Điều tra thành phần loài nấm Đông trùng hạ thảo tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên, nghiên cứu nuôi trồng loài Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes)

MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Nấm Đông trùng hạ thảo (còn gọi là Đông trùng thảo, Trùng thảo hay Hạ thảo Đông trùng) là các loài nấm ký sinh trên sâu non hoặc nhộng hoặc sâu trưởng thành của một số loại côn trùng. Sâu non, sâu trưởng thành của một số loài côn trùng nằm dưới đất hoặc ở trên mặt đất bị nấm ký sinh, xâm nhiễm và sử dụng các chất trong cơ thể côn trùng làm thức ăn, làm cho côn trùng chết. Mùa đông, giai đoạn này nhiệt độ và ẩm độ không khí thấp, nấm ký sinh ở dạng hệ sợi. Đến mùa hè, nhiệt độ và ẩm độ không khí cao đã hình thành thể quả và nhú lên khỏi mặt đất nhưng gốc vẫn dính liền vào thân sâu. Vì mùa đông nấm tồn tại ở dạng hệ sợi trên sâu, mùa hạ mọc thành cây nấm nên có tên là đông trùng hạ thảo. Nấm Đông trùng hạ thảo là loài nấm được đánh giá cao về giá trị dược liệu, nhờ có hợp chất cordycepin trong thành phần hoá học của thể quả nấm. Đây là hợp chất có khả năng ức chế hoạt động của quá trình sinh tổng hợp mới của các tế bào ung thư. Tác dụng kìm hãm của các tế bào ung thư vú, ung thư phổi, ung thư máu cũng được nhiều nhà khoa học như: Yoo et al., (2004) [107]; Ahn et al., (2000) [48] đã nghiên cứu và phát hiện. Theo y học cổ truyền Trung Quốc, nấm Đông trùng hạ thảo được dùng để điều trị các chứng rối loạn lipit máu, rối loạn nhịp tim, viêm thận mạn tính, cao huyết áp, ung thư phổi, thiểu năng sinh dục và viêm gan B mạn tính. Nấm Đông trùng hạ thảo đã được Nan et al., (2001) [89] chứng minh có hiệu quả chữa trị bệnh rối loạn chức năng gan. Ngoài ra nấm này còn có tác dụng chống viêm và kìm hãm sự oxy hoá của lipit và lipoprotein. Không chỉ vậy loài nấm Đông trùng hạ thảo còn được phát hiện có hàm lượng dinh dưỡng cao: giàu các vitamin A, vitamin B6, vitamin B12, vitamin B3, vitamin B1… và có hàm lượng protein khá cao, nhiều nguyên tố khoáng như Zn, Se, Cu... Như vậy giá trị của loài nấm Đông trùng hạ thảo là vô cùng quý giá. Được thiên nhiên ưu đãi về điều kiện tự nhiên cùng với hệ động thực vật phong phú, Vườn Quốc gia Hoàng Liên còn có nguồn dược liệu vô cùng quý giá như: Tam thất hoang, nấm Linh chi, Ba kích cùng nhiều loài thảo dược quý khác đã góp phần xây dựng Sa Pa trở thành điểm du lịch nghỉ dưỡng, chữa bệnh yêu thích của du khách trong và ngoài nước. Tuy nhiên những sản vật của địa phương mới chỉ dừng lại ở việc khai thác, thu hái từ rừng, một phần nhỏ do nhân dân nuôi trồng mà chưa có nhiều sản phẩm khoa học công nghệ cao phục vụ khách du lịch và đóng góp đáng kể cho ngân sách địa phương. Bằng các nghiên cứu chuyên đề các nhà khoa học bước đầu phát hiện Vườn Quốc gia Hoàng Liên có các loài nấm Đông trùng hạ thảo phân bố tự nhiên, trong đó có loài “Bông tuyết Đông trùng hạ thảo - Isaria tenuipes” được phát hiện, nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong y học… loài này chứa hàm lượng một số hoạt chất (Adenosine, Cordycepin…) cao và giá trị nó mang lại vô cùng lớn với việc điều trị ung thư, tiểu đường và một số bệnh lý khác. Tuy nhiên khu hệ nấm ở Vườn Quốc gia Hoàng Liên còn chưa có nhiều nghiên cứu. Những hiểu biết về đa dạng thành phần loài, đặc điểm sinh học và giá trị sử dụng còn đang rất hạn chế. Với mong muốn được đóng góp vào việc xây dựng danh mục nguồn gen các loài nấm Đông trùng hạ thảo tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên, bảo tồn đa dạng sinh học và đề xuất biện pháp sử dụng bền vững, nhân nuôi nguồn dược liệu quý bằng phương pháp nhân tạo. Mở ra một hướng đi mới trong việc phát triển kinh tế, xã hội của tỉnh Lào Cai, tạo sản phẩm du lịch đặc trưng mang thương hiệu Đông trùng hạ thảo Sa Pa. Xuất phát từ những lý do trên, đề tài: “Điều tra thành phần loài nấm Đông trùng hạ thảo tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên, nghiên cứu nuôi trồng loài Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes) đặt ra là rất cần thiết, có ý nghĩa cả về lý luận và thực tiễn. 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Mục tiêu chung Xác định được thành phần, tính đa dạng các loài thuộc nhóm nấm ĐTHT tại VQG Hoàng Liên và cơ sở khoa học trong việc nuôi trồng loài nấm Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes). 2.2. Mục tiêu cụ thể - Xác định được thành phần loài nhóm nấm Đông trùng hạ thảo tại VQG Hoàng Liên. - Xác định được tính đa dạng và đặc điểm sinh học của các loài nấm ĐTHT thu được tại VQG Hoàng Liên. - Xây dựng hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng loài nấm ĐTHT bông tuyết (Isaria tenuipes) trên giá thể nhân tạo.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM    HOÀNG QUỐC BẢO ĐIỀU TRA THÀNH PHẦN LOÀI NẤM ĐƠNG TRÙNG HẠ THẢO TẠI VƯỜN QUỐC GIA HỒNG LIÊN VÀ NGHIÊN CỨU NI TRỒNG LỒI ĐƠNG TRÙNG HẠ THẢO BÔNG TUYẾT (ISARIA TENUIPES) LUẬN ÁN TIẾN SỸ LÂM NGHIỆP CHUYÊN NGHÀNH ĐÀO TẠO MÃ SỐ : : QUẢN LÝ TÀI NGUYÊN RỪNG 9620211 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : GS.TS PHẠM QUANG THU HÀ NỘI - NĂM 2018 i MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ CÁC KÝ HIỆU .xix DANH MỤC CÁC BẢNG xx DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ xxi MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1 Hệ thống giới Nấm 1.2 Hình thái cấu trúc sợi nấm 13 1.2.1 Sợ nấm 13 1.2.2 Quả thể .14 1.2.3 Quả thể đệm .14 1.2.4 Nang nấm 14 1.2.5 Bào tử nấm 15 1.3 Nấm ký sinh côn trùng .15 1.3.1 Khái niệm 15 1.3.2 Chu trình sống lây nhiễm nấm ký sinh trùng 16 Tình hình nghiên cứu nhóm nấm Đơng trùng hạ thảo giới 20 1.4.1 Nghiên cứu phân loại, thành phần lồi nhóm nấm Đơng trùng hạ thảo 20 1.4.2 Nghiên cứu thành phần hóa học cuả nhóm nấm Đơng trùng hạ thảo 23 1.4.3 Nghiên cứu giá trị dược liệu nhóm nấm Đơng trùng hạ thảo .25 1.4.4 Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối hệ sợi nuôi trồng thể đệm giá thể nhân tạo .29 1.5 Nghiên cứu nhóm nấm Đơng trùng hạ thảo Việt Nam 31 ii 1.5.1 Nghiên cứu thành phần lồi lồi nấm ký sinh trùng nhóm nấm Đơng trùng hạ thảo .31 1.5.2 Nghiên cứu thành phần hóa học giá trị dược liệu nấm Đơng trùng hạ thảo 37 1.5.3 Nghiên cứu nuôi trồng 38 1.6 Đặc điểm tự nhiên khu vực nghiên cứu 40 1.6.1 Vị trí địa lý 40 1.6.2 Địa hình, địa mạo .41 1.6.3 Địa chất thổ nhưỡng 42 1.6.4 Khí hậu, thủy văn .43 1.6.5 Thực vật 44 1.6.6 Động vật .45 Chương NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47 2.1 Nội dung nghiên cứu 47 2.1.1 Thành phần lồi nấm Đơng trùng hạ thảo VQG Hoàng Liên 47 2.1.2 Xác định số đa dạng lồi nấm Đơng trùng hạ thảo 47 2.1.3 Nghiên cứu nuôi trồng thể nấm ĐTHT tuyết (Isaria tenuipes) giá thể nhân tạo .47 2.1.4 Xây dựng hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo tuyết giá thể nhân tạo 47 2.2 Vật liệu nghiên cứu 48 2.3 Phương pháp nghiên cứu 48 2.3.1 Các bước nghiên cứu 48 2.3.2 Phương pháp điều tra thu mẫu nấm Đông trùng hạ thảo Vườn Quốc gia Hoàng Liên giám định mẫu thu 49 2.3.3 Phương pháp xác định số đa dạng loài nấm Đơng trùng hạ thảo Vườn Quốc gia Hồng Liên 51 2.3.4 Phương pháp nghiên cứu nuôi trồng thể nấm ĐTHT tuyết (Isaria tenuipes) giá thể nhân tạo 54 iii 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 59 2.4 Xây dựng hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng nấm ĐTHT tuyết (Isaria tenuipes) giá thể nhân tạo .59 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 60 3.1 Thành phần loài nấm ĐTHT Vườn Quốc gia Hoàng Liên 60 3.2 Đánh giá đa dạng sinh học phân bố lồi nấm Đơng trùng hạ thảo VQG Hoàng Liên 90 3.2.1 Đa dạng thành phần loài, tần suất xuất 90 3.2.2 Đa dạng phân bố 92 3.2.3 Đa dạng ký chủ 106 3.2.4 Đa dạng giá trị sử dụng giá trị dược liệu .107 3.3 Nghiên cứu nuôi trồng thể nấm ĐTHT tuyết (Isaria tenuipes) giá thể nhân tạo 109 3.3.1 Nghiên cứu mơi trường thích hợp tạo giống gốc .109 3.3.2 Nghiên cứu nuôi trồng thể đệm giá thể lỏng 111 3.3.3 Nghiên cứu khả hình thành thể giá thể rắn 119 3.3.4 Nghiên cứu khả hình thành thể đệm giá thể nhộng tằm 123 3.4 Xây dựng hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng nấm ĐTHT tuyết (Isaria tenuipes) giá thể nhân tạo .127 3.4.1 Hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng nấm I tenuipes giá thể lỏng 128 3.4.2 Hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng nấm I tenuipes giá thể rắn129 3.4.3 Hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng nấm I tenuipes giá thể nhộng tằm 130 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 133 Kết luận 133 Khuyến nghị 134 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 135 iv TÀI LIỆU THAM KHẢO 136 Tài liệu tiếng Việt 136 Tài liệu tiếng nước 142 PHỤ LỤC 150 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ CÁC KÝ HIỆU Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ ĐTHT Đông trùng hạ thảo rAND Ribosom Acid Deoxyribo Nucleic EPF Nấm ký sinh côn trùng -Entomology phathogenic fungi PDA Potato Dextrose Agar PYEG Peptone Yeast Extract Glucose CSA Carrot extract Sucrose Agar MEA Malt Extract Agar VQG Lsd Vườn Quốc gia Khoảng sai dị Fpr Xác suất kiểm tra F vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Số lượng loài giống số Nấm Việt Nam so sánh với Trung Quốc Thế giới 11 Bảng 1.2 Thành phần sinh hố ngun tố khống nấm Đơng trùng hạ thảo Isaria tenuipes 24 Bảng 1.3 Thành phần acid amin nấm Đông trùng hạ thảo I tenuipes 24 Bảng 1.4 Thành phần vitamin nấm Đông trùng hạ thảo I tenuipes 25 Bảng 3.1: Thành phần loài nấm Đơng trùng hạ thảo Vườn quốc gia Hồng Liên - Lào Cai .60 Bảng 3.2: Tính đa dạng thành phần loài tần xuất xuất lồi nấm Đơng trùng hạ thảo Vườn quốc gia Hoàng Liên 90 Bảng 3.3 Phân bố nấm ĐTHT theo sinh cảnh 92 Bảng 3.4 Phân bố nấm ĐTHT theo đai độ cao .97 Bảng 3.5 Phân bố nấm ĐTHT theo độ tàn che 101 Bảng 3.6 Tổng hợp số lượng nấm ĐTHT phân bố theo thời gian 103 Bảng 3.7 Tổng hợp số lượng, tỷ lệ thành phần Bộ trùng ký chủ lồi nấm ĐTHT thu VQG Hoàng Liên 106 Bảng 3.8 Giá trị sử dụng loài nấm ĐTHT thu VQG Hoàng Liên 107 Bảng 3.9 Kết sinh trưởng, phát triển giống nấm gốc môi trường dịch thể 110 Bảng 3.10: Kết nuôi trồng thể đệm nấm I tenuipes giá thể lỏng .112 Bảng 3.11: Kết nuôi trồng thể đệm nhiệt độ khơng khí khác .115 Bảng 3.12: Kết nuôi trồng thể đệm mơi trường có pH khác nhau117 Bảng 3.13: Sinh trưởng hệ sợi nấm tốc độ lắc khác 119 Bảng 3.14 : Kết nghiên cứu nuôi trồng nấm I tenuipes giá thể rắn121 Bảng 3.15: Kết nuôi trồng nấm I tenuipes công thức giá thể nhộng tằm .124 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ Hình 1.1 Chu trình xâm nhiễm nấm ký sinh côn trùng 17 vii Hình 1.2 Cơ chế xâm nhiễm nấm ký sinh trùng .19 Hình 1.3 Sơ đồ kiểu khí hậu huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai .44 Hình 3.2 (a) Nấm B bassiana ký sinh bọ cánh cứng, (b) Bào tử vô tính nấm B bassiana, (c) Hệ sợi nấm B bassiana mơi trường PDA 67 Hình 3.3 (a) Nhộng bị nấm Beauveria sp nov ký sinh; (b) Bào tử vơ tính; (c) Thể đệm hình thành ni khiết mơi trường PDA 70 Hình 3.4 Thể đệm C cardinalis 71 Hình 3.5 (a) Thể đệm C.militaris, (b) Túi bào tử nấm C.militaris chứa bào tử đứt đoạn, (c) Hệ sợi nấm C.militaris nuôi cấy khiết 73 Hình 3.6 Thể đệm C pseudomilitaris 74 Hình 3.7 (a) Thể đệm C takaomontana (giai đoạn hữu tính) I tenuipes (giai đoạn vơ tính); (b) Bào tử túi C takaomontana; (c) Bào tử vơ tính I tenuipes; (c) Hệ sợ I tenuipes môi trường PDA 75 Hình 3.8 (a)Thể đệm nấm I cateniannulatus; (b) Bào tử vơ tính nấm I cateniannulatus 77 Hình 3.9 (a) Thể đệm I tenuipes; (b) Bào tử vô tính (c) Thể đệm hình thành ni cấy khiết môi trường PDA 78 Hình 3.10 Thể đệm Isaria sp.nov.; (b)Bào tử vơ tính; (c) (c) Hệ sợi chủng HL46, (d) Hệ sợi chủng HL15 81 Hình 3.11 (a) Thể đệm O annulata, (b) Túi bào tử, (c) Bào tử túi 82 Hình 3.12 (a) Thể đệm O crinalis, (b) Túi bào tử chứa bào tử túi đứt đoạn 83 Hình 3.13 (a) Thể đệm O formicarum (b) Túi bào tử nấm O formicarum 84 Hình 3.14 (a) Thể đệm O formosana, (b) Túi bào tử nấm O formosana 85 Hình 3.15 Thể đệm O myrmecophila 86 Hình 3.16 (a) Thể đệm O.nutans; (b) Túi bào tử nấm O.nutans chứa bào tử túi đứt đoạn; (c) Thể đệm O.nutans hình thành ni cấy khiết môi trường PDA 88 viii Hình 3.17 (a) Nấm O oxycephala ký sinh ong; (b) Hệ sợi nấm O oxycephala nuôi cấy khiết 89 Hình 3.18 (a) Thể đệm O sphaecocephala; (b) Túi bào tử O sphaecocephala; (c) Thể đệm O sphaecocephala nuôi cấy khiết môi trường PDA 90 Hình 3.19 A - Giống nấm công thức CT1; B - Giống nấm công thức CT2.111 Hình 3.20 Thể đệm nấm I tenuipes từ nguồn giống nấm gốc khác .111 Hình 3.21: Thể đệm nấm I tenuipes nuôi giá thể lỏng A - Thể nấm xuất bào tử; B - Thể nấm phân hủy 113 Hình 3.22: Thể đệm nấm I tenuipes nuôi giá thể lỏng 114 Hình 3.23: Thể đệm ni nhiệt độ khơng khí khác 116 Hình 3.24: Thể đệm ni mơi trường có pH khác 118 Hình 3.25 Giống nấm I tenuipes A: Tốc độ lắc 150 vòng/phút; B: Tốc độ lắc 110 vòng/phút 120 Hình 3.26: Thể đệm nuôi trồng giá thể rắn 123 Hình 3.27: Nấm nhiễm phương thức tiêm giống vào nhộng .126 Hình 3.28: Nấm nhiễm phương thức phun giống vào nhộng 126 Hình 3.29: Nấm I tenuipes nhiễm phương thức phun giống vào sâu non tuổi 126 Hình 3.30 Thể đệm tươi (A)và khô (B) nấm I tenuipes .132 Biểu đồ 3.1 Số lượng nấm ĐTHT phân bố theo thời gian 105 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Nấm Đơng trùng hạ thảo (còn gọi Đông trùng thảo, Trùng thảo hay Hạ thảo Đơng trùng) lồi nấm ký sinh sâu non nhộng sâu trưởng thành số loại côn trùng Sâu non, sâu trưởng thành số lồi trùng nằm đất mặt đất bị nấm ký sinh, xâm nhiễm sử dụng chất thể côn trùng làm thức ăn, làm cho côn trùng chết Mùa đông, giai đoạn nhiệt độ ẩm độ khơng khí thấp, nấm ký sinh dạng hệ sợi Đến mùa hè, nhiệt độ ẩm độ khơng khí cao hình thành thể nhú lên khỏi mặt đất gốc dính liền vào thân sâu Vì mùa đơng nấm tồn dạng hệ sợi sâu, mùa hạ mọc thành nấm nên có tên đơng trùng hạ thảo Nấm Đơng trùng hạ thảo lồi nấm đánh giá cao giá trị dược liệu, nhờ có hợp chất cordycepin thành phần hố học thể nấm Đây hợp chất có khả ức chế hoạt động trình sinh tổng hợp tế bào ung thư Tác dụng kìm hãm tế bào ung thư vú, ung thư phổi, ung thư máu nhiều nhà khoa học như: Yoo et al., (2004) [107]; Ahn et al., (2000) [48] nghiên cứu phát Theo y học cổ truyền Trung Quốc, nấm Đông trùng hạ thảo dùng để điều trị chứng rối loạn lipit máu, rối loạn nhịp tim, viêm thận mạn tính, cao huyết áp, ung thư phổi, thiểu sinh dục viêm gan B mạn tính Nấm Đơng trùng hạ thảo Nan et al., (2001) [89] chứng minh có hiệu chữa trị bệnh rối loạn chức gan Ngoài nấm có tác dụng chống viêm kìm hãm oxy hố lipit lipoprotein Khơng lồi nấm Đơng trùng hạ thảo phát có hàm lượng dinh dưỡng cao: giàu vitamin A, vitamin B6, vitamin B12, vitamin B3, vitamin B1… có hàm lượng protein cao, nhiều nguyên tố khoáng Zn, Se, Cu Như giá trị lồi nấm Đơng trùng hạ thảo vơ quý giá Least significant differences of means (5% level) Table rep d.f l.s.d pH 30 203 1.891 116 DELETE [REDEFINE=yes] _mean, _rep, _var, _resid, _rdf, _scode 117 AKEEP [FACTORIAL=9] pH; MEAN=_mean; REP=_rep; VARIANCE=_var; RTERM=_resid; STATUS=_scode 118 IF _scode.IN.!(1,2) 119 AKEEP [FACTORIAL=9] #_resid; DF=_rdf 120 AMCOMPARISON [METHOD=duncan; DIRECTION=ascending; PROB=0.05] pH Duncan's multiple range test pH CT6 CT7 CT2 CT1 CT3 CT4 CT5 Mean 40.50 41.80 44.20 47.40 49.10 51.30 55.70 a a b c c d e 121 ELSE 122 PRINT !t('Multiple comparisons available only if all components of the term',\ 123 'are estimated with equal efficiency and in the same stratum.');\ 124 JUST=left 125 ENDIF 126 "General Analysis of Variance." 127 BLOCK "No Blocking" 128 TREATMENTS pH 129 COVARIATE "No Covariate" 130 ANOVA [PRINT=aovtable,information,means; FACT=32; CONTRASTS=7; PCONTRASTS=7; FPROB=yes;\ 131 PSE=diff,lsd,means; LSDLEVEL=5] Trongluongtuoi Analysis of variance Variate: Trongluongtuoi Source of variation pH Residual Total d.f 203 209 s.s 14057.21 2100.51 16157.72 m.s 2342.87 10.35 v.r 226.42 F pr