Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài curcuma SP (tt)

MỤC LỤC LVBM.4.5 PHẦN MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Chi Nghệ Việt Nam 1.2 Nghệ Trắng Trà Vinh 1.3 Nghiên cứu thành phần hóa học chi Nghệ 1.3.1 Nghiên cứu Việt Nam 1.3.2 Nghiên cứu giới 1.4 Nghiên cứu hoạt tính sinh học chi Nghệ 1.4.1 Nghiên cứu Việt Nam 1.4.2 Nghiên cứu giới CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 Điều kiện thực nghiệm 2.1.1 Nguyên liệu 2.1.2 Thiết bị dụng cụ 2.1.3 Hóa chất 2.1.4 Một số vi sinh vật đƣợc thử nghiệm 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 10 2.2.1 Các phƣơng pháp chiết xuất 10 2.2.2.1 Phƣơng pháp lôi nƣớc 11 2.2.2.2 Kỹ thuật chiết phƣơng pháp ngâm dầm 11 2.2.2 Các phƣơng pháp sắc ký 11 2.2.2.1 Sắc ký lớp mỏng 11 2.2.2.2 Sắc ký cột 13 2.2.2.3 Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 14 2.2.2.4 Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) 15 2.2.3 Các phƣơng pháp xác định cấu trúc 17 2.2.3.1 Phổ proton 1H: 17 2.2.3.2 Phổ carbon 13C 17 2.2.3.3 Phổ DEPT 18 2.2.3.4 Phổ hai chiều HSQC 18 2.2.3.5 Phổ hai chiều HMBC 19 2.2.4 Các phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học 19 iii 2.2.4.1 Phƣơng pháp quét gốc tự DPPH 19 2.2.4.2 Phƣơng pháp đục lỗ thạch 20 2.2.4.3 Phƣơng pháp pha loãng 21 2.3 Chiết xuất, điều chế phân lập 23 2.3.1 Chiết xuất tinh dầu 23 2.3.2 Điều chế cao acetone 25 2.3.3 Phân lập hợp chất cao acetone 26 2.3.3.1 Khảo sát phân đoạn F1, F2, F3 28 2.3.3.2 Khảo sát phân đoạn F5 28 2.3.3.3 Khảo sát phân đoạn F54 30 2.3.3.4 Khảo sát phân đoạn F544 31 2.3.3.5 Khảo sát phân đoạn F56 32 2.3.3.6 Khảo sát phân đoạn F57 33 2.3.3.6 Khảo sát phân đoạn A 33 Khảo sát hoạt tính sinh học 35 2.4.1 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa 35 2.4.2 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn 36 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 37 3.1 Thành phần hóa học 37 3.1.1 Thành phần hóa học tinh dầu 37 3.1.2 Thành phần hóa học phân đoạn cao acetone 40 3.1.2.1 Phân đoạn F1 40 3.1.2.2 Phân đoạn F2 41 3.1.2.1 Phân đoạn F3 41 3.1.3 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất S2 43 3.1.4 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất S3 45 3.2 Hoạt tính sinh học 47 3.2.1 Hoạt tính kháng oxy hóa 47 3.2.2 Hoạt tính kháng khuẩn 51 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC iv DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Một số hình ảnh lồi Nghệ - Hình 1.2 Một số hình ảnh Nghệ trắng Trà Vinh - Hình 1.3 Chất màu curcumin - Hình 2.1 Bacillus cereus Hình 2.2 Staphylococcus aureus - Hình 2.3 Pseudomonas aeruginosa - Hình 2.4 Escherichia coli - 10 Hình 2.5 Sắc ký lớp mỏng 12 Hình 2.6 Cách tính Rf - 13 Hình 2.7 Phƣơng pháp pha lỗng nồng độ dịch vi sinh - 22 Hình 2.8 Bột Nghệ trắng 24 Hình 2.9 Bột Nghệ vàng 24 Hình 2.10 Thiết bị chƣng cất lôi nƣớc - 25 Hình 2.11 Dịch chiết acetone - 26 Hình 2.12 Sắc ký cột 27 Hình 2.15 HPLC tách chất 35 Hình 2.16 Kết màu với H2SO4 S3 35 Hình 3.1 Tinh dầu Nghệ trắng Nghệ vàng - 37 Hình 3.2 Hợp chất 9a 37 Hình 3.3 Phổ HMBC hợp chất S3 47 Hình 3.4 Hợp chất - 45 Hình 3.5 Phổ HMBC hợp chất S3 47 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Nhiệt độ sôi, số điện môi, số phân cực, độ nhớt, độ tan nƣớc số dung môi 10 Bảng 2.2 Kết khảo sát cao acetone 27 Bảng 2.3 Kết khảo sát phân đoạn F5 29 Bảng 2.4 Kết khảo sát phân đoạn F54 30 Bảng 2.5 Kết khảo sát phân đoạn F544 31 Bảng 2.6 Kết khảo sát phân đoạn F56 32 Bảng 2.7 Kết khảo sát phân đoạn F57 33 Bảng 2.8 Kết khảo sát phân đoạn A 35 Bảng 3.1: Hàm lƣợng tinh dầu củ Nghệ 37 Bảng 3.2 Thành phần hóa học hàm lƣợng tinh dầu Nghệ trắng Nghệ vàng 38 Bảng 3.3 Thành phần hóa học hàm lƣợng phân đoạn F1 40 Bảng 3.4 Thành phần hóa học hàm lƣợng phân đoạn F2 41 Bảng 3.5 Thành phần hóa học hàm lƣợng phân đoạn F3 41 Bảng 3.6 Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR (ppm) S2 hợp chất 9a 43 Bảng 3.7 Số liệu phổ HMBC (ppm) S2 43 Bảng 3.8 Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR (ppm) S3 hợp chất 46 Bảng 3.9 Kết phần trăm ức chế vitamin C 47 Bảng 3.10 Kết phần trăm ức chế tinh dầu Nghệ trắng Trà Vinh 48 Bảng 3.11 Kết phần trăm ức chế F3 49 Bảng 3.12 Kết phần trăm ức chế F5 50 Bảng 3.13 Đƣờng kính vòng vơ khuẩn tinh dầu Nghệ trắng, Nghệ vàng phân đoạn F5 52 Bảng 3.14 Bảng giá trị MIC tinh dầu Nghệ F5 chủng vi khuẩn 52 vi DANH MỤC ĐỒ THỊ VÀ SƠ ĐỒ DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1 Khả ức chế vitamin C 48 Đồ thị 3.2 Khả ức chế tinh dầu Nghệ trắng 49 Đồ thị 3.3 Khả ức chế mẫu F3 50 Đồ thị 3.4 Khả ức chế mẫu F5 51 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tinh dầu Nghệ - 23 Sơ đồ 2.2 Sơ đồ điều chế cao acetone - 25 Sơ đồ 2.3 Sơ đồ khảo sát cao acetone - 26 Sơ đồ 2.4 Sơ đồ khảo sát phân đoạn F5 - 29 Sơ đồ 2.5 Sơ đồ khảo sát phân đoạn F54 - 30 Sơ đồ 2.6 Sơ đồ khảo sát phân đoạn F544 31 Sơ đồ 2.7 Sơ đồ khảo sát phân đoạn F56 - 32 Sơ đồ 2.8 Sơ đồ khảo sát phân đoạn F57 - 33 Sơ đồ 2.9 Sơ đồ khảo sát phân đoạn A 34 vii DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT B cereus: Bacillus cereus S aureus: Staphylococcus aureus P aeruginosa: Pseudomonas aeruginosa E coli: Escherichia coli EPEC: Enteropathogenic Escherichia coli EIEC: Enteroinvasive Escherichia coli ETEC: Enterotoxigenic Escherichia coli EHEC: Enterohaemorrhagic Escherichia coli VTEC: Verocytoxin Escherichia coli DPPH.: 2,2 diphenyl-1-picrylhydrazyl DMSO: dimethyl sulphoxide EA: Ethylacetate MeOH : Methanol Chlo: Chloroform GC-MS: sắc ký khí ghép khối phổ (Chromatography Mass Spectrometry) MS: Phổ khối lƣợng (Mass Spectrometry) HSQC: Heteronuclear Single Quantum Correlation HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Coherence IC50: phần trăm ức chế 50% SKLM: Sắc ký lớp mỏng MIC: Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibited Concentration) HPLC: Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) viii PHẦN MỞ ĐẦU Nƣớc ta quốc gia nằm vùng nhiệt đới, gió mùa nên có nhiều điều kiện thuận lợi (nhiệt độ, ánh sáng, đất đai, ) cho phát triển nhiều loài thực vật Từ lâu ngƣời biết sử dụng tất thành phần Nghệ để làm đẹp, thuốc chữa bệnh, làm gia vị làm phẩm màu chế biến thực phẩm Thành phần hóa học thân rễ (củ) nghệ giàu alkaloid, flavonoid, curcuminoids, tannin terpenoid thƣờng chất có hoạt tính sinh học q Hoạt chất curcumin có củ Nghệ có tác dụng kháng nấm, diệt khuẩn, diệt ký sinh trùng, chống viêm nhiễm bảo vệ da Ngoài ra, Curcumin đƣợc coi chất tiêu biểu cho chất phòng chống ung thƣ hệ mới: hiệu lực, an tồn khơng gây tác dụng phụ, tác dụng lên tế bào ung thƣ mà không ảnh hƣởng đến tế bào lành tính, vơ hiệu hóa gốc tự hình thành trình tự vệ thể, Để tăng dung nạp cucurmin dƣợc phẩm hoạt chất đƣợc thƣơng mại hóa phổ biến dƣới dạng nanocurcumin Tuy nhiên việc dùng nanocurcumin mỹ phẩm có phần hạn chế màu vàng đậm curcumin Cũng màu vàng nên công dụng bột Nghệ vàng trình lành vết thƣơng, chống viêm nhiễm, nám da phụ nữ đặc biệt phụ nữ sau sinh tốt nhƣng bôi để lại vết màu vàng khó chịu Ở Trà Vinh có lồi Nghệ có hình thái bên mùi giống Nghệ vàng nhƣng củ màu trắng, có hoạt tính làm lành vết thƣơng nhanh, chống nám tốt,… khơng có chứa hợp chất có màu nhƣ Nghệ vàng nên dễ dàng sử dụng mỹ phẩm, dƣợc phẩm Mục tiêu đề tài khảo sát thành phần hóa học hoạt tính sinh học (hoạt tính chống oxi hóa, hoạt tính kháng khuẩn) lồi curcuma sp nhằm tìm đƣợc hợp chất ứng dụng mỹ phẩm y sinh CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Chi Nghệ Việt Nam Chi Nghệ (Curcuma) chi lớn họ Gừng (Zingiberaceae) Theo GS Phạm Hoàng Hộ, Việt Nam có lồi Nghệ sau: - Nghệ vàng: Curcuma domestica Val.(C longa L.): Là loài thân thảo có chiều cao khoảng 1m Thân rễ thành củ hình trụ dẹt, bẻ cắt ngang có màu vàng cam sẫm; Lá có hình trái xoan nhọn hai đầu, bề mặt nhẵn, dài 45 cm rộng 28cm; Cuống cọ bẹ; Cụm hoa mọc lên từ tạo thành hình nón thƣa, bắc hữu thụ hình máng rộng, đầu tròn màu xanh lục nhạt, bắc bất thụ hẹp hơn, màu tím nhạt Tràng có phiến, cánh hoa ngòai màu xanh lục vàng nhạt, chia thành ba thùy, thùy to hơn, phiến cánh hoa chia ba thùy, hai thùy hai bên đứng phẳng, thùy dƣới hõm thành máng sâu Quả nang ngăn, mở ba van Hạt có áo hạt - Curcuma aromatica Salisb: Nghệ trắng - Curcuma earuginosa Roxb: Nghệ Ten Đồng - Curcuma zedoaria (Berg.): Nghệ đen - Curcuma xanthorrhiza Roxb - Curcuma rubens - Curcuma thorelii Gagn - Curcuma pierreana Gagn - Curcuma elata Roxb - Curcuma cochinchinensis Gagn - Curcuma alismataefolia Gagn - Curcuma angustifolia Roxb - Curcuma parviflora Wall - Curcuma gracillima Gagn [1][2] Phổ biến Curcuma longa, tiếp đến Curcuma zedoaria, Curcuma aromatica mọc hoang hay đƣợc trồng rãi rác khắp nơi đất nƣớc ta số nƣớc vùng nhiệt đới thuộc châu Á Curcuma longa Curcuma zedoaria Curcuma aromatica Curcuma earuginosa Hình 1.1 Một số hình ảnh lồi Nghệ 1.2 Nghệ Trắng Trà Vinh - Tên thƣờng gọi: Nghệ trắng, Nghệ rừng (wild tumeric) - Tên khoa học: Curcuma sp Củ Nghệ cắt ngang Củ Nghệ cắt dọc Hoa Nghệ trắng Cây Nghệ trắng Hình 1.2 Một số hình ảnh Nghệ trắng Trà Vinh - Mơ tả cây: Nghệ trắng loại cỏ cao 0,6 đến 1m Thân rễ thành củ hình trụ dẹt, bẻ cắt ngang có màu trắng, có mùi thơm, vị đắng Lá hình trái xoan thon nhọn hai đầu, hai mặt nhẵn dài tới 45 cm, rộng tới 18 cm Cuống có bẹ Cụm hoa mọc từ lên thành hình nón thƣa Có nhiều nghiên cứu số lƣợng, đặc điểm thực vật, khả phân bố , thành phần hóa học hoạt tính sinh học số lồi chi Ngệ nhƣng chƣa có tác giả nghiên cứu khảo sát thành phần hóa học hoạt tính sinh học củ Nghệ trắng Trà Vinh 1.3 Nghiên cứu thành phần hóa học chi Nghệ 1.3.1 Nghiên cứu Việt Nam - Theo Giáo sƣ Tiến sĩ Đỗ Tất Lợi thành phần hóa học có Nghệ vàng gồm: Chất màu curcumin 0.3%, tinh dầu 1-5% màu vàng nhạt, thơm gồm 25% carbua tecpenic, chủ yếu zingiberen 65% ceton sesquitecpenic, chất turmeron, 5% paratolylmetyl carbinol 1% long não hữu tuyến Hai chất sau thấy Curcuma xanthorrhiza Roxb Ngồi tinh bột, canxi oxalate, chất béo [2] Hình 1.3 Chất màu curcumin - Thành phần hóa học tinh dầu Nghệ đen (Curcuma zedoaria) trích ly theo phƣơng pháp thƣờng phƣơng pháp vi sóng gồm γ-Elemen (14,18 ± 1,37% đến 18,79 ± 1,45%), Curzeren (14,28 ± 1,99% đến 16,67 ± 2,06%), Germacron (22,53 ± 2,18% đến 24,28 ± 2,19%) [3] - Dùng ether dầu hòa tan cao ethanol chiết từ thân rễ Nghệ trắng (Curcuma aromatica Salisb.) thu đƣợc ba sesquiterpene hydrocacbon (α-humulene, β-selinene α- selinene) sáu oxygenated sesquiterpenes (furanodiene, furanodienone, curzerenone, germacrone, curcumenone zederone) [4] - Thành phần tinh dầu đƣợc chiết từ thân rễ Nghệ Ten đồng (Curcuma earuginosa Roxb) Furanodienon (20.13%), Gemaron (16,67%), Curdion (8.58%) Furanodiene (8,39%) [5] 1.3.2 Nghiên cứu giới - Thành phần tinh dầu củ Curcuma zedoaria Curzerenone (31,6%), Germacrone (10,8), Camphor (10,3%) [3] - Ở Ấn Độ Curcuma aromatica đƣợc sử dụng rộng rãi để làm giảm mụn trứng cá mặt cải thiện da đƣợc ứng dụng nhiều mỹ phẩm sau Nghệ vàng Các thành phần đƣợc xác định dầu là: α-pinen, β-pinen, Camphene, 1,8cineol, isofurano-germacrene, borneol, Isoborneol, β-curcumene, ar-curcumene, xanthorrhizol, Germacrone, camphor, curzerenone [6] - Thành phần tinh dầu Curcuma longa α-turmerone (42,6%), turmerone (16,0%) ar-turmerone (12,9%) [7] Thành phần tinh dầu Curcumar longa gồm ar-turmerone (24,4%), α-turmerone (20,5%), β-turmerone TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Phạm Hoàng Hộ (1997), Cây cỏ Việt Nam, T 3, Tr 454-457, NXB Trẻ, Thành Phố Hồ Chí Minh [2] Giáo sƣ Tiến sĩ Đỗ Tất Lợi, Những thuốc vị thuốc Việt Nam, 2004, Tr 227, Nhà xuất y học [3] Trần Thị Việt Hoa, Trần Thị Phƣơng Thảo, Vũ Thị Thanh Tâm, Thành phần hóa học tính kháng oxy hóa Nghệ đen curcuma zedoaria Berg Trồng Việt Nam, Tạp chí phát triển KH & CN, tập 10, số 04 – 2007 [4] Phan Minh Cang, Phan Tong Sơn, Isolation of sesquiterpenoids from the rhiromes of Vietnames curcuma aromatic Salisb Journal of Chemistry, Vol 38, No.4, P 96 – 99, 2000 [5] Trần Thanh Lƣơng, Nguyễn Cao Trí, Phạm Nguyễn Đơng n, Nguễn Thị Mai Hƣơng, Nguyễn Thị Thanh Thủy, Nguyễn Thị Thúy, Vũ Thị Bích, Studies on rhizome of curcuma aeruginosa roxb growing in Tam Dao – Vinh Phu, Hội nghị Khoa học Cơng nghệ hóa học hữu tồn quốc lần thứ IV.2007 [6] Sikha A, Harini A, Hegde Prakash L, Pharmacological activities of wild turmeric (curcuma aromatic salisb): a review, Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry 2015; 3(5): 01-04 [7] Avanỗo G.B., Ferreira F.D., Bonfim N.S., dos Santos P.A.d.S.R., Peralta R.M., Brugnari T., Mallmann C.A., de Abreu Filho B.A., Mikcha J.M.G & Machinski M., Jr, Curcuma longa L essential oil composition, antioxidant effect, and effect on Fusarium verticillioides and fumonisin production, Food Control (2016), State University of Maringá (Universidade Estadual de Maringá), Avenida Colombo 5790, 87020-900 Maringá, Paraná, Brazil [8] Fan-Cheng Meng, Yan-Qing Zhou, Dai Ren, Ruibing Wang, Chunming Wang, Li-Gen Lin, Xiao-Qi Zhang, Wen-Cai Ye, Qing-Wen Zhang, “Turmeric: A Review of Its Chemical Composition, Quality Control, Bioactivity, and Pharmaceutical Application”, Natural and Artificial Flavoring Agents and Food Dyes, 2018, 299-350 [9] Orawan Theanphong, Withawat Mingvanish and Thaya Jenjittikul, Chemical constituents and in vitro and antioxidant activities of essential oil from cucuma leucorrhiza roxb Rhizome, Bulletin of Health, Science and Technology (2016, 14 (2):86-96 56 [10] Neerja Pant, Himanshu Mia, D.C Jain, Phytochemical investigation of ethyl acetate extract from Curcuma aromatic Salisb rhizomes, Arabian Journal of Chemistry, 2013, 6, 279-283 [11] Liang-Mei Li, Jun Li, Xiu-Ying Zhang, Antimicrobial and molecular interaction studies on derivatives of curcumin against Streptococcus pneumoniae which caused pneumonia, Electronic Journal of Biotechnology 19 (2016) 8–14 [12] Mariana Assis de Queiroz Cancian, Fernanda Garcia de Almeida, Marcela Moreira Terhaag, Admilton Gonỗalves de Oliveira, Thais de Souza Rocha, Wilma Aparecida Spinosa, Curcuma longa L.- and Piper nigrum-based hydrolysate, with high dextrose content, shows antioxidant and antimicrobial properties, Food Science and Technology, 2018 [13] Linthoingambi W, Satyavama D Asem, Mutum S Singh and Warjeet SLaitoojam, Antioxidant and antimicrobial activities of diferent solvent extracts of the rhizomes of Curcuma leucorrhiza Roxb, Indian Journal of Nature Products and Resources, December 2013 pp 375-379 [14] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh [15] Nguyễn Kim Phi Phụng (2004), Khối phổ, NXB Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh [16] PGS-TS Nguyễn Kim Phi Phụng (2005), Phổ NMR sử dụng phân tích hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh [17] Krishnaiah, D., et al., A review of the antioxidant potential of medicinal plant Species, Food Bioprod Process (2010), [18] Ronald L Prior, Xianli Wu, Karen Schaich, Standardized Methods for the Determination of Antioxydant Capacity and Phenolics in Foods and Dietary Supplements” Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53, 4290−4302 [19] Trần Linh Thƣớc (2006), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, NXB Giáo dục [20] Akihito Yokosuka, Yoshihiro Mimaki, Hiroshi Sakagami, Yutaka Sashida, New Diarylheptanoids and Diarylheptanoid Glucosides from the Rhizomes of and Their Cytotoxic Activity”, 283-289, 2002 57 ... , thành phần hóa học hoạt tính sinh học số loài chi Ngệ nhƣng chƣa có tác giả nghiên cứu khảo sát thành phần hóa học hoạt tính sinh học củ Nghệ trắng Trà Vinh 1.3 Nghiên cứu thành phần hóa học. .. 2.3.3.6 Khảo sát phân đoạn F57 33 2.3.3.6 Khảo sát phân đoạn A 33 Khảo sát hoạt tính sinh học 35 2.4.1 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa 35 2.4.2 Khảo sát hoạt tính. .. tiêu đề tài khảo sát thành phần hóa học hoạt tính sinh học (hoạt tính chống oxi hóa, hoạt tính kháng khuẩn) lồi curcuma sp nhằm tìm đƣợc hợp chất ứng dụng mỹ phẩm y sinh CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1