Quy trìnhKhử trùng dụng cụ lọcLọc chân khôngNuôi cấy màng lọc trên môi trường dinh dưỡngĐếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa petriTiến hành Lắc đều mẫu trước khi tiến hành pha loãngDùng pipet hút 1ml từ dung dịch pha loãng 110 cho vào trong ống nghiệm chứa sẵn 9ml dung dịch pha loãng, lắc kỹ ống nghiệm chứa mẫu. Bỏ đầu pipet vừa sử dụng, dùng một pipet mới thực hiện lại thao tác như trên với độ pha loãng tiếp theo.
BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TPHCM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM TIỂU LUẬN MÔN: KỸ THUẬT PHÂN TÍCH VI SINH NÂNG CAO ĐỀ TÀI: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ DANH SÁCH NHĨM GVHD : TH.S BÙI HỒNG QN LỚP : DHTP11D NHĨM : Tp Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 09 năm 2018 MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU Cùng với phát triển xã hội, chất lượng sống người ngày cải thiện Vấn đề ăn uống ngày đòi hỏi cao, họ khơng ăn để no mà ăn để khỏe, đẹp đặc biệt sản phẩm phải đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm Để đáp ứng nhu cầu người tiêu dùng, đòi hỏi sản phẩm thực phẩm phải kiểm soát nghiêm ngặt đặc biệt tiêu vi sinh Một tiêu xác định mức độ vệ sinh thực phẩm tổng vi sinh vật hiếu khí Vậy vi sinh vật hiếu khí gì? Và có phương pháp để xác định tổng vi sinh vật hiếu khí? Hơm tìm hiểu Tổng quan 1.1 Vi sinh vật hiếu khí gì? Vi sinh vật hiếu khí sinh vật tồn phát triển mơi trường oxy hóa 1.2 Phân loại Phân loại theo mục đích thực tế có bốn loại sinh vật tồn phát triển mơi trường oxy hóa: • Sinh vật hiếu khí bắt buộc (Obligate aerobe): cần oxy để phát triển Trong trình gọi hô hấp tế bào, sinh vật sử dụng oxy để oxy hóa chất (ví dụ loại đường chất béo) tạo lượng • Sinh vật yếm khí tuỳ ý (Facultative anaerobe): phát triển mà không cần oxy, sử dụng oxy diện • Sinh vật hiếu khí chuộng cần cung cấp oxy cho sản xuất lượng, bị tổn hại nồng độ khí oxy (21% O2) • Sinh vật yếm khí khơng bắt buộc (Aerotolerant organism), sử dụng oxy để tăng trưởng, chịu đựng diện oxy 1.3 Tổng vi sinh vật hiếu khí Là sinh vật thị Do đó, tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí sử dụng để đánh giá chất lượng vệ sinh độ an toàn thực phẩm Tổng số vi sinh vật hiếu khí diện mẫu thị mức độ vệ sinh thực phẩm , đánh giá chất lượng mẫu vi sinh vật, nguy hư hỏng, thời hạn bảo quản sản phẩm, mức độ vệ sinh trình bảo quản chế biến thực phẩm Một số phương pháp xác định tổng vi sinh vật hiếu khí 2.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc 2.1.1 Nguyên tắc Ủ vi sinh vật mẫu thực phẩm cần phân tích điều kiện nhiệt độ 30 0C 72 Sau tính lượng vi sinh vật 1g mL mẫu từ số lượng khuẩn lạc thu đĩa chọn 2.1.2 Mơi trường hóa chất - - Mơi trường Plate count agar (PCA) • Casein peptone: 5g • Cao nấm men: 2.5g • Dextrose: 1g • Agar: 15g • Nước cất đủ 1000ml Cân đầy đủ thành phần môi trường, phối trộn, điều chỉnh pH= 7.0 Nấu sôi nhẹ cho tan agar Phân phối môi trường vào bình tam giác Hấp tiệt trùng - 121/ 20 phút, để ấm (45-50) phân phối vào đĩa petri • Nước muối sinh lý 0.9% • Nước cất vơ trùng • Cồn 96 Ngun liệu khác: • Nước mía • Thịt tươi • Túi nilon dập mẫu 2.1.3 Tiến hành thí nghiệm - 2.1.3.1 Lấy mẫu Tùy thuộc vào loại vật phẩm cần xác định mà ta lấy mẫu để nghiên cứu với số lượng khối lượng khác cho phù hợp Quá trình lấy mẫu có u cầu sau: • Lấy mẫu có tính chất đại diện, lượng mẫu vừa đủ • Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vơ trùng • Mẫu lấy xong phải phân tích ngay, khơng để q 24 • Mẫu lấy phải có nhãn ghi kí hiệu đồng thời phải ghi vào sổ đặc - điểm mẫu nơi lấy mẫu 2.1.3.2 Pha lỗng mẫu Chuẩn bị bình tam giác 250ml chứa 90ml nước muối sinh lý 0.9% nước pepton 1% vô trùng số ống nghiệm chứa 9ml nước muối nước pepton - vô trùng số pipette 1ml vơ trùng • Với mẫu dạng lỏng Hút 1ml mẫu nghiên cứu cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý vô trùng Trộn dung dịch cách hút lên, thổi xuống 3-5 lần Ta độ - pha loãng 1/10 hay Tiếp tục hút 1ml ống nghiệm cho vào ống nghiệm có 9ml nước muối sinh lý vô trùng thứ Trộn dung dịch cách hút lên, thổi xuống 3-5 lần Ta - độ pha loãng 1/100 hay Tiếp tục hút từ ống sang ống 3, từ ống sang ống ta có độ - pha lỗng tương ứng , • Với mẫu dạng rắn Chuẩn bị hai bình tam giác có dung tích 250 ml Bình chứa 90 ml nước muối sinh lý nước pepton 1% vơ trùng Bình vơ trùng khơng chứa Cho cồn vào cối chày sứ đốt lên để khử trùng, để nguội Cân 10 gam mẫu cho vào cối chày sứ, nghiền nát mẫu đồng mẫu - túi dập mẫu với máy dập mẫu Dùng tồn nước bình để chuyển mẫu sang bình Lắc phút Để lắng 30 giây tiếp tục pha loãng trường hợp mẫu trạng thái - lỏng Tùy theo ước đoán số lượng vi sinh vật mẫu mà pha loãng nhiều - hay Sau có độ pha lỗng kết hợp tiến hành xác định số lượng vi sinh vật Hình 2.1.3.2 Phương pháp pha lỗng bậc 10 dd huyền phù 2.1.3.3 Quy trình Mẫu Đồng mẫu Pha loãng mẫu Pha loãng mẫu thành nồng độ , , Cấy mẫu Chọn ba nồng độ thích hợp Phương pháp đổ đĩa phương pháp cấy trải ủ ( 24-72 giờ) Tính kết Chọn đĩa có số khuẩn lạc khoảng 25-250/ đĩa 2.1.4 Xác định gián tiếp số lượng tế bào cách đếm số lượng khuẩn lạc mọc môi trường thạch (ISO 4833:1991) - 2.1.4.1 Nguyên tắc Cấy thể tích xác định huyền phù cần nghiên cứu môi trường đặc trưng - hộp petri Xác định số lượng tế bào cách đến số lượng khuẩn lạc mọc lên sau thời - gian ni cấy khuẩn lạc kết phát triển tế bào 2.1.4.2 Cách lấy mẫu • Cấy theo phương pháp tạo hộp đổ Phã loãng dịch huyền phù nồng độ khác , , để cấy mẫu Ghi vào nắp hộp petri có mơi trường thạch thơng tin: nồng độ pha lỗng, - ngày cấy Dùng pipette vô trùng lấy ml dung dịch huyền phù cho vào đĩa petri - vô trùng Cho khoảng 15ml môi trường PCA nhiệt độ khoảng 45vào hộp petri Xoay chậm cho hỗn hợp trộn Để yên cho nguội Lật ngược cho vào tủ ấm nuôi - cấy 30trong 72 Mỗi mẫu cấy ba nồng độ Mỗi nồng độ cấy ba hộp petri Sau lấy kiểm tra kết - • Phương pháp cấy bề mặt Dịch huyền phù chuẩn bị tương tự phương pháp tạo hộp đổ Môi trường PCA sau hấp tiệt trùng, làm nguội đến khoảng 50-60sau - đổ vào đĩa petri vô trùng Đĩa petri chứa môi trường làm khô bề mặt cách sấy tủ sấy - nhiệt độ 35hãy chuẩn bị trước ngày Dùng pipet vơ trùng hút xác 0,1 ml 0,3 ml nhỏ lên bề mặt môi - trường đĩa petri Trải dung dịch vi sinh vật lên bề mặt môi trường que trải tam giác - thủy tinh Các đĩa petri để nhiệt độ phòng 15 đến 20 phút cho khô bề mặt Lật ngược cho vào tủ ấm nuôi cấy 30trong 72 Mỗi mẫu cấy ba nồng độ Mỗi nồng độ cấy ba hộp petri Sau lấy kiểm tra kết 2.1.5 Cách đếm cơng thức - • Cách đếm thủ cơng Lấy bút chì kẻ hai đường vng góc đáy hộp petri đánh dấu thứ tự - vùng I, II, III, IV Đếm số lượng khuẩn lạc vùng Nhớ đánh dấu khuẩn lạc đếm - • Cơng thức tính Số lượng tế bào gram mẫu tính theo cơng thức sau đây: N (CFU/ml hay CFU/g) = o Trong đó: 10 - N: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn 1g hay 1ml mẫu - (CFU: colony forming units) C: tổng số khuẩn lạc đếm hộp petri chọn (có số khuẩn lạc nằm - khoảng từ 25-250 khuẩn lạc/đĩa) : số hộp đĩa petri cấy độ pha loãng thứ n : hệ số pha loãng tương ứng : thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào đĩa 2.1.6 Những điểm cần lưu ý - Khi tiến hành pha loãng mẫu, dung dịch phải hút thể tích yêu - cầu Đối với phương pháp tạo hộp đổ, môi trường nuôi cấy sau hấp tiệt trùng phải làm nguội đến 45 đến 50bằng bể ổn nhiệt trước đổ vào đĩa petri - chứa dung dịch vi sinh vật Các đĩa petri nuôi cấy vi sinh vật phải lập úp trước nuôi ủ để tránh - khuẩn lạc bên mặt mộc loang Trong q trình đếm khuẩn lạc, khơng mở hộp petri Que trải thủy tinh dùng để trải dung dịch vi sinh vật khử trùng cách nhúng vào cồn 96 đốt không hơ trực tiếp lửa đèn cồn 2.2 Phương pháp màng lọc 2.2.1 Giới thiệu kỹ thuật lọc màng Bộ lọc màng (MF) giới thiệu vào cuối năm 1950 kỹ thuật thay cho hầu hết quy trình định lượng để phân tích vi sinh mẫu nước Kỹ thuật MF cung cấp lợi việc cô lập khuẩn lạc riêng biệt vi khuẩn, phương pháp MPN cho biết diện vắng mặt số lượng sinh vật gần (được biểu thị độ đục ống nghiệm) Định lượng vi sinh vật có mật độ thấp Định lượng thông qua số lượng khuẩn lạc theo phương pháp MPN 11 2.2.2 Màng lọc - Kích thước lỗ lọc: 0,45m 0,2m Thường dùng màng lọc kỵ nước, in ô vuông ngăn cản mọc lan khuẩn lạc - Đường kính hình dạng màng lọc phụ thuộc vào đường kính phễu lọc Đường kính màng thường 45mm 2.2.3 Phương pháp màng lọc - 2.2.3.1 Nguyên tắc Phễu lọc, giá đỡ màng lọc phải vô trùng sau lần lọc Mật độ VSV dịch lọc thích hợp: