Bài giảng thực tập vi sinh đại cương

Bài giảng thực tập vi sinh đại cương

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÀI GIẢNG THỰC TẬP VI SINH ĐẠI CƯƠNG Biên soạn: ThS LÊ THỊ VU LAN KS PHẠM MINH NHỰT - 2008 - NỘI DUNG THỰC HÀNH -Bài số 1: Các quy tắc an tồn phịng thí nghiệm vi sinh vật Bài số 2: Các thiết bị phịng thí nghiệm vi sinh phương pháp khử trùng Bài số 3: Thực hành pha môi trường dinh dưỡng Bài số 4: Phân lập – Nuôi cấy – Bảo quản vi sinh vật Bài số 5: Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi sinh vật kính hiển vi BÀI SỐ 1: CÁC QUY TẮC AN TỒN TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT -Thao tác an toàn yêu cầu quan trọng kiểm nghiệm vi sinh vật Khi làm việc với vi sinh vật, thường thao tác với số lượng lớn đậm đặc tế bào vi sinh vật (ở mức 109 tế bào/ml) Nhiều chủng vi sinh vật tác nhân gây bệnh nên cần luôn cẩn thận với tất chủng thao tác Mặt khác, nhân viên kiểm nghiệm phải sử dụng nhiều loại hóa chất, có acid hóa chất có độc tính Do vậy, cần tn thủ số quy tắc an toàn để đảm bảo an toàn cho thân cho người khác phịng thí nghiệm sau: - Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật - Không ăn uống, hút thuốc phòng kiểm nghiệm Mang trang thao tác với vi sinh vật - Mặc áo blouse thời gian làm việc - Trước bắt đầu làm cần sát trùng mặt bàn giấy lau tẩm cồn 700 dung dịch chất diệt khuẩn khác (lysol 5%, amphyl 10%, chlorox 10%), để khô Thực tương tự cho hai tay Chú ý chưa đốt đèn cồn đèn Bunsen tay chưa khô cồn Lặp lại việc sát trùng sau hồn thành cơng việc - Cần ghi tên chủng, ngày tháng thí nghiệm lên tất hộp petri, ống nghiệm môi trường, bình ni cấy - Khi lỡ tay làm đổ, nhiễm vi sinh vật nơi làm việc, dùng khăn giấy tẩm chất diệt khuẩn lau kỹ, sau thực khử trùng lại bàn làm việc - Cẩn thận thao tác với đèn cồn đèn Bunsen Tắt lửa chưa có nhu cầu sử dụng sau thực xong thao tác Lưu ý tránh đưa tay, tóc qua lửa Cần có cách bảo vệ tóc thích hợp trường hợp tóc dài - Sử dụng bóp cao su thao tác ống hút định lượng (pipette), không hút miệng - Khi làm vỡ dụng cụ thủy tinh, cẩn thận mang găng tay thu gom tất mảnh vỡ vào túi rác riêng - Tách riêng chất thải rắn chất thải lỏng - Tất chất thải rắn, môi trường chứa nhiễm vi sinh vật cần hấp khử trùng trước thải bỏ vào bãi rác Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vật cần ngâm vào dung dịch chất diệt khuẩn (nước javel) trước rửa tái sử dụng - Cần gói ràng băng keo đặt chồng đĩa petri lên - Không mở hộp petri dùng mũi ngửi để tránh nhiễm vi sinh vật vào đường hơ hấp - Khi đốt que cấy có dính sinh khối vi sinh vật, cần đặt vòng đầu que cấy vào chân lửa để tránh văng nhiễm vi sinh vật vào khơng khí - Sát trùng rửa tay trước rời phịng thí nghiệm BÀI SỐ 2: CÁC THIẾT BỊ PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG I MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU Kiến thức lý thuyết: Củng cố kiến thức sau: - Ảnh hưởng nhân tố vật lý, hóa học tồn phát triển vi sinh vật + Nhân tố vật lý bao gồm: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, pH + Nhân tố hóa học bao gồm: acid, base, muối kim loại, cồn - Nguyên nhân gây nhiễm dụng cụ tiếp xúc với khơng khí, dụng cụ hay vật phẩm có vi sinh vật Kỹ thực hành: Hình thành rèn luyện kỹ năng: - Bao gói dụng cụ làm nút bơng cho ống nghiệm - Khử trùng dụng cụ môi trường nồi hấp áp suất cao tủ sấy II MỘT SỐ DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH Các dụng cụ thủy tinh a Ống nghiệm: sử dụng để chứa môi trường nuôi cấy vi sinh vật, có nút gịn khơng thấm nước hay nhựa chịu nhiệt Nút gịn Ống nghiệm Hình 1: Ồng nghiệm b Đĩa petri: gồm nắp lớn đáy nhỏ úp lồng vào nhau, đường kính 8cm, 10cm, 12cm Hình 2: Đĩa petri c Ống hút (pipette) - Ống hút có chia độ - Ống hút Pasteur Nếu khơng có sẵn pipette Pasteur ta chế tạo từ ống thủy tinh đường kính 7mm, dài khoảng 25cm với đầu đốt tròn cạnh nhét gịn khơng thấm nước Để khoảng ống thủy tinh đẻn cồn, xoay thủy tinh chảy ra, mang khỏi lửa kéo tay ta có pipette Pasteur Gịn khơng thấm nước Đèn cồn Ống hút Pasteur Hình 3: Cách làm pipette Pasteur d Micropipettes (Pipetman) Đây pipet xác, cho phép ta hút lượng chất xác Hình 4: Micropipette e Các dụng cụ thủy tinh khác - Becher - Bình cầu đáy đáy trịn - Bình tam giác (Erlen) - Bình Roux Các dụng cụ thiết bị khác a Dây cấy - Dây cấy thẳng: sử dụng để cấy sâu hay ly trích vi sinh vật mơi trường đặc - Dây cấy vịng: dùng cấy ria vi sinh vật trên mặt thạch hay phân lập vi sinh vật môi trường lỏng môi trường đặc - Dây cấy thước thợ: dùng để cấy loại nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn Những loại dây cấy thường làm kim loại không bị oxy hóa nhiệt độ cao b Tủ ấm: dùng để ủ vi sinh vật theo dõi tăng trưởng vi sinh vật Hình 5: Tủ ấm c Lò Pasteur (xem phần sau) d Autoclave (xem phần sau) e Nồi chưng cách thủy III BAO GÓI DỤNG CỤ Nguyên tắc - Dụng cụ bao gói phải đảm bảo khơ - Bao gói phải kín cẩn thận để sau khử trùng đảm bảo vô trùng dụng cụ lớp giấy gói lấy sử dụng dễ dàng Phương pháp bao gói dụng cụ Việc bao gói dụng cụ gồm khâu: - Làm nút bông: cho ống nghiệm, bình tam giác, pipet, que trang - Bao gói: cho hầu hết dụng cụ khác a Cách làm nút bơng - Với ống nghiệm: Lấy không thấm nước cuộn lại Dùng que tre ấn vào cuộn Đẩy cuộn gập đôi từ từ vào miệng ống nghiệm Yêu cầu:  Nút có kích thước độ chặt vừa phải  Đầu nút trịn, gọn, phần ngồi lớn phần  Lấy nút hay đóng vào dễ dàng - Với chai, lọ, bình tam giác có kích thước lớn: cách làm tương tự sử dụng lượng nhiều - Với pipet: dùng sợi dây thép nhỏ nhét bơng vào đầu lớn pipet để hạn chế khơng khí từ miệng người hút vào pipet b Cách bao gói dụng cụ Với dụng cụ sau làm nút cần bao gói phần có nút bơng giấy báo để khử trùng nút không bị ướt đảm bảo điều kiện vô trùng tốt Cách làm sau: - Cắt đoạn băng giấy hình chữ nhật với kích thước tùy theo dụng cụ cần bao gói - Quấn quanh phần đầu có nút bơng - Cột lại thật chặt Yêu cầu: - Phần giấy bao bên phải chặt kín - Bao giấy dầu với dụng cụ hấp ướt - Bao giấy báo với dụng cụ sấy khô khử trùng ướt Với dụng cụ pipet, que trang phải dùng giấy bao kín tồn Có thể dùng hộp nhơm để đựng dụng cụ để khử trùng IV CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG DỤNG CỤ Nguyên tắc - Sau khử trùng cần đảm bảo:  Sự vô trùng tuyệt đối cho dụng cụ vật phẩm  Không làm thay đổi chất lượng mẫu vật - Bảo đảm an toàn tuyệt đối cho người Các phương pháp khử trùng Khi khử trùng nhiệt, tế bào sinh dưỡng VSV bị tiêu diệt dễ dàng bào tử tồn nhiệt độ Khả chịu nhiệt vi sinh vật phụ thuộc vào: - Tính chất mơi trường - Số lượng tế bào - Độ pH vật cần khử trùng Do để khử trùng nhiệt hiệu cần xác định ngưỡng nhiệt độ thấp khoảng thời gian ngắn cần thiết để tiêu diệt toàn VSV bào tử chúng có dụng cụ cần khử trùng Có thể khử trùng phương pháp nhiệt khô hay nhiệt ướt a Phương pháp nhiệt khô Khử trùng tủ sấy - Được thực tủ sấy - Cách tiến hành:  Đặt dụng cụ bao gói vào tủ sấy  Bật công tắc tủ hoạt động  Điều chỉnh thời gian nhiệt độ thích hợp (1600C 2h 1800C 30 phút)  Tắt tủ sấy, để nguội tới 600C mở tủ lấy dụng cụ Tránh mở tủ lấy dụng cụ nhiệt độ tủ cao làm dụng cụ thủy tinh dễ vỡ  Các dụng cụ sau sấy mà giấy bao có màu vàng đạt yêu cầu Nếu giấy bao có màu nâu chứng tỏ nhiệt độ khử trùng cao làm giấy biến thành gondron (hợp chất có tính sát trùng) khơng thể sử dụng dụng để nuôi cấy VSV Khử trùng cách đốt que lửa nóng đỏ: - Phương pháp dùng để khử trùng que cấy, ống hút, đầu ống nghiệm, miệng bình tam giác sau lấy nút - Cách khử trùng:  Hơ dụng cụ lửa đèn cồn, đưa qua đưa lại đến – lần Với dây mayxo đầu que cấy phải nung cho thật đỏ hết chiều dài dây cấy  Đợi dụng cụ nguội sử dụng để tránh vỡ vi khuẩn không bị tiêu diệt lấy giống b Khử trùng sức nóng ướt Đun sôi nước Phương pháp sử dụng cần khử trùng nhanh dụng cụ: kim tiêm, dao, kéo, kẹp, cốc Cách tiến hành: - Dùng nước đổ ngập dụng cụ - Đun sôi từ 10 phút đến 1h Đun cách thủy nhiệt độ thấp (phương pháp khử trùng Pasteur) Phương pháp dùng để khử trùng nhanh thực phẩm dễ biến tính nhiệt độ cao Cách tiến hành: Đun nóng mơi trường lên 65 – 700C 15 – 30 phút - Phương pháp có tác dụng ức chế VSV khơng có bào tử Hấp cách qng 1000C (phương pháp Tyndal) Phương pháp dùng để khử trùng số loại môi trường nuôi cấy men bánh mì, men gia súc, mốc làm nước chấm Cách khử trùng: - Hấp trường 1000C từ 30 – 40 phút - Lấy để tủ ấm 24 bào tử vi khuẩn phát triển - Hấp môi trường lần thứ hai 1000C 30 – 40 phút tiêu diệt bào tử vừa nẩy mầm - Lặp lại trình – lần Kết quả: môi trường vừa khử trùng vừa đảm bảo không thay đổi chất lượng Khử trùng nước bão hòa áp suất cao (Autoclave) Phương pháp thực nồi hấp vô trùng áp suất cao Đó thiết bị làm kim loại có tính chịu nhiệt cao có khả tự động điều chỉnh nhiệt độ thời gian Nguyên tắc hoạt động - Làm tăng nhiệt để khử trùng vật nước áp suất lớn áp suất khí Khi áp suất tăng làm nhiệt độ tăng nhờ hệ thống van chặt chẽ Hình 6: Autoclave 10 - Cách 1:  Tr d th b ên c C   ã kh ùng  Xoay tròn  - Cách 2:  Hút 0,1 ml d ên c  Dùng que trang tr  th e Kết việc nuôi cấy Sau nuôi c th cho m th - êng:  N c  N ên nh BẢO QUẢN CHỦNG VI SINH VẬT THUẦN KHIẾT Nguyên tắc - ình b ph - Làm ch ình trao hơ h q trình sinh s Các phương pháp bảo quản a Phương pháp cấy chuyển định kỳ môi trường - V - V n sau c Th nhi tháng có th 50C) 29 tháng - àm, th - Ph gi ên nhân khó ình c chuy b Phương pháp giữ giống đất, cát, hạt Trên đất, cát: b qu àm t sinh (bào t th gian b nhi Cách bảo quản: - ngâm HCl hay H2SO4 12 - R - òi n S gi - ùng ghi ch l - Rót toàn b - vi sinh v vào m Hàn kín mi ày s Trên hạt: b Th t qu Cách b - H - N - Cho h - Ph ày m - C - Gi ên m ên l 200C c Phương pháp đông khơ - m gi àm ình phân chia c ch - ùng nhi ên t 30 ài ch CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP Nêu tóm t ên t thu Th ình ni c ành vi t gi 31 BÀI SỐ 5: NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI SINH VẬT TRÊN KÍNH HIỂN VI I MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU Kiến thức lý thuyết - m Ý ngh ên c Kỹ thực hành - K - K - K - K àm tiêu b b àu tiêu b ên kính hi h II HĨA CHẤT – NGUN LIỆU – DỤNG CỤ Khái niệm thuốc nhuộm - Thu àh - àu tính ch àm lo  Thu nhu thu àu, chúng k Ví d  Thu ch thu ành ph àg ch Trong nghiên c bào c thu àu r ày Một số loại thuốc thuộm sử dụng Thuốc nhuộm Fuchsin: c 960 : 1/ 10 ml Fuchsin ki 2/ 0,3g Phenol: 5g 95 ml Tr h dung d ãng l 32 ìt Xanh Methylen 0,001% Xanh methylen: 0,1g 1000ml Xanh Methylen Loeffler 300ml Xanh methylen: Hòa tan h 20g ên r D 30ml KOH 1%: 1ml 1000ml Dung dịch lactophenol Phenol k 10g Acid lactic: 10g Glycerin: 20g 10ml Tím gentian - Cơng th 1/ Gentian violet: 1g 2/ : 10ml Phenol tinh 5g 100ml - Cách pha ch   Tr  - (2) r àu Ghi chú: Hòa m id vào, l êm c ên m Dung dịch lugol - Công th Iod tinh th 1g KI: 2g 300 ml - Cách pha ch 33 Hòa KI vào 5ml n B t Cồn 95% Aceton Nguyên liệu - êng c ài vi sinh v  Bacillus subtilis, Sarcina lutea  Penicillum italicum, Aspergillus niger  Streptomyces grisea  Saccharomyces cerevisiae - Hansen nuôi c Mô th - Saccharomyces cerevisiae pepton d E.Coli ùng Dụng cụ - Lame, lamelle - Que c - Gi - Bocan, c - Bình tia èn c III Kính hi LÀM TIÊU BẢN TẠM THỜI Các đặc điểm tiêu tạm thời - Thao tác làm tiêu b ành nhanh - ên mao, s ình thành bào t - Ch Cách lấy giống vi sinh vật để làm tiêu - èn c ên - M - Tay l - Kéo nút kh ùng kh 34 ùng mi - l - Rút que c - ùng mi a gi kh gi àm v - Kh ùng l Cách làm tiêu giọt ép - Dùng que c - àm v ên gi - Quan sát kính hi - Chú ý:  N àn ngồi lamelle dùng gi  N ì dùng vaselin bôi quanh mép lamelle b Cách làm tiêu tạm thời có nhuộm màu a Nguyên tắc ãng nhu b ho àu b Cách nhuộm: Có cách nhu Cách 1: - Nh - ên lame Nh v - Quan sát tiêu b X40 Cách - Nh - Dùng que c - Nh - Quan sát tiêu b ên lame ành vùng nh ên ã khô iv nh X10 X40 IV LÀM TIÊU BẢN CỐ ĐỊNH Các đặc điểm tiêu cố định 35 Quan sát tiêu b sinh v àm ên c ì có - Tuy thao tác ph - Cho phép ta quan sát rõ ràng hình d àc oc ào, d ng vi sinh v - Không s àm vi v Các bước tiến hành tiêu cố định a Làm vết bôi - Ch - khô L gi - ên khơng khí Chú ý:   V ịn g  Các t vi sinh v b Cố định vết bôi - Vi  Gi d àu an toàn ti  G - Các cách c C  ph bi  Dùng k k  ên ng èn c C  Cách ph ào, khơng gây bi ên mao  Dùng hóa ch  Cách c Nhúng v v u V phút Ngâm v dung d 36 15 phút, Nh ài gi ên v àd àm ài l Nhuộm màu tiêu cố định a Nguyên tắc - S àng t thành ph uc k thành nh v - Tùy theo m ph - ên c kh mà ch àu khác c cách nhu ành ùh Có cách nhu  Nhu ùng m ên tiêu b  Nhu ên tiêu b b Cách nhuộm - b ên c - Nh v ài gi - R êng lame, dùng bình tia x v ịn màu n - Dùng gi - ên b Quan sát tiêu b phút b X100 dùng d i V QUAN SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC NHÓM VI SINH VẬT Quan sát đặc điểm sinh học vi khuẩn (Bacteria) a Các đặc trưng sinh học cần quan sát vi khuẩn - Các ki ình d - Các ki ên k - Kh - Kh - Nhu ình thành bào t b Cách quan sát Quan sát cầu khuẩn - Làm tiêu b - Quan sát tiêu b êng c ên kính hi 37 Sarcina lutea - Yêu cầu:  V ình d ào, ki ên k  Nh n xét v ào Quan sát trực khuẩn - Làm tiêu b - E.Coli Làm tiêu b Bacillus subtilis nuôi c ng th nghiêng (2) - Yêu cầu:  Tiêu b c hình, nh  Tiêu b  V c X100 b ình nh ình d t ào; hình d àv Quan sát xoắn khuẩn - Làm tiêu b àu v Vibrio, Spirochae, Spirillum - Chú ý - L - Quan sát - V àm v X100 b ình d ịng vịng) a) b) c) Hình 13: Các hình dạng vi khuẩn a) c b) tr c) ph khu hay xo Quan sát đặc điểm sinh học xạ khuẩn (Actinomycetes) 38 nhi a Các đặc điểm sinh học đặc trưng cần quan sát - Hình d t - t - ình thành chu t b Cách quan sát - Làm tiêu b b Streptomyces grisea th ày ph tách r ùng que c êng (khi làm tiêu ìm khu s - Làm tiêu b - ên Yêu c b X40 V ình nh êng m ình d - Làm tiêu b t  C ê  Dùng lamelle c b   - ên lame quan sát Làm tiêu b t  Dùng lame ên m ã có x  Quan sát kính hi  V ình nh t bào t Quan sát đặc điểm sinh học nấm mốc (Molds) a Các đặc điểm sinh học đặc trưng cần quan sát - àu s - quan sinh s ình d quan sinh s - Hình d , cách s t b Cách quan sát - Làm tiêu b àu  Nh ên lame  Dùng que c Penicillum ho dàn m  quan sát X40 39 Aspergillus niger V ình nh chung c - ình d t ình, cu Làm tiêu b ình d ình, cu nhu x t ên àu:  Nh ên lame  L ên lame  quan sát  V ình c Quan sát đặc điểm sinh học nấm men (Yeasts) a Những đặc điểm sinh học cần quan sát - Hình thái, kích th - S - Hình d n t t b Cách quan sát - Làm tiêu b - Yêu cầu:  Quan sát kính hi  V X100 ình thích màng t ch c VI PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM Hóa chất – nguyên liệu - dụng cụ a Hóa chất – Nguyên liệu Hóa chất - Các lo Nguyên liệu - Các êng nuôi c i b Dụng cụ - ùng - Lame, lamelle - Que c - Bình - Ch - C èn c êm qu b h 40 B.subtilis, E.Coli - Kính hi - Gi Nguyên tắc nhuộm gram D ên kh àu c ch màng t v tinh iod mà hình thành nên hai lo - Lo ên màu c r ên không b ày vi khu - Lo àu c x àb ên m àu àu c ày thu Các bước tiến hành - Làm tiêu b  Dùng que c àm v  Dùng que c àm v gi lame) Bên trái lame B.subtilis Bên ph E.Coli B.subtilis tr  - E.Coli ong khơng khí ho Nhu b  ên v  Nhu b  Nhu  R  T tan h êng tiêu b t àu  R  Nhu 30 giây  R  Làm khô soi tiêu b - K  V B.subtilis màu tím 41  V B.subtilis + E.Coli có màu h  V E.Coli màu h àu tím - gram âm Hình 14: Các bước nhuộm gram Hình 15: Kết sau nhuộm gram CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP 1) Th hành làm tiêu b 2) Th ành làm tiêu b E.Coli V v ình thích B.subtilis, vi khu hình thích 42 3) Làm tiêu b àu A.niger V ình thích c c 4) Trình bày nguyên t ý ngh 5) Nêu tên lo 6) Trình bày c 7) Tóm t ên t ình, thích k 43 nhu ... dinh dưỡng Bài số 4: Phân lập – Nuôi cấy – Bảo quản vi sinh vật Bài số 5: Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi sinh vật kính hiển vi BÀI SỐ 1: CÁC QUY TẮC AN TỒN TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT...NỘI DUNG THỰC HÀNH -Bài số 1: Các quy tắc an tồn phịng thí nghiệm vi sinh vật Bài số 2: Các thiết bị phịng thí nghiệm vi sinh phương pháp khử trùng Bài số 3: Thực hành pha môi... cầu quan trọng kiểm nghiệm vi sinh vật Khi làm vi? ??c với vi sinh vật, thường thao tác với số lượng lớn đậm đặc tế bào vi sinh vật (ở mức 109 tế bào/ml) Nhiều chủng vi sinh vật tác nhân gây bệnh