua màng t� bào k�t hQp v6i thành phfrn khac cua t� bào thành nh·ng hQp ch t mau d?c trung b�n v·ng - Tùy theo m,c dich nghiên cuu kha nang b&t màu khác cua nh·ng thành phfrn t� bào mà ch;n lo�i thu6c nhu)m cách nhu)m cho phù hQp - Có cách nhu)m chinh: • Nhu)m don: Chi dùng m)t lo�i thu6c nhu)m tiêu ban • Nhu)m kep: Dung d6ng th'i hay nhi�u lo�i thu6c nhu)m tiêu ban b Cách nhuộm - D?t tiêu ban lên cfru thuy tinh - Nho vào v�t b6i vài gi;t Fuchsin, d� yên - phút - Rua v�t b6i b�ng cach nghiêng lame, dùng bình tia xjt nu6c cho chay nhy qua v�t b6i cho d�n kh6ng màu n·a - Dùng gi y th m kh6 tiêu ban ho?c ho nhy tiêu ban tren den c6n - Quan sát tiêu ban J v�t kinh X40 X100 dùng dfru soi V QUAN SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC NHÓM VI SINH VẬT Quan sát đặc điểm sinh học vi khuẩn (Bacteria) a Các đặc trưng sinh học cần quan sát vi khuẩn - Các ki�u hình d�ng cua t� bào - Các ki�u liên k�t gi·a cac t� bào - Kha nang di d)ng - Kha nang hình thành bào tu - Nhu)m Gram b Cách quan sát Quan sát cầu khuẩn - Làm tiêu ban gi;t ep v6i 6ng th�ch nghiêng c y vi khufin Sarcina lutea - Quan sát tiêu ban kính hi�n vi v6i v�t kinh X40 - u cầu: • Ve hình d�ng t� bào, ki�u liên k�t gi·a cac t� bào • Nh�n xét v� s\X chuy�n d)ng cua t� bào Quan sát trực khuẩn - Làm tiêu ban gi;t ep v6i vi khufin E.Coli m6i tru'ng djch th� (1) - Làm tiêu ban nhu)m don v6i vi khufin Bacillus subtilis nuôi c y th�ch nghiêng (2) - Yêu cầu: • Tiêu ban 1: quan sat J v�t kinh X40 Ve hình, nh�n d�ng s\X chuy�n d)ng cua t� bào • Tiêu ban 2: quan sat J v�t kinh X40 X100 b�ng dfru soi • Ve hình nh�n xet v� hình d�ng t� bào; hình d�ng, s6 luQng vj tri cua bào tu t� bào Quan sát xoắn khuẩn - Làm tiêu ban c6 djnh nhu)m màu v6i b\Xa rang d� quan sat vi khufin Vibrio, Spirochae, Spirillum - Chú ý: dung tam l y b\Xa rang làm v�t b6i - L y b\Xa rang vua phai, dan d�u m6i quan sat duQc - Quan sát J v�t kinh X40 X100 b�ng dfru soi - Ve hình d�ng xo&n khac cua vi khufin (xo&n tu vòng d�n nhi�u vòng) a) b) c) Hình 13: Các hình dạng vi khuẩn a) cfru khufin b) tr\Xc khufin c) phfiy khufin hay xo&n khufin Quan sát đặc điểm sinh học xạ khuẩn (Actinomycetes) a Các đặc điểm sinh học đặc trưng cần quan sát - Hình d�ng bào tu - D?c di�m cu6ng sinh bào tu - Phuong thuc hình thành chu6i bào tu b Cách quan sát - Làm tiêu ban gi;t ep v6i Streptomyces grisea th�ch nghiêng (khi làm tiêu ban phai dùng que c y dfru nh;n dìm khufin ty x� khufin gi;t nu6c tách r'i sQi, sau d6 d�y lamelle r6i quan sat) - Làm tiêu ban nhu)m don v6i x� khufin - Yêu cfru: Quan sat tiêu ban J v�t kinh X10 X40 Ve hình nh�n xet hình d�ng chung cua x� khufin - Làm tiêu ban quan sat cu6ng sinh bào tu: • C y x� khufin vao m6i tru'ng d1a petri • Dùng lamelle c&m vào b� m?t th�ch nghiêng m)t g6c 45 • D�y d1a petri thich hQp u J nhi�t d) thich hQp • Sau d6 l y lamelle ra, d�y lên lame quan sát - Làm tiêu ban quan sat bào tu • Dùng lame n nhy lên m?t th�ch dã có x� khufin m;c • Quan sát kính hi�n vi v6i v�t kinh X100 • Ve hình nh�n xet v� cu6ng sinh bào tu bào tu x� khufin Quan sát đặc điểm sinh học nấm mốc (Molds) a Các đặc điểm sinh học đặc trưng cần quan sát - D?c di�m cua sQi n m: màu s&c, c6 vach ngan hay kh6ng? - D?c di�m cua co quan sinh san: hình d�ng, cach s&p x�p cac b) ph�n cua co quan sinh san - Hình d�ng, c u t�o, cách s&p x�p cua bào tu b Cách quan sát - Làm tiêu ban n m m6c kh6ng nhu)m màu • Nho gi;t lactophenol lên lame • Dùng que c y l y khufin l�c n m Penicillum ho?c Aspergillus niger dàn mong • D�y lamelle quan sát J v�t kinh X10 X40 Ve hình nh�n xet chung hình d�ng cua sQi n m; vj tri, hình d�ng, cach s&p x�p chung cua bào tu, th� bình, cu6ng th� bình, cu6ng bào tu dinh cua lo�i n m m6c - Làm tiêu ban n m m6c nhu)m màu: • Nho gi;t dung djch xanh cotton lên lame • L y it sQi n m dan d�u lame • D�y lamelle quan sát J v�t kinh X40 • Ve hình c u t�o sQi n m va co quan sinh san Quan sát đặc điểm sinh học nấm men (Yeasts) a Những đặc điểm sinh học cần quan sát - Hình thái, kích thu6c t� bào n m men - S\X nfiy ch6i cua n m men - Hình d�ng, s6 luQng bào tu tui bào tu b Cách quan sát - Làm tiêu ban nhu)m don n m men c y m6i tru'ng xanh methylen Loffler - u cầu: • Quan sát kính hi�n vi J v�t kinh X40 X100 • Ve hình thích màng t� bào ch t, kh6ng bào cua t� bào VI PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM Hóa chất – nguyên liệu - dụng cụ a Hóa chất – Nguyên liệu Hóa chất - Các lo�i thu6c nhu)m - Nu6c mu6i sinh ly: dung djch NaCl 0,85% Nguyên liệu - Các 6ng th�ch nghiêng nuôi c y cac gi6ng vi sinh v�t: B.subtilis, E.Coli b Dụng cụ - Ong nghi�m d\Xng nu6c c t v6 trùng - Lame, lamelle - Que c y, dèn c6n, diêm quyt - Bình d\Xng nu6c rua tiêu ban - Ch�u thuy tinh - C6c thuy tinh, cfru thuy tinh - Kính hi�n vi, dfru soi kinh - Gi y l;c, kyp s&t Nguyên tắc nhuộm gram D\Xa kha nang b&t màu cua t� bào ch t màng t� bào v6i thu6c nhu)m tim k�t tinh iod mà hình thành nên hai lo�i phuc ch t khac - Lo�i phuc ch t thu nh t v�n gi· nguyên màu cua thu6c nhu)m nên không bj rua tr6i xu ly b�ng c6n Vi sinh v�t c6 phuc ch t vi khufin gram duong - Lo�i phuc ch t thu hai kh6ng gi· duQc màu cua thu6c nhu)m nên m t màu xu ly b�ng c6n b&t màu cua thu6c nhu)m b6 sung Vi sinh v�t c6 phuc ch t thu)c lo�i gram am Các bước tiến hành - Làm tiêu ban • Dùng que c y l y nu6c v6 trung d� làm v�t b6i tren lame (hai dfru gi·a lame) • Dùng que c y l y m)t chut sinh kh6i làm v�t b6i theo thu t\X sau:  Bên trái lame B.subtilis  Bên phai lame E.Coli  gi·a lame B.subtilis tr)n l�n v6i E.Coli • D� kh6 v�t b6i khơng khí ho?c c6 djnh nhy tren den c6n - Nhu)m tiêu ban: • D?t mi�ng gi y l;c lên v�t b6i • Nhu)m tiêu ban b�ng thu6c nhu)m tim k�t tinh qua gi y l;c phut • Nhu)m lugol phut • Rua nu6c • Tfiy c6n 30 giay, d� nghiêng tiêu ban, nho tu tu tung gi;t c6n cho d�n tan h�t màu • Rua nu6c • Nhu)m b6 sung Fuchsin ho?c safranin tu 10 - 30 giây • Rua nu6c • Làm khô soi tiêu ban v6i v�t kinh dfru - K�t qua: • V6i v�t b6i cua B.subtilis màu tím - gram duong • V�t b6i tr)n B.subtilis + E.Coli có màu h6ng l�n màu tím • V�t b6i cua E.Coli màu h6ng - gram âm Hình 14: Các bước nhuộm gram Hình 15: Kết sau nhuộm gram CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP 1) Th\Xc hành làm tiêu ban gi;t ep d6i v6i vi khufin E.Coli Ve hình thích d?c di�m quan sat duQc 2) Th\Xc hành làm tiêu ban nhu)m don v6i vi khufin B.subtilis, vi khufin b\Xa rang Ve hình thích d?c di�m quan sat duQc 3) Làm tiêu ban nhu)m màu A.niger Ve hình thích co quan mang bao tu cua chung 4) Trình bày nguyên t&c ý ngh1a cua vi�c nhu)m kep 5) Nêu tên lo�i thu6c nhu)m su d,ng nhu)m gram 6) Trình bày cua nguyên t&c nhu)m gram 7) Tóm t&t phuong phap nhu)m gram Ve hình, thích k�t qua nhu)m gram ... dinh dưỡng Bài số 4: Phân lập – Nuôi cấy – Bảo quản vi sinh vật Bài số 5: Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi sinh vật kính hiển vi BÀI SỐ 1: CÁC QUY TẮC AN TỒN TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT...NỘI DUNG THỰC HÀNH -Bài số 1: Các quy tắc an tồn phòng thí nghiệm vi sinh vật Bài số 2: Các thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh phương pháp khử trùng Bài số 3: Thực hành pha môi... cầu quan trọng kiểm nghiệm vi sinh vật Khi làm vi c với vi sinh vật, thường thao tác với số lượng lớn đậm đặc tế bào vi sinh vật (ở mức 109 tế bào/ml) Nhiều chủng vi sinh vật tác nhân gây bệnh