BÁO CÁO THỰC TẬP DƯỢC LIỆUBài: DƯỢC LIỆU CHỨA SAPONIN (Cam thảo)I. Chuẩn bị1. Nguyên vật liệu thí nghiệm: Rễ và thân rễ của cây cam thảo Dung môi, hóa chất: cồn 70%, methanol, ether ethylic, anhydric acetic, acid sulfuric đậm đặc, NaCl 0,9%, HCl 0,1N, NaOH 0,1N
BÁO CÁO THỰC TẬP DƯỢC LIỆU Bài: DƯỢC LIỆU CHỨA SAPONIN (Cam thảo) I Chuẩn bị Nguyên vật liệu thí nghiệm: - Rễ thân rễ cam thảo - Dung mơi, hóa chất: cồn 70%, methanol, ether ethylic, anhydric acetic, acid sulfuric đậm đặc, NaCl 0,9%, HCl 0,1N, NaOH 0,1N II Thử nghiệm tính tạo bọt: 2.1 Xác định số bọt a Cách tiến hành: 1g bột dược liệu +100 ml nước cất sôi Đun cách thủy 30 phút Dịch chiết Lọc nóng Dịch lọc Chờ dịch lọc nguội Chuyển vào bình định mức 100ml Thêm nước cất cho đủ 100ml Dung dịch A Chia nhỏ 10 ống nghiệm (1) (2) (3) (9) (10) Thêm nước cất vào ống nghiệm cho đủ 10ml Dung dịch B Bịt miệng ống nghiệm lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm 15 giây Dung dịch Để yên ống nghiệm 15 phút Đo độ cao cột bọt b Hiện tượng: - Cột bọt ống nghiệm khác theo thứ tự từ đến 10 - Ống nghiệm số có cột bột cao 1cm nên số bọt độ pha loãng dung dịch ống nghiệm Bảng chiều cao cột bọt: 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 1,0 1.2 1.3 10 1.5 (cm ) Kết luận: Cột bọt số cao 1cm nên số bột độ pha lỗng dung dịch ống nghiệm Tính kết quả: CSB = x A x k = x 100 x = 142.857 (ml) Trong đó: n: số thứ tự ống có cột bọt cao 1cm A: độ pha loãng dung dịch ban đầu K: độ pha loãng trung gian Vậy số bọt CSB = 142.857 ml Giải thích: - Saponin có tính chất hoạt động bề mặt (phân tử saponin có lúc đầu ưa nước đầu kỵ nước), hòa tan vào nước làm giảm sức căng bề mặt dung dịch nên tạo nhiều bọt lắc - Ta chọn ống nghiêm với yêu cầu khái niệm Chỉ số bọt : cột bọt cao 1cm bền 15 phút - Phản ứng nhằm đánh giá nguyên liệu có chứa saponin -> Dược liệu cam thảo có chứa saponin 2.2 Định tính phản ứng Liebermann-Burchard: 0,5g dược liệu +5ml cồn 70% Đun cách thủy phút Lọc Bã Dịch lọc Cô bếp cách thủy Cắn +1ml anhydric acetic +1ml CHCl3 Khuấy kỹ cho tan Dung dịch +1 ml H2SO4 đ Phản ứng dương tính Hiện tượng: Mặt ngăn cách lớp có màu nâu đỏ Lớp dung dịch phía có màu nâu đỏ Kết q trình định tính Saponin phản ứng Liebermann – Burchard: loại saponin Cam thảo Saponin triterpenoid Giải thích: - Ban đầu dùng cồn để chiết saponin ( phần saponin thường dễ tan dung môi phân cực ) cam thảo sau dùng CH3Cl để chiết sapogenin ( phần sapogenin tan dung môi phân cực) - Phản ứng đặc hiệu lên màu với dẫn chất có chứa nhân steroid, chế phản ứng khử nước acid mạnh 2.3 So sánh cột bọt môi trường OH- H+ : a Tiến hành Dịch chiết 1ml dịch chiết/nước 1ml NaOH 0,1N 1ml dịch chiết/nước 1ml HCl 0,1N Lắc mạnh ống vòng 15 giây Để yên cho cột bọt ổn định Hiện tượng: ống cao ngang cột bọt Kết luận: sơ kết luận Cam thảo có chứa saponin triterpenoid Giải thích: - Cấu trúc genin saponin triterpennoid có 30C, cấu tạo từ đơn vị heniterpen nối vs theo quy tắc đầu Nhóm methyl C28 dc oxy hóa thành nhóm carboxyl kết hợp vs đường tạo thành dây nối pseudoglycosid - Do khung triterpen bền nên bọt cột Còn khung steroid dễ bị khử acid nên có chênh lệch bọt KẾT LUẬN CHUNG: Dựa tượng tạo bọt màu tạo thành phản ứng Liebermann kết luận loại saponin có Cam thảo Saponin Triterpenoid III Định tính sắc ký lớp mỏng Chuẩn bị Bình sắc ký Chuẩn bị mỏng Dùng mỏng silicagel e Phát tráng sẵn cắt thành miếng có kích thước 2,5 x 10 cm Dùng bút chì kẻ lên mỏng đường thẳng cách mép 1cm để chấm thử, đường thẳng cách mép 0,5 cm rửa để thật khơ Lót miếng giấy lọc quanh lòng bình Cho hệ dung mơi CHCl3MeOH-H2O (65:35:10; lớp dưới) vào bình sắc ký cho lớp dung mơi bình cao khoảng 0,5cm Đậy nắp bình sắc ký, đặt nơi phẳng, để yên 15-30 phút cho bão hòa dung mơi 0,5g bột cam thảo 5ml methanol vào ống nghiệm đun cách thủy 10 phút, lọc, cô cắn, cho vào vài giọt MeOH, lắc cho tan Đưa lên mẫu khai triển; Dùng mao quản lấy mẫu, chấm lên giấy thấm cho bớt dung dịch, sau chấm lên mỏng thành chấm cách mép cm( vết chấm phải cao mức dung mơi bình sắc ký) Chờ cho MeOH bay hết cho vào bình sắc ký, đậy nắp Khi dung môi chạy tới đường thẳng lấy mỏng ra, để nhiệt độ phòng cho khô Phát hiện: Soi đèn UV 254nm 365nm Cam thảo Cam thảo Đọc kết - Số lượng vết: vết - Rf vết ( Tỉ lệ khoảng dịch chuyển chất thử khoảng dịch chuyển dung môi ): Rf = Với: lA đoạn đường di chuyển chất A lo đoạn đường di chuyển dung mơi Tính tốn: Đi theo hướng chiều chuyển động dung môi, mỏng sắc ký ta có vết, đặt tên theo thứ tự 1, 2, 3, 4, 5, Ta có: Quãng đường dung môi lo = 19 Quãng đường vết 1: l1 = 1,5 Rf1 = = 0,08 Quãng đường vết 2: l2 = 7,5 Rf2 = = 0,39 Quãng đường vết 3: l3 = 10 Rf3 = = 0,53 Quãng đường vết 4: l4 = 12 Rf4 = = 0,63 Quãng đường vết 5: l5 = 15 Rf5 = = 0,79 Quãng đường vết 6: l6 = 16 Rf6 = = 0,84 Phương pháp sắc ký lớp mỏng dùng để định tính Saponin Màu sắc với thuốc thử đặc hiệu vết sắc ký đồ yếu tố để nhận định có mặt Saponin, nhóm Saponin hỗn hợp phân tích Giải thích: - Sắc ký lớp mỏng kỹ thuật tách chất tiến hành cho pha động di chuyển qua pha tĩnh đặt hỗn hợp chất cần tách + Pha tĩnh chất hấp phụ chọn phù hợp theo yêu cầu phân tích, trải thành lớp mỏng đồng cố định phiến kính phiến kim loại + Pha động hệ dung môi đơn đa thành phần trộn với theo tỷ lệ quy định chuyên luận +Trong trình di chuyển qua lớp hấp phụ, cấu tử hỗn hợp mẫu thử di chuyển lớp mỏng, theo hướng pha động, với tốc độ khác Kết quả, ta thu sắc ký đồ lớp mỏng - Cơ chế chia tách chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay phối hợp đồng thời nhiều chế tùy thuộc vào tính chất chất làm pha tĩnh dung môi làm pha động Dùng methanol làm dung môi mà khơng dùng nước vì: + Dung mơi thích hợp dùng sắc ký lớp mỏng dung môi có tính phân cực khác với pha tĩnh Nếu dung mơi phân cực dùng để hòa tan mẫu thử pha tĩnh phân cực, vệt nhỏ mẫu thử lan tròn mao dẫn , vệt khác trộn lẫn vào Do đó, để hạn chế lan tròn vệt mẫu, dung mơi sử dụng để hòa tan mẫu thử phải không phân cực, phân cực phần, pha tĩnh phân cực, ngược lại + Ngoài nước hòa tan nhiều chất nên ảnh hưởng đến trình sắc ký Chuẩn bị bình sắc ký dung mơi: cho dung mơi vào bình, quanh thành bình lót giấy lọc để bão hồ dung mơi bình sắc ký nhanh Khi dùng hệ sắc ký mỏng, phải cho hệ dung mơi vào bình đậy kín để n cho dung mơi thấm ướt giấy lọc vì: Để tránh dung mơi bay coi hệ dung mơi có đồng hay không Nếu hệ dung môi thấm ướt giấy lọc hệ dung mơi đồng Hệ dung môi tỷ lệ dung môi ảnh hưởng đến tỉ lệ Rf: Các hợp chất tách dựa cạnh tranh chất tan pha động để có liên kết với pha tĩnh Ví dụ: Nếu silicagel dùng pha tĩnh, xem phân cực Cho trướt hai hợp chất phân cực khác nhau, chất có tính phân cực mạnh có liên kết với silicagel lớn có khả đẩy pha động khỏi chỗ lien kết Do hợp chất có tính phân cực nhỏ di chuyển lên cao bảng sắc ký ( Rf lớn hơn) Nếu pha động thay dung môi phân cực hỗn hợp dung mơi, có khả đẩy chất tan khỏi chỗ liên kết với silicagel, tất chất bảng sắc kí di chuyển lên cao ... 15 phút - Phản ứng nhằm đánh giá nguyên liệu có chứa saponin -> Dược liệu cam thảo có chứa saponin 2.2 Định tính phản ứng Liebermann-Burchard: 0,5g dược liệu +5ml cồn 70% Đun cách thủy phút Lọc... đỏ Kết q trình định tính Saponin phản ứng Liebermann – Burchard: loại saponin Cam thảo Saponin triterpenoid Giải thích: - Ban đầu dùng cồn để chiết saponin ( phần saponin thường dễ tan dung... Cam thảo có chứa saponin triterpenoid Giải thích: - Cấu trúc genin saponin triterpennoid có 30C, cấu tạo từ đơn vị heniterpen nối vs theo quy tắc đầu Nhóm methyl C28 dc oxy hóa thành nhóm carboxyl