Nghiên cứu chế tạo hạt nano bạc và khả năng sát khuẩn của nó

- 2 - Chương 1: TỔNG QUAN VỀ HẠT NANO BẠC VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHÚNG TRONG SINH HỌC 1.1 Giới thiệu về công nghệ nano 1.1.1 Khái niệm và nguồn gốc của công nghệ nano Công nghệ nano là ngành

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

Nguyễn Ngọc Hùng

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO HẠT NANO BẠC VÀ KHẢ

NĂNG SÁT KHUẨN CỦA NÓ

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC HỆ CHÍNH QUY

Ngành: Vật lý kỹ thuật

HÀ NỘI - 2011

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

Nguyễn Ngọc Hùng

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO HẠT NANO BẠC VÀ KHẢ

NĂNG SÁT KHUẨN CỦA NÓ

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC HỆ CHÍNH QUY

Ngành: Vật lý kỹ thuật

Cán bộ hướng dẫn: TS Nguyễn Đức Quang

HÀ NỘI - 2011

Lời cảm ơn

Đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Đức Quang (Khoa VLKT – ĐHCN – ĐHQGHN) và TS Lê Anh Tuấn (Viện tiên tiến Khoa học và công nghệ - ĐH Bách Khoa Hà Nội) đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian

vừa qua

Em xin gửi lời cám ơn tới các anh chị trong Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh

học – ĐHQG Hà Nội đã chỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi nhất để em hoàn thí nghiệm

Em cũng xin tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và các anh chị khoa Vật lý kỹ thuật, đặc biệt là GS Lê Trần Bình, TS Trần Đăng Khoa và TS Hà Thị Quyến vì đã dạy

bảo và giúp đỡ em những lúc khó khăn

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè, những người luôn ủng

hộ và động viên em trong suốt thời gian vừa qua

Hà Nội, Ngày 19/5/2011

Nguyễn Ngọc Hùng

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình do tôi tự làm và nghiên cứu, các trích dẫn tôi đều đã ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo Nếu có bất kỳ vấn đề gì xảy ra, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Người viết luận văn: Nguyễn Ngọc Hùng

MỤC LỤC

Tóm tắt nội dung khóa luận - 1 -

Chương 1: TỔNG QUAN VỀ HẠT NANO BẠC VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHÚNG TRONG SINH HỌC - 2 -

1.1 Giới thiệu về công nghệ nano - 2 -

1.1.1 Khái niệm và nguồn gốc của công nghệ nano - 2 -

1.1.2 Cơ sở khoa học của công nghệ nano - 2 -

1.1.3 Ứng dụng của công nghệ nano trong sinh học và y học - 4 -

1.2 Hạt nano bạc - 5 -

1.2.1 Giới thiệu về bạc kim loại - 5 -

1.2.2 Đặc tính kháng khuẩn của bạc - 6 -

1.2.3 Cơ chế kháng khuẩn của bạc - 6 -

1.2.4 Các phương pháp chế tạo hạt nano kim loại - 8 -

1.2.5 Giới thiệu về hạt nano bạc - 9 -

1.2.5.1 Các phương pháp phân tích hạt nano bạc - 9 -

1.2.5.2 Ứng dụng của nano bạc - 11 -

1.3 Sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn - 15 -

1.3.1 Đường cong sinh trưởng - 15 -

1.3.1.1 Giai đoạn Tiềm phát (Lag phase) - 15 -

1.3.1.2 Giai đoạn logarit (Log Phase) hay Pha Chỉ số (Exponential Phase) - 16 -

1.3.1.3 Giai đoạn tử vong (Death Phase) - 17 -

1.3.2 Xác định sự sinh trưởng của vi khuẩn - 17 -

1.3.2.1 Xác định số lượng tế bào - 17 -

1.3.2.2 Xác định khối lượng tế bào - 18 -

Chương 2: NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM - 20 -

2.1 Phương pháp chế tạo hạt nano bạc - 20 -

2.1.1 Quy trình công nghệ chế tạo dung dịch nano bạc sử dụng kỹ thuật khử hóa học với bức xạ UV kích thích - 20 -

2.1.1.1 Hóa chất thí nghiệm sử dụng: - 20 -

2.1.1.2 Thiết bị sử dụng - 20 -

2.1.1.3 Quy trình tổng hợp - 20 -

2.1.2 Cơ chế hình thành hạt nano bạc - 22 -

2.2 Ảnh hưởng của nano bạc lên sự phát triển của vi khuẩn - 23 -

2.2.1 Phương pháp đo OD - 23 -

2.2.2 Các trang thiết bị - 24 -

2.2.3 Các bước tiến hành thí nghiệm - 24 -

2.2.3.1 Chuẩn bị môi trường - 24 -

2.2.3.2 Cấy vi khuẩn - 25 -

2.2.3.3 Đo OD - 25 -

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN - 26 -

3.1 Phân tích dung dịch nano bạc - 26 -

3.2 Kết quả theo dõi sự phát triển của vi khuẩn khi có mặt của dung dịch nano bạc - 28 - 3.3 So sánh với phương pháp đo bán kính vòng vô khuẩn - 34 -

Chương 4: KẾT LUẬN - 35 -

- 1 -

Tóm tắt nội dung khóa luận

Từ xa xưa, con người đã sử dụng bạc làm các dụng cụ chứa đồ ăn, nước uống để trị bệnh Trong chiến tranh thế giới thứ nhất, người ta thậm chí còn sử dụng các sản phẩm từ bạc

để điều trị nhiễm trùng trước khi thuốc kháng sinh ra đời Ngày nay, cùng với sự ra đời

và phát triển của công nghệ nano, con người đã chế tạo được bạc ở kích thước nano Điều này làm tăng đáng kể số ứng dụng của bạc Ở kích thước nano, bạc thể hiện khả năng kháng khuẩn mạnh mà không gây ảnh hưởng tới con người và môi trường Chính vì vậy, giới khoa học đang đầu tư nghiên cứu bạc để phục vụ cho các ứng dụng trong y học, nhất

là khi hiện tượng vi khuẩn kháng kháng sinh ngày càng phổ biến như ngày nay

Chính vì vậy, trong khóa luận này, chúng tôi tập trung vào các nhiệm vụ sau:

1 Nghiên cứu quy trình công nghệ và tham gia thử nghiệm chế tạo hạt nano bạc

2 Nghiên cứu ảnh hưởng của hạt nano bạc lên sự phát triển (khả năng ức chế sự phát

triển) của vi khuẩn gây bệnh đường ruột E coli

3 Đánh giá hiệu quả ức chế của nano bạc với E coli

- 2 -

Chương 1: TỔNG QUAN VỀ HẠT NANO BẠC VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHÚNG TRONG SINH HỌC

1.1 Giới thiệu về công nghệ nano

1.1.1 Khái niệm và nguồn gốc của công nghệ nano

Công nghệ nano là ngành công nghệ liên quan đến việc thiết kế, phân tích, chế tạo

và ứng dụng các cấu trúc, thiết bị và hệ thống bằng việc điều khiển hình dáng, kích thước trên quy mô nanômét (nm, 1 nm = 10-9 m) [3] Ở kích thước nano, vật liệu sẽ có những tính năng đặc biệt mà vật liệu truyền thống không có được đó là do sự thu nhỏ kích thước

và việc tăng diện tích mặt ngoài

Ý tưởng cơ bản về công nghệ nano được đưa ra bởi nhà vật lý học người Mỹ Richard Feynman vào năm 1959, ông cho rằng khoa học đã đi vào chiều sâu của cấu trúc vật chất đến từng phân tử, nguyên tử vào sâu hơn nữa Nhưng thuật ngữ “công nghệ nano” mới bắt đầu được sử dụng vào năm 1974 do Nario Taniguchi một nhà nghiên cứu tại trường đại học Tokyo sử dụng để đề cập khả năng chế tạo cấu trúc vi hình của mạch vi điện tử[4]

1.1.2 Cơ sở khoa học của công nghệ nano

Công nghệ nano dựa trên những cơ sở khoa học chủ yếu sau:

- Chuyển tiếp từ tính chất cổ điển đến tính chất lượng tử: Đối với vật liệu vĩ

mô gồm rất nhiều nguyên tử, các hiệu ứng lượng tử được trung bình hóa với rất nhiều nguyên tử (1 µm3 có khoảng 1012 nguyên tử) và có thể bỏ qua các thăng giáng ngẫu nhiên Nhưng các cấu trúc nano có ít nguyên tử hơn thì các tính chất lượng tử thể hiện rõ ràng hơn

- Hiệu ứng bề mặt: Khi vật liệu có kích thước nm, các số nguyên tử nằm trên

bề mặt sẽ chiếm tỉ lệ đáng kể so với tổng số nguyên tử Chính vì vậy các hiệu ứng có liên quan đến bề mặt, gọi tắt là hiệu ứng bề mặt sẽ trở nên quan trọng làm cho tính chất của vật liệu có kích thước nanomet khác biệt so với vật liệu ở dạng khối

- 3 -

- Kích thước tới hạn: Các tính chất vật lý, hóa học của các vật liệu đều có một

giới hạn về kích thước Nếu vật liệu mà nhỏ hơn kích thước này thì tính chất của nó hoàn toàn bị thay đổi Người ta gọi đó là kích thước tới hạn Vật liệu nano có tính chất đặc biệt là do kích thước của nó có thể so sánh được với kích thước tới hạn của các tính chất của vật liệu[3]

Bảng 1: Độ dài tới hạn của một số tính chất của vật liệu [3]

(nm)

Quãng đường tự do trung bình không đàn hồi 1-100

Tính siêu dẫn Độ dài liên kết cặp Cooper 0,1-100

- 4 -

1.1.3 Ứng dụng của công nghệ nano trong sinh học và y học

Do có nhiều tính năng độc đáo và kích thước tương đương với các phân tử sinh học nên hiện nay, công nghệ nano đang được đầu tư nghiên cứu đặc biệt là trong lĩnh vực

y sinh Các ứng dụng tiêu biểu của công nghệ nano trong lĩnh vực này là:

- Chẩn đoán: Sử dụng các hạt nano (hạt nano vàng, nano từ, chấm lượng tử…)

để đánh dấu các phân tử sinh học, vi sinh vật, phát hiện các chuỗi gen nhờ vào

cơ chế bắt cặp bổ xung của DNA hoặc cơ chế bắt cặp kháng nguyên – kháng thể

- Vận chuyển thuốc: Cung cấp thuốc cho từng tế bào cụ thể bằng cách sử dụng

các hạt nano nhằm tiết kiệm thuốc và tránh các tác dụng phụ

- Mô kỹ thuật: Công nghệ nano có thể giúp cơ thể tái sản xuất hoặc sửa chữa

các mô bị hư hỏng bằng cách sử dụng “giàn” dựa trên vật liệu nano và các yếu

tố tăng trưởng[7]

Hình 1: Hạt nano vàng sử dụng trong truyền dẫn thuốc

- 5 -

1.2 Hạt nano bạc

1.2.1 Giới thiệu về bạc kim loại

Cấu hình electron của bạc: 1s22s22p63s23p63d104s24p64d105s1

Bán kính nguyên tử Ag: 0,288 nm

Bán kính ion bạc: 0,23 nm

Bảng 2: Số nguyên tử bạc trong một đơn vị thể tích[14]

Kích thước của hạt nano Ag (nm)

Số nguyên tử chứa trong đó

- Độ bền hóa học cao, không bị biến đổi dưới tác dụng của ánh sáng và các tác nhân oxy hóa khử thông thường

- Chi phí cho quá trình sản xuất thấp

- Ổn định ở nhiệt độ cao

- 6 -

1.2.2 Đặc tính kháng khuẩn của bạc

Bạc và các hợp chất của bạc thể hiện tính độc đối với vi khuẩn, virus, tảo và nấm Tuy nhiên, khác với các kim loại nặng khác (chì, thủy ngân…) bạc không thể hiện tính độc với con người

Từ xa xưa, người ta đã sử dụng đặc tính này của bạc để phòng bệnh Người cổ đại

sử dụng các bình bằng bạc để lưu trữ nước, rượu dấm Trong thế kỷ 20, người ta thường đặt một đồng bạc trong chai sữa để kéo dài độ tươi của sữa Bạc và các hợp chất của bạc được sử dụng rộng rãi từ đầu thế kỷ XIX đến giữa thế kỷ XX để điều trị các vết bỏng và khử trùng[10]

Sau khi thuốc kháng sinh được phát minh và đưa vào ứng dụng với hiệu quả cao người ta không còn quan tâm đến tác dụng kháng khuẩn của bạc nữa Tuy nhiên, từ những năm gần đây, do hiện tượng các chủng vi sinh ngày càng trở nên kháng thuốc, người ta lại quan tâm trở lại đối với việc ứng dụng khả năng diệt khuẩn và các ứng dụng khác của bạc, đặc biệt là dưới dạng hạt có kích thước nano

1.2.3 Cơ chế kháng khuẩn của bạc

Hình 2: Tác động của ion bạc lên vi khuẩn

- 7 -

Các đặc tính kháng khuẩn của bạc bắt nguồn từ tính chất hóa học của các ion Ag+ Ion này có khả năng liên kết mạnh với peptidoglican, thành phần cấu tạo nên thành tế bào của vi khuẩn và ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên trong tế bào dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn Nếu các ion bạc được lấy ra khỏi tế bào ngay sau đó, khả năng hoặt động của vi khuẩn lại có thể được phục hồi Do động vật không có thành tế bào,vì vậy chúng ta không bị tổn thương khi tiếp xúc với các ion này

Có một cơ chế tác động của các ion bạc lên vi khuẩn đáng chú ý được mô tả như sau: Sau khi Ag+ tác động lên lớp màng bảo vệ của tế bào vi khuẩn gây bệnh nó sẽ đi vào bên trong tế bào và phản ứng với nhóm sunfuahydrin – SH của phân tử enzym chuyển hóa oxy và vô hiệu hóa men này dẫn đến ức chế quá trình hô hấp của tế bào vi khuẩn[14]

Hình 3: Ion bạc vô hiệu hóa enzym chuyển hóa oxy của vi khuẩn

Ngoài ra các ion bạc còn có khả năng liên kết với các base của DNA và trung hòa điện tích của gốc phosphate do đó ngăn chặn quá trình sao chép DNA[15]

Hình 4: Ion bạc liên kết với các base của DNA

- 8 -

1.2.4 Các phương pháp chế tạo hạt nano kim loại

- Phương pháp ăn mòn laze: Phương pháp này sử dụng chùm tia laze với bướ

sóng ngắn bắn lên vật liệu khối đặt trong dung dịch có chứa chất hoạt hóa bề mặt Các hạt nano được tạo thành với kích thước khoảng 10 nm và được bao phủ bởi chất hoạt hóa bề mặt

- Phương pháp khử hóa học: Phương pháp này sử dụng các tác nhân hóa học để

khử ion kim loại thành kim loại Để các hạt phân tán tốt trong dung môi mà không bị kết

tụ thành đám, người ta sử dụng phương pháp tĩnh điện để làm cho bề mặt các hạt nano có cùng điện tích và đẩy nhau hoặc dùng phương pháp bao bọc bằng chất hoạt hóa bề mặt Các hạt nano tạo thành bằng phương pháp này có kích thước từ 10 nm đến 100 nm

- Phương pháp khử vật lý: Phương khử vật lí dùng các tác nhân vật lí như điện

tử, sóng điện từ năng lượng cao như tia gamm, tia tử ngoại, tia laser khử ion kim loại thành kim loại Dưới tác dụng của các tác nhân vật lí, có nhiều quá trình biến đổi của dung môi và các phụ gia trong dung môi để sinh ra các gốc hóa học có tác dụng khử ion thành kim loại

- Phương pháp khử hóa lý: Đây là phương pháp trung gian giữa hóa học và vật

lí Nguyên lí là dùng phương pháp điện phân kết hợp với siêu âm để tạo hạt nano Phương pháp điện phân thông thường chỉ có thể tạo được màng mỏng kim loại Trước khi xảy ra sự hình thành màng, các nguyên tử kim loại sau khi được điện hóa sẽ tạo các hạt nano bàm lên điện cực âm Lúc này người ta tác dụng một xung siêu âm đồng bộ với xung điện phân thì hạt nano kim loại sẽ rời khỏi điện cực và đi vào dung dịch

- Phương pháp khử sinh học: Dùng vi khuẩn là tác nhân khử ion kim loại Người

ta cấy vi khuẩn MKY3 vào trong dung dịch có chứa ion bạc để thu được hạt nano bạc Phương pháp này đơn giản, thân thiện với môi trường và có thể tạo hạt với số lượng lớn[6]

- 9 -

1.2.5 Giới thiệu về hạt nano bạc

Hạt nano bạc là các hạt bạc có kích thước từ 1 nm đến 100 nm Do có diện tích bề mặt lớn nên hạt nano bạc có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với các vật liệu khối do khả năng giải phóng nhiều ion Ag+ hơn

Các hạt nano bạc có hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt Hiện tượng này tạo nên màu sắc từ vàng nhạt đến đen cho các dung dịch có chứa hạt nano bạc với các màu sắc phụ thuộc vào nồng độ và kích thước hạt nano

1.2.5.1 Các phương pháp phân tích hạt nano bạc

a) Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua

Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) hoạt động trên nguyên tắc giống thấu kính quang học, chỉ khác là sử dụng sóng điện tử thay cho bước sóng ánh sáng nên có bước sóng rất ngắn) và sử dụng các thấu kính điện từ - magnetic lens thay cho thấu kính quang học[5]

Hình 5: Mô hình nguyên lý của TEM so với kính hiển vi quang học

- 11 -

Hình 7: Ảnh UV-VIS của các hạt nano bạc [10]

Do hạt nao bạc có kích thước nhỏ hơn 20 nm chỉ có một bề mặt plasmon duy nhất nên trong phổ UV-VIS của chúng chỉ xuất hiện 1 đỉnh duy nhất Người ta xử dụng tính chất này để xác định hình dạng của hạt nano bạc[12]

1.2.5.2 Ứng dụng của nano bạc

Do thể hiện tính kháng khuẩn tốt nên nano bạc thường được sử dụng để làm chất khử trùng, kháng khuẩn, khử mùi… Có thể kể một vài sản phẩm chứa hạt nano bạc như:

- Các dụng cụ chứa thực phẩm: Những đồ dùng bằng nhựa có pha thêm hạt

nano bạc có tác dụng khử trùng Qua kiểm tra cho thấy chúng có khả năng diệt 99.9% vi khuẩn

- 12 -

Hình 8: Bình sữa làm bằng nhựa có pha thêm nano bạc

- Đồ may mặc: hạt nano bạc được tẩm vào các loại sợi để diệt khuẩn và khử

mùi

Hình 9: Tất làm bằng sợi nilon có pha nano bạc

- 13 -

- Các thiết bị điện tử: Điều hòa, tủ lạnh, máy giặt

Hình 10: Điều hòa sử dụng bộ lọc nano bạc

- Y tế:

+ Khẩu trang nano bạc: Được thiết kế với 3-4 lớp gồm 2 lớp vải, một lớp vật liệu tẩm nano bạc và than hoạt tính ở giữa, loại khẩu trang này có khả năng diệt khuẩn, diệt virus, lọc không khí rất tốt Lớp vải tẩm nano bạc có chức năng diệt vi khuẩn, virus, nấm

bị giữ lại trên khẩu trang đồng thời có tác dụng khử mùi

Hình11: Khẩu trang nano bạc do viện môi trường sản xuất

Hình 13: Ảnh SEM của các hạt nano bạc kết hợp với film polyolefin

- Các sản phẩm khác:

Hình 14: các sản phầm có chứa nano bạc

- 15 -

1.3 Sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn

1.3.1 Đường cong sinh trưởng

Sự sinh trưởng quần thể vi sinh vật được nghiên cứu bằng cách phân tích đường cong sinh trưởng trong một môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo phương pháp nuôi cấy theo mẻ (batch culture) hoặc trong một hệ thống kín Có nghĩa là vi sinh vật được nuôi cấy trong một thiết bị kín, trong quá trình nuôi cấy không thay đổi môi trường và thời gian nuôi cấy càng kéo dài thì nồng độ chất dinh dưỡng càng giảm sút, các chất phế thải của trao đổi chất càng tăng lên Nếu lấy thời gian nuôi cấy là trục hoành và lấy số logarit của số lượng tế bào sống làm trục tung sẽ có thể vẽ được đường cong sinh trưởng của các

vi sinh vật sinh sản bằng cách phân đôi Đường cong này có 4 giai đoạn (phases) khác nhau[8]

Hình 15: Đường cong sinh trưởng trong hệ thống kín

1.3.1.1 Giai đoạn Tiềm phát (Lag phase)

Khi cấy vi sinh vật vào một môi trường mới số lượng thường không tăng lên ngay,

đó là giai đoạn Tiềm phát hay pha Lag Trong giai đoạn này tế bào chưa phân cắt nhưng thể tích và khối lượng tăng lên rõ rệt do có sự tăng các thành phần mới của tế bào