Luận án được nghiên cứu với mục tiêu nhằm xác định được thành phần, tính đa dạng các loài nấm ĐTHT tại VQG Hoàng Liên và cơ sở khoa học trong việc nuôi trồng loài nấm ĐTHT bông tuyết (Isaria tenuipes).
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Nhóm nấm Đơng trùng hạ thảo (ĐTHT) được đánh giá cao về giá trị dược liệu nhờ có hợp chất cordycepin trong thể quả nấm. Đây là hợp chất có khả năng ức chế hoạt động của các tế bào ung thư. Nấm còn có tác dụng chống viêm và giàu khống Như vậy giá trị của lồi nấm ĐTHT là vơ cùng q giá Tuy nhiên khu hệ nấm Vườn Quốc gia Hồng Liên còn chưa có nhiều nghiên cứu. Những hiểu biết về đa dạng thành phần lồi, đặc điểm sinh học và giá trị sử dụng còn đang rất hạn chế Việc nhân ni nguồn dược liệu q, mở ra một hướng đi mới trong việc phát triển kinh tế, tạo sản phẩm du lịch đặc trưng mang thương hiệu ĐTHT Sapa Do vậy, đề tài: “Điều tra thành phần lồi nấm Đơng trùng hạ thảo tại Vườn Quốc gia Hồng Liên, nghiên cứu ni trồng lồi Đơng trùng hạ thảo bơng tuyết (Isaria tenuipes) đặt ra là rất cần thiết, có ý nghĩa cả về lý luận và thực tiễn 2. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung: Xác định được thành phần, tính đa dạng các lồi nấm ĐTHT tại VQG Hồng Liên và cơ sở khoa học trong việc ni trồng lồi nấm ĐTHT bơng tuyết (Isaria tenuipes) Mục tiêu cụ thể: Xac đinh đ ́ ̣ ược thành phần lồi nấm ĐTHT tại VQG Hồng Liên Xac đinh đ ́ ̣ ược tính đa dạng và đặc điểm sinh học của các lồi nấm ĐTHT thu được tại VQG Hồng Liên Xây dựng hướng dẫn kỹ thuật ni trồng lồi nấm ĐTHT bơng tuyết trên giá thể nhân tạo 3. Đối tương, phạm vi nghiên cứu Giới hạn đối tượng nghiên cứu Nhóm nấm Đơng trùng hạ thảo tại VQG Hồng Liên Nấm Đơng trùng hạ thảo bơng tuyết (Isaria tenuipes) Giới hạn địa điểm nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu được giới hạn trong phạm vi VQG Hồng Liên, tỉnh Lào Cai Phân lập và ni trồng nấm Đơng trùng hạ thảo tại phòng thí nghiệm của Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam 4. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và đóng góp mới của luận án 4.1. Ý nghĩa khoa học: Đóng góp các dữ liệu khoa học về thành phần lồi, tính đa dạng và đặc điểm sinh học của nấm ĐTHT; góp phần xây dựng luận cứ khoa học cho việc ni trồng thành cơng thể quả đệm lồi nấm ĐTHT bơng tuyết (Isaria tenuipes) trên giá thể nhân tạo 4.2. Ý nghĩa thực tiễn: (1) Kết quả nghiên cứu của luận án xác định được thành phần lồi nấm ĐTHT tại VQG Hồng Liên, tỉnh Lào Cai. (2) Xác định được cơ sở khoa học và xây dựng hướng dẫn kỹ thuật ni trồng thành cơng lồi nấm ĐTHT bơng tuyết (Isaria tenuipes) trên giá thể nhân tạo 4.3. Những đóng góp mới của luận án (1) Lần đầu tiên xác định được danh mục gồm với 15 lồi Đơng trùng hạ thảo thuộc 3 chi gồm: Cordyceps, Isaria (Cordycipitaceae) và Ophiocordyceps (Ophiocordycipitaceae) và ba lồi nấm ký sinh cơn trùng giai đoạn vơ tính thuộc chi: Metarhizium (Clavicipitaceae) and Beauveria (Cordycipitaceae). Q trình phân lập đã phát hiện hai mẫu nấm mới cho khoa học là Beauveria sp. và Isaria sp. Mơ tả chi tiết đặc điểm hình dạng, sinh thái và các chỉ số đa dạng sinh học của các lồi nấm thu thập được. (2) Nghiên cứu ni trồng thành cơng thể quả đệm I. tenuipes trên giá thể nhân tạo: giá thể rắn, giá thể lỏng và trên nhộng tằm. Nhiễm nấm vào sâu non nhộng tằm ở tuổi 5 (trước khi hóa nhộng) cho kết quả tốt nhất CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1. 1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 1.1.1. Nghiên cứu về phân loại, thành phần lồi Năm 1843, Berkeley xuất bản kết quả nghiên cứu về một lồi nấm ĐTHT và đặt tên nấm là Sphaeria sinensis. Đến năm 1878, tên này được đổi Cordyceps sinensis bởi Pier Andrea Saccardo. Năm 2007, khi sử dụng phương pháp sinh học phân tử để phân loại đã tạo ra tên gọi cho họ Ophiocordycipitaceae việc chuyển số lồi Cordyceps sang chi Ophiocodyceps (Sung et al., 2007) Nhóm nấm ĐTHT được xác định khoảng 700 lồi Các lồi trên xếp 162 đơn vị phân loại, gồm chi chủ yếu là: Cordyceps, Elaphocordyceps, Metacordyceps và Ophiocordyceps thuộc 2 họ Cordycipitaceae và Ophiocordycipitaceae (Sung et al., 2007) Chi Isaria bao gồm các lồi phân bố khá rộng và thường gặp. Đến năm 2007, nghiên cứu của Sung đã xếp Isaria thuộc ngành Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Cordycipitaceae. 1.1.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học Chất Trichothecene mycotoxin tách chiết từ quả thể của Isaria japonica có tác dụng trong chữa trị đối với người người bị bệnh bạch cầu. Sakakura et al., 2005 [54] đã phát hiện hợp chất mới chống oxy hóa pseudodipeptide và tiền chất của nó được chiết xuất từ I. japonica Các hoạt chất sinh học có trong Isaria đã được nghiên cứu ứng dụng nhiều nước trên thế giới. (Sano et al., 1995) đã phát hiện trong các chất trao đổi tách chiết từ Isaria sinclairii có cơ chế ức chế miễn dịch để tổng hợp bất đối xứng ISPI (Myriocin, Thermozymocidin). Theo kết quả nghiên cứu của (Kikuchi et al., 2004) cho thấy nấm I tenuipes chứa Paecilomycine A, B và C là các hoạt chất có hoạt tính sinh học cao 1.1.3. Nghiên cứu về giá trị dược liệu Nấm Đơng trùng hạ thảo được dùng để điều trị thành cơng các chứng rối loạn lipit máu, viêm phế quản, hen phế quản, viêm thận, suy thận, rối loạn nhịp tim, cao huyết áp và thiểu năng sinh dục Nấm Cordyceps có thể nâng cao sức luyện tập, khả năng chịu đựng và làm giảm mệt mỏi ở những người trong độ tuổi 40 70 Nấm I. tenuipes có giá trị cao về mặt dược liệu. Các hoạt chất Ergosterol peroxide và Acetoxyscirpenediol tách chiết từ nấm I. tenuipes có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư ở người như tế bào khối u dày, tế bào ung thư gan Hợp chất 4acetyl12,13epoxyl9 trichothecene3,15diol của nấm I. tenuipes đang được dùng để điều trị bệnh ung thư, đặc biệt là bệnh máu trắng ở các nước trên thế giới (Paea et al., 2003). 1.1.4. Nghiên cứu về ni cấy sinh khối hệ sợi và ni trồng thể quả đệm trên giá thể nhân tạo Thái Lan đã nghiên cứu phân lập và sự sinh trưởng của hệ sợi và hình thành bào tử chồi của nấm Cordyceps unilateralis ký sinh kiến Khả năng nhân sinh khối của I. tenuipes trên các mơi trường khác nhau đã được quan tâm nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới. Khi nhân sinh khối các điều kiện ni như nguồn dinh dưỡng cacbon, khống, nitơ và độ pH ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng phát triển của nấm. Theo Ji cộng sự, 2011, dạng bào tử vơ tính Isaria tenuipes đã được ni cấy trên mơi trường có chứa nhộng tằm, kết quả cho thấy tỷ lệ sống cao nhất đạt 97,6% trên các giống tằm được thử nghiệm. 1.2. Nghiên cứu về nấm ĐTHT ở Việt Nam 1.2.1. Nghiên cứu về thành phần lồi Đến nay ở Việt Nam đã có 38 cơng trình nghiên cứu, hiện đã cơng bố có 85 lồi, 18 chi thuộc họ Hypocreales; họ Clavicipitaceae có 35 lồi, họ Cordycipitaceae có 20 lồi, họ Ophiocordycipitaceae có 30 lồi. Có 55 dạng lồi chưa định danh đến lồi 1.2.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học và giá trị dược liệu Phạm Quang Thu (2011) đã xác định các chủng nấm C. militaris đều sản sinh ra hợp chất cordycepin trong dịch ni cấy. Theo Lê Thị Thu Hiền (2015) ĐTHT có tác dụng chống ung thư và việc sử dụng kết hợp với một số phương pháp khác như hóa trị, xạ trị có tác dụng ngăn chặn di căn của tế bào ung thư 1.4.3. Nghiên cứu về ni trồng Phạm Quang Thu (2011) đã nghiên cứu và xây dựng thành cơng quy trình ni trồng nấm ĐTHT C. militaris trên giá thể. Điều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng hệ sợi của nấm C. militaris là mơi trường P55, pH = 6,5%, nhiệt độ 200C, ẩm độ 80%, (Nguyễn Thị Mi et al., 2015). Nguyễn Mậu Tuấn và cộng sự, 2013 đã nghiên cứu sản xuất nấm ĐTHT tằm dâu, P. tenuipes trên giá thể nhộng tằm, Bombyx mori L Nhận xét chung: Các nghiên cứu về thành phần lồi, thành phần hóa học, giá trị dược liệu và ni trồng được tiến hành nhiều nước trên thế giới và đạt được kết quả tốt. Ở Việt Nam đến nay đã có 38 cơng trình nghiên cứu, hiện đã cơng bố có 85 lồi, 18 chi thuộc 3 họ của bộ Hypocreales Các nghiên cứu trong nước cũng đã hồn thiện quy trình kỹ thuật ni cấy thành cơng một số lồi nấm ĐTHT có dược tính q và ứng dụng thành cơng một số lồi nấm ký sinh cơn trùng trong phòng trừ sinh học. Tuy nhiên chưa có một cơng trình nghiên cứu chi tiết, đầy đủ và mang tính hệ thống về ĐTHT VQG Hồng Liên và về ni trồng ĐTHT bơng tuyết (I. tenuipes) trên giá thể nhân tạo. Chương 2 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu 2.1.1. Nghiên cứu thành phần lồi nấm ĐTHT tại VQG Hồng Liên Điều tra, thu mẫu, xác định mẫu nấm ĐTHT Mơ tả, giám định các lồi ĐTHT thu được ở khu vực nghiên cứu Lập danh lục các lồi nấm ĐTHT thu được 2.1.2. Xác định các chỉ số đa dạng các lồi nấm Đơng trùng hạ thảo Các chỉ số đa dạng bao gồm: Đa dạng về thành phần lồi, tần suất xuất hiện, đa dạng về phân bố, đa dạng về ký chủ, đa dạng về giá trị dược liệu 2.1.3. NC ni trồng nấm ĐTHT bơng tuyết trên giá thể nhân tạo (1) Nghiên cứu mơi trường thích hợp tạo giống gốc (2) Nghiên cứu ni trồng thể quả đệm trên giá thể lỏng Nghiên cứu mơi trường dịch thể tối ưu cho ni trồng thể quả đệm Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ khơng khí đến sinh trưởng và phát triển của nấm Nghiên cứu ảnh hưởng của pH mơi trường đến sinh trưởng và phát triển của nấm. (3) Nghiên cứu ni trồng thể quả đệm trên giá thể rắn Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến q trình nhân giống dịch thể Nghiên cứu khả năng hình thành thể quả đệm trên giá thể rắn (4) Nghiên cứu ni trồng thể quả đệm trên giá thể nhộng tằm 2.1.4. XD HDKT ni trồng nấm ĐTHT bơng tuyết trên giá thể nhân tạo 2.2. Vật liệu nghiên cứu Các lồi nấm ĐTHT tại VQG Hồng Liên Nấm ĐTHT bơng tuyết (Isaria tenuipes) 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp điều tra thu mẫu và giám định mẫu thu được Điều tra thành phần theo phương pháp Phạm Quang Thu (2011) Định danh bằng khóa phân loại của Sung (2007), Kobayasi (1982), Sung (2000). Đồng thời sử dụng phương pháp sinh học phân tử 2.3.2. Phương pháp xác định các chỉ số đa dạng + Đa dạng về thành phần lồi, tần suất xuất hiện: Các lồi nấm thu được trong khu vực điều tra được phân tích đánh giá theo % số lồi thuộc các chi nấm. Tần suất xuất hiện của lồi được chia làm 3 cấp: rất phổ biến > 30%, khá phổ biến 10% ≤ 30% và ít phổ biến