TẠP CHÍ KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ NƠNG NGHIỆP ISSN 2588-1256 Tập 2(2) - 2018 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN NẤM MEN VÀ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU CÀ NA (CANARIUM ALBUM) Huỳnh Ngọc Thanh Tâm, Nguyễn Thị Niềm, Nguyễn Thị Minh Trâm, Nguyễn Đức Độ Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Liên hệ email: hnttam@ctu.edu.vn TÓM TẮT Cà na (Canarium album) loại trồng phổ biến vùng nhiệt đới châu Phi Nam Á Tại Việt Nam, cà na trồng nhiều địa phương, có vị chua chát hương thơm đặc trưng Việc phân lập tuyển chọn dòng nấm tốt, đồng thời nghiên cứu lên men rượu cà na góp phần làm đa dạng sản phẩm lên men từ trái nâng cao giá trị kinh tế cà na Từ nguồn cà na ban đầu tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Cần Thơ, Hậu Giang, Sóc Trăng (Việt Nam) Kandal (Campuchia), có 50 dịng nấm men phân lập, chia thành nhóm dựa vào hình dạng tế bào đặc tính sinh hóa Kết phân lập cho thấy dịng nấm men R2B có khả lên men mạnh, sản phẩm rượu có độ cồn cao Nghiên cứu khảo sát quy trình lên men rượu cà na từ dòng nấm men R2B (được định danh phương pháp giải trình tự Lachancea fermentati) thực dựa tiêu pH, độ Brix, mật số nấm men thời gian lên men Kết cho thấy sản phẩm rượu thu có độ cồn cao (11,29% v/v) đạt TCVN 7045:2009 điều kiện mật số nấm men 107 TB/mL, dịch lên men bổ sung đường saccharose đạt 24,01 oBrix, pH = 3,88 lên men rượu 30oC thời gian 12 ngày Từ khóa: cà na (Canarium album), lên men, nấm men, rượu cà na Nhận bài: 18/04/2018 Hoàn thành phản biện: 20/05/2018 Chấp nhận bài: 30/05/2018 MỞ ĐẦU Hiện nay, rượu vang trái trở thành sản phẩm ưa chuộng buổi lễ hội buổi tiệc gia đình, đó, việc phân lập nấm men nội sinh trái lên men rượu vang ứng dụng ngày rộng rãi Nguyễn Văn Thành cs (2013) phân lập dịng nấm men Saccharomyces cerevisiae VK1 từ dịch khóm tiến hành lên men rượu vang khóm, sản phẩm cho độ cồn cao đạt 15,34% v/v Ngô Thị Phương Dung cs (2011) phân lập dòng nấm men từ dịch dưa hấu thuộc hai giống Saccharomyces Schizosaccharomyces, tiến hành lên men rượu vang dưa hấu, sản phẩm cho độ rượu cao đạt 15,83% v/v Cà na loại gỗ đặc trưng nhiều địa phương Việt Nam Các phận cà na có nhiều cơng dụng sống ngày Rễ, dùng làm thuốc có tác dụng nhiệt, giải độc Vỏ có tinh dầu tanin sử dụng dược liệu chống dị ứng bảo vệ da Quả cà na dùng làm mứt, muối dưa, ô mai (Võ Văn Chi, 2003) Tuy nhiên giá trị kinh tế cà na không cao, sản phẩm từ cà na cịn nên dẫn đến việc lãng phí nguồn nguyên liệu giàu dinh dưỡng Nghiên cứu hồn thiện q trình lên men rượu cà na khơng góp phần đa dạng hóa sản phẩm lên men từ trái mà làm tăng giá trị kinh tế cho cà na Ngoài ra, việc phân lập 741 HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY ISSN 2588-1256 Vol 2(2) - 2018 dòng nấm men nội sinh cà na có khả lên men ethanol cao đem lại lợi ích định ứng dụng sản xuất cồn công nghiệp, góp phần tăng thu nhập cho người dân từ cà na NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu hóa chất Quả cà na thu từ tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Cần Thơ, Hậu Giang, Sóc Trăng (Việt Nam) Kandal (Campuchia) Môi trường YPDA (Yeast-PeptoneD-glucose-Agar) dùng để phân lập nấm men Môi trường YPD (Yeast-Peptone-Dglucose) dùng để tăng sinh khối nấm men Thành phần môi trường YPD YPDA bao gồm peptone, yeast extract, D – glucose có xuất xứ từ Ấn Độ Agar tinh khiết hóa chất khác C2H5OH (cồn), HCl, NaOH hóa chất trùng (NaHSO3) mua từ cơng ty hóa chất Miền Nam (Quận Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phân lập định danh sơ dòng nấm men từ dịch cà na - Tiến hành thu mẫu Quả cà na thu tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Cần Thơ, Hậu Giang, Sóc Trăng (Việt Nam) Kandal (Campuchia) Mỗi địa điểm thu khoảng 200 g cà na Mẫu bảo quản cách ướp đá thùng xốp suốt q trình vận chuyển đến phịng thí nghiệm - Phân lập dịng nấm men từ cà na Tại địa điểm cho từ đến cà na loại bỏ hạt để ngun khơng nghiền vào bình tam giác 100 mL có mơi trường YPD để tiến hành tăng sinh mật số nấm men Sau đó, đem lắc ủ nhiệt độ phòng 24 Sau 24 giờ, tiến hành pha loãng dung dịch tăng sinh cách lắc bình tam giác để nấm men phân bố môi trường, dùng pipet hút mL dung dịch tăng sinh cho vào ống nghiệm có chứa sẵn mL nước cất khử trùng, thu dung dịch có nồng độ pha lỗng 10-1 lần, thực bước tương tự để thu dung dịch với nồng độ pha loãng 10-3, 10-4 10-5 lần Ở nồng độ pha loãng, dùng pipet hút 100 µL dung dịch cho vào đĩa petri chứa môi trường YPDA dùng que trải thủy tinh vô trùng để tiến hành trải mẫu Sau đó, để mẫu khơ ủ 30 oC 24 – 48 Sau nấm men phát triển môi trường YPDA, quan sát khuẩn lạc nấm men đánh dấu khuẩn lạc khác kích thước, màu sắc, độ nổi, dạng bìa Tiếp tục cách chuyển nhiều lần độ nấm men xác định - Kiểm tra hình thái khuẩn lạc đặc trưng dòng nấm men Đặc điểm khuẩn lạc nấm men đa dạng gồm: hình dạng (trịn khơng đều), độ (mô lài), màu sắc (trắng đục trắng trong), dạng bìa (bìa ngun bìa gợn sóng), kích thước Khuẩn lạc phân lập phải nằm đường cấy khơng lẫn với khuẩn lạc có hình thái màu sắc khác Sau tách ròng, dịng phân lập kiểm tra hình thái quan sát độ kính hiển vi quang học độ phóng đại 40X 100X Sau tiến hành định danh sơ dòng nấm men phương pháp hình thái học dựa vào khóa phân loại nấm men Kurtzman Fell (1998), Lương Đức Phẩm (2006) Nguyễn Đức Lượng (2006) kết hợp với phương pháp sinh hóa (khả lên men đường glucose saccharose, khả phân giải urea) 742 TẠP CHÍ KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ NƠNG NGHIỆP ISSN 2588-1256 Tập 2(2) - 2018 2.2.2 So sánh khả lên men dòng nấm men Lên men dịch cà na bình tam giác có gắn waterlock để xác định khả lên men dựa vào độ cồn sản phẩm sau lên men Tiến hành lên men với dòng nấm men phân lập nhằm chọn dịng nấm men thích hợp để lên men rượu cà na Phối chế dịch cà na (nước ép cà na điều chỉnh pH = 3,5 20oBrix) sau trùng với NaHSO3 nồng độ 140 mg/L Tăng sinh nấm men đến đạt 106 TB/mL, cho nấm men vào bình tam giác (1 mL dịch nấm men + 99 mL dịch phối chế) Sau 10 ngày lên men, tiến hành đo độ cồn phương pháp chưng cất Dòng nấm men có khả lên men cho độ cồn cao định danh phương pháp giải trình tự đoạn gen 28S rRNA Mẫu khuẩn lạc gửi đến cơng ty TNHH MTV Sinh Hóa Phù Sa (Quận Cái Răng, Thành phố Cần Thơ) để định danh đến tên lồi dịng nấm men Đoạn mồi sử dụng ITS1-ITS4 630 pb 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng pH, độ Brix mật số nấm men đến trình lên men rượu cà na Thí nghiệm bố trí theo kiểu thừa số gồm nhân tố lần lặp lại Nhân tố A (độ Brix) khảo sát độ Brix khác 20, 25 30 Nhân tố B (pH) khảo sát giá trị pH pH = 3,5; pH = pH = 4,5 Nhân tố C (mật số nấm men) tiến hành khảo sát mật số nấm men khác 103 TB/mL, 105 TB/mL 107 TB/mL Chuẩn bị dịch nấm men, kiểm tra mật số tế bào nấm men phương pháp đếm trực tiếp buồng đếm hồng cầu Cho vào bình tam giác 99 mL dịch cà na trùng NaHSO3 (140 mg/L giờ), sau điều chỉnh nồng độ Brix pH theo bố trí thí nghiệm sau chủng mật số nấm men vào cách ngẫu nhiên Dịch chủng lên men thời gian 10 ngày nhiệt độ 30oC Sau lên men, tiến hành chưng cất để thu ethanol đo nồng độ ethanol thu cồn kế, quy nồng độ ethanol 20oC 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men rượu cà na Thí nghiệm tiến hành để xác định thời gian lên men tối ưu trình lên men rượu cà na Thí nghiệm nhân tố bố trí hồn toàn ngẫu nhiên thời gian lên men khác (6 ngày, ngày, 10 ngày, 12 ngày 14 ngày) thực với lần lặp lại Tiến hành thu dịch cà na, trùng NaHSO3 (140 mg/L giờ) điều chỉnh yếu tố pH, độ Brix mật số nấm men theo kết tối ưu thu thí nghiệm 2.2.3 “Khảo sát ảnh hưởng pH, độ Brix mật số nấm men đến trình lên men rượu cà na” Cho 99 mL dịch cà na mL dung dịch nấm men vào bình tam giác Sau đó, ủ nhiệt độ phịng tiến hành chưng cất rượu vào mốc thời gian: ngày, ngày, 10 ngày, 12 ngày 14 ngày Sau trình chưng cất, đo nồng độ ethanol thu quy nồng độ ethanol 20oC 2.2.5 Khảo sát khả lên men rượu cà na thể tích lít Thí nghiệm tiến hành lên men rượu cà na thể tích lít nhằm mục đích phân tích tiêu sinh hóa sản phẩm rượu cà na theo TCVN 7045:2009 đánh giá cảm quan sản phẩm theo TCVN 3217-79 Cho vào bình tam giác, bình 1000 mL dịch cà na trùng NaHSO3 (140 mg/L giờ) Điều chỉnh pH, độ Brix mật số nấm men kết 743 HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY ISSN 2588-1256 Vol 2(2) - 2018 thí nghiệm 2.2.3 “Khảo sát ảnh hưởng pH, độ Brix mật số nấm men đến trình lên men rượu cà na” lên men thời gian tối ưu theo kết thí nghiệm 2.2.4 “Khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men rượu cà na” Phối trộn bình tam giác thành sản phẩm rượu cà na cuối Sau đó, tiến hành đo pH độ Brix sản phẩm sau phối trộn Chưng cất đo nồng độ ethanol thu Đồng thời, gửi mẫu phân tích tiêu sản phẩm theo TCVN 7045:2009 tiến hành đánh giá cảm quan 2.2.6 Phương pháp xử lí số liệu Phần mềm Microsof Exel 2010 sử dụng để xử lý số liệu thơ, tính số liệu thống kê số trung bình, hệ số biến thiên (CV%), độ lệch chuẩn (SD) Phần mềm SPSS 22.0 dùng để phân tích phương sai kiểm định LSD trung bình nghiệm thức Phần mềm Statgraphics Centurion XV.I dùng để xác định điều kiện lên men tối ưu KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập định danh sơ dòng nấm men từ dịch cà na Kết phân lập 50 dòng nấm men từ nguồn cà na ban đầu Dựa vào hình dạng đặc điểm sinh hóa nấm men, 50 dịng nấm men phân lập xếp thành nhóm Hình dạng tế bào dịng nấm men tiêu biểu cho nhóm (ở vật kính 40X) thể Hình Kết phân lập dựa vào hình dạng, tính chất sinh hóa nấm men vào khóa phân loại nấm men Kurtzman and Fell (1998), Lương Đức Phẩm (2006) Nguyễn Đức Lượng (2006): 50 dòng nấm men phân lập từ nguồn cà na ban đầu xếp thành nhóm định danh sơ gồm giống Hanseniaspora, Pichia Saccharomyces Kết đạt từ nghiên cứu tương tự với kết Nguyễn Minh Thủy cs (2013), Nguyễn Văn Thành cs (2013) định dạnh sơ giống nấm men Hình Hình dạng tế bào dịng nấm men tiêu biểu nhóm (a) Tế bào hình cầu (AG1A) (b) Tế bào hình cầu nhỏ (HG1A) (c) Tế bào hình elip nhọn (ĐT2B) (d) Tế bào hình oval (CT2A) (e) Tế bào hình oval nhỏ (CT1B) (f) Tế bào hình elip (CPC4) 3.2 Khả lên men dòng nấm men Khả lên men khảo sát với mật số nấm men 106 TB/mL, thời gian ủ 10 ngày 30oC; pH = 3,5 độ Brix điều chỉnh 20o Brix Kết trình bày Bảng Kết thu cho thấy đa số dòng nấm men sử dụng cho độ cồn sau lên men có giá trị thấp Tuy nhiên, dịng nấm men R2B có khả lên men nhanh cho sản phẩm có độ cồn cao (7,51% v/v), độ Brix biểu kiến đo khúc xạ kế giảm (10,67o Brix) Dòng nấm men đối chứng lên men nhanh có độ cồn (7,2% v/v) độ Brix biểu kiến đo khúc xạ kế (11,33o Brix) Kết độ cồn sau lên men dòng nấm men R2B khác biệt có ý nghĩa thống kê với dòng nấm men lại độ tin cậy 95% Sản phẩm rượu thu từ dòng nấm men có độ cồn cao, mùi thơm đặc trưng màu sắc đẹp Do đó, dịng nấm men R2B chọn định danh phương pháp giải trình tự đoạn gen 28S rRNA Kết thấp kết nghiên cứu Nguyễn Văn Thành cs (2013) lên men dịch khóm dịng nấm men VK1, sản phẩm sau lên men cho độ cồn 744 TẠP CHÍ KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ NƠNG NGHIỆP ISSN 2588-1256 Tập 2(2) - 2018 13,26% v/v kết nghiên cứu Ngô Thị Phương Dung cs (2011) lên men dưa hấu dòng nấm men Y04, sản phẩm có độ cồn cao 12% v/v Bảng Các tiêu pH, độ Brix độ cồn sau lên men 37 dòng nấm men STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Dòng nấm men AG1A AG1B AG1C AG1D AG2A AG2B AG2C AG2D CPC2 CT1A CT1B CT1C CT1D CT2A CT2B CT2C CT2D HG1A HG1B pH Độ Brix 3,19 3,09 3,04 3,10 3,08 3,09 3,10 3,13 3,10 4,21 3,15 3,19 3,13 3,16 3,15 3,15 3,10 3,10 3,14 14,67CDE 14,33CDE 14,00CD 14,33CDE 12,00AB 14,33CDE 13,67CD 15,00CDEF 16,00EF 11,33A 15,00CDEF 16,00EF 14,67CDE 14,33CDE 14,00CD 15,33DEF 15,33DEF 14,67CDE 16,00EF Độ cồn 20oC (% v/v) 4,15hijkl 4,42ijklm 3,91defghij 4,02fghij 5,26nop 3,39bcdefgh 4,14hijkl 3,96efghij 3,76cdefghi 3,45bcdefgh 3,58bcdefgh 4,61jklmn 3,69bcdefghi 4,43ijklm 4,04fghij 3,23abcdef 6,40q 5,02mno 3,18abcde STT 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 Dòng nấm men HG1C HG1D HG2A HG2B HG2C HG2D R1A R1B R2A R2B R3A R3B ST1A ST1B ST2A ST2B ST2D ĐC CV (%) pH Độ Brix 3,10 3,18 3,21 3,12 3,12 3,11 3,08 3,08 3,16 3,08 3,15 3,04 3,13 3,11 3,11 3,16 3,12 3,08 14,33CDE 14,00CD 14,67CDE 16,67F 14,33CDE 14,00CD 11,00A 14,00CD 14,00CD 10,67A 14,00CD 11,00A 14,67CDE 14,33CDE 15,00CDEF 14,33CDE 13,33BC 11,33A 6,5 Độ cồn 20oC (% v/v) 2,50a 3,12abcd 4,99mno 3,02abc 4,61jklmn 3,83cdefghij 4,84klmn 5,85pq 4,89lmn 7,51r 5,12mnop 5,72opq 2,93ab 4,07ghijk 2,90ab 3,27abcdefg 3,30bcdefg 7,20r 9,8 Số liệu trung bình lần lặp lại, chữ số mang chữ khác cột khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 5% (P < 0,05) theo kiểm định LSD Tiến hành giải trình tự đoạn gen 28S rRNA dòng nấm men R2B Kết cho thấy dòng nấm men có độ tương đồng đến 99%, độ phủ 99% so với trình tự gen 28S rRNA Lachancea fermentati (So sánh với ngân hàng gen NCBI phần mềm BLASTN) Hình So sánh trình tự gen R2B tương đồng với Lachancea fermentati 99% với số đăng kí KY103954.1 NCBI Dịng nấm men R2B sử dụng cho thí nghiệm xác định điều kiện ảnh hưởng đến trình lên men rượu cà na 3.3 Ảnh hưởng pH, độ Brix mật số nấm men đến trình lên men rượu cà na Theo Lương Đức Phẩm (2006), môi trường thuận lợi cho lên men rượu vang có nồng độ đường khoảng 18 - 25% Khi nồng độ đường lớn 25% trình lên men xảy chậm trình lên men ngừng lại nồng độ đường vượt 30% Đối với loại nấm men để sản xuất rượu vang, pH thích hợp để chúng hoạt động từ đến Tuy nhiên, lên men dịch có vị chua pH từ 2,8 đến 3,8 nấm men hoạt 745 HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY ISSN 2588-1256 Vol 2(2) - 2018 động Thời gian lên men rượu vang dao động từ đến 12 ngày, tùy theo loại điều kiện lên men Sau 10 ngày lên men rượu vang cà na với dòng nấm men R2B, kết khảo sát ảnh hưởng pH, độ Brix mật số nấm men đến khả lên men rượu cà na trình bày Bảng Bảng Giá trị pH, độ Brix độ cồn trung bình sau lên men dịng nấm men R2B Nghiệm thức 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 pH-oBrix-Mật số 3,5-20-103 3,5-20-105 3,5-20-107 3,5-25-103 3,5-25-105 3,5-25-107 3,5-30-103 3,5-30-105 3,5-30-107 4,0-20-103 4,0-20-105 4,0-20-107 4,0-25-103 4,0-25-105 4,0-25-107 4,0-30-103 4,0-30-105 4,0-30-107 4,5-20-103 4,5-20-105 4,5-20-107 4,5-25-103 4,5-25-105 4,5-25-107 4,5-30-103 4,5-30-105 4,5-30-107 pH sau lên men 3,47 3,48 3,44 3,48 3,48 3,48 3,48 3,45 3,46 3,71 3,74 3,76 3,74 3,70 3,73 3,78 3,78 3,63 3,92 3,83 3,94 4,15 4,10 4,08 3,91 3,87 3,94 Brix sau lên men 10,00A 10,50AB 10,00A 18,00G 15,00D 16,50EF 24,00J 24,50J 24,50J 12,00C 11,50BC 11,00ABC 18,00G 17,00FG 17,00FG 23,50IJ 22,50HI 23,50IJ 11,50BC 11,00ABC 11,00ABC 16,50EF 16,00DEF 15,50DE 22,50HI 22,00H 21,50H o Độ cồn (% v/v) 5,00a 6,50bcd 9,00g 7,00cde 7,00cde 7,00cde 6,00abc 8,50fg 8,00efg 5,50ab 7,00cde 7,50def 7,00cde 8,00efg 8,50fg 8,00efg 7,50def 8,00efg 5,50ab 7,50def 8,00efg 7,00cde 8,00efg 8,00efg 7,50def 7,50def 7,50def Số liệu trung bình lần lặp lại Trong cột số có mang số mũ giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê mức 5% (P < 0,05) theo kiểm định LSD Sau trình lên men, pH tất mẫu giảm so với pH ban đầu CO2 acid tạo thành trình lên men Sự chênh lệch pH nghiệm thức chênh lệch pH điều chỉnh trước lên men (Nguyễn Văn Thành cs., 2013) Độ Brix sau lên men sản phẩm giảm so với độ Brix điều chỉnh ban đầu Điều cho thấy lượng đường lớn sử dụng q trình lên men rượu cà na, giải thích có khoảng 10% glucose sử dụng để nấm men tăng sinh khối phần cịn lại chuyển hóa thành rượu số sản phẩm phụ khác (Larpent, 1991) Khi lên men điều kiện pH độ Brix, nghiệm thức có mật số nấm men 103 TB/mL cho độ cồn thấp Cụ thể là, nghiệm thức 5,00% v/v, nghiệm thức 10 5,50% v/v nghiệm thức 19 5,50% v/v Khác biệt có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% so với nghiệm thức cịn lại Trong đó, nghiệm với mật số nấm men 107 TB/mL cho sản phẩm tạo thành có độ cồn cao, dao động từ - 9% v/v, khác biệt có 746 TẠP CHÍ KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ NƠNG NGHIỆP ISSN 2588-1256 Tập 2(2) - 2018 ý nghĩa thống kê so với mật số nấm men 105 TB/mL 107 TB/mL điều kiện pH độ Brix Điều cho thấy hàm lượng nấm men ban đầu thấp dẫn đến nguồn carbon sử dụng nhiều để tăng sinh khối nên lượng rượu tạo thấp Mơ hình tương quan pH, độ Brix, mật số nấm men độ cồn sản phẩm lên men rượu cà na: Hình Sự tương quan nồng độ đường pH lên men đến trình lên men dịch cà na Với mong muốn xác định điều kiện lên men tối ưu từ thông số pH, độ Brix mật số nấm men, kết thí nghiệm phân tích chương trình Statgraphics Centurion XV.I cho phương trình hồi quy sau (với độ tin cậy 95%): Ethanol = -14,1925 + 2,84851*pH + 0,35709*Brix + 1,36906*Matso 0,547778*pH*pH + 0,128396*pH*Brix + 0,302604*pH*Matso - 0,0103778*Brix*Brix + 0,0366042*Brix*Matso - 0,0807986*Matso*Matso - 0,0225625*pH*Brix*Matso H = -14,1925 + 2,84851*X + 0,35709*Y + 1,36906*Z - 0,547778*X*X + 0,128396*X*Y + 0,302604*X*Z - 0,0103778*Y*Y + 0,0366042*Y*Z - 0,0807986*Z*Z - 0,0225625*X*Y*Z (H: ethanol; X: pH; Y: Brix; Z: mật số nấm men) Trong thí nghiệm này, với mục đích tạo sản phẩm có nồng độ ethanol cao nên tiến hành cố định mật số nấm men 107 TB/mL Vì mật số lớn nên chọn log107 = Thay Z = 7, phương trình hồi quy sau: H = -14,1925 + 2,84851*X + 0,35709*Y + 1,36906*Z - 0,547778*X*X + 0,128396*X*Y + 0,302604*X*Z - 0,0103778*Y*Y + 0,0366042*Y*Z - 0,0807986*Z*Z - 0,0225625*X*Y*Z H = -14,1925 + 2,84851*X + 0,35709*Y + 1,36906*7 - 0,547778*X*X + 0,128396*X*Y + 0,302604*X*7 - 0,0103778*Y*Y + 0,0366042*Y*7 - 0,0807986*7*7 - 0,0225625*X*Y*7 Từ phương trình hồi quy, tính đạo hàm theo biến số: H(X’) = -1,095556X - 0,0295415Y+ 4,966738; H(Y’) = -0,0295415X-0,0207556Y + 0,6133194 Giải hệ phương trình H(X’) = H(Y’) = 0, xác định X = 3,88; Y=24,01 Thay giá trị X = 3,88; Y = 24,01; Z = vào phương trình H ban đầu xác định H = 8,44 Như vậy, độ cồn tối đa đạt vào khoảng 8,44% v/v lên men rượu cà na với dòng nấm men R2B, dịch lên men có pH = 3,88, oBrix = 24,01 mật số nấm men 107 TB/mL 747 HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY ISSN 2588-1256 Vol 2(2) - 2018 3.4 Ảnh hưởng thời gian lên men Từ kết thí nghiệm trình bày phần 3.1 “Ảnh hưởng pH, độ Brix mật số nấm men đến trình lên men rượu cà na” chủng nấm men R2B, sử dụng thông số tối ưu gồm pH = 3,38, Brix = 24,01, mật số nấm men 107 TB/mL, thực khảo sát thời gian lên men tối ưu ngày, ngày, 10 ngày, 12 ngày 14 ngày Kết pH, độ Brix độ cồn sau lên men ghi nhận Bảng Bảng Giá trị pH, độ Brix, độ cồn trung bình thời gian sau lên men dòng nấm men R2B Thời gian (ngày) 10 12 14 pH sau lên men 3,22 3,22 3,23 3,23 3,34 Brix sau lên men 13,67A 13,33A 11,67A 11,33B 11,67B o Độ cồn (% v/v) 6,05a 7,09b 8,98c 9,04c 8,92c Số liệu trung bình lần lặp lại Trong cột số có mang số mũ giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê mức 5% (P < 0,05) theo kiểm định LSD Kết cho thấy pH độ Brix sau lên men giảm có tạo thành rượu nấm men sử dụng đường dịch cà na lượng đường bổ sung chuyển hóa thành rượu, đồng thời sinh số acid hữu làm giảm pH môi trường Khi lên men thời gian ngày ngày, độ cồn thấp so với lên men thời gian 10, 12, 14 ngày, khác biệt có ý nghĩa thống kê độ tin cậy 95% Thời gian lên men thích hợp 12 ngày (độ rượu đạt giá trị cao 9,04% v/v), khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê độ tin cậy 95% so với thời gian lên men 14 ngày tiết kiệm thời gian chi phí đưa vào sản xuất Theo Tahir cs (2010), việc kéo dài thời gian lên men làm ảnh hưởng đến tiến độ, tốn chi phí, thời gian làm giảm hiệu suất lên men cạnh tranh chất dinh dưỡng nấm men 3.5 Kết phân tích tiêu hóa học sản phẩm rượu cà na Sản phẩm lên men rượu cà na phân tích tiêu hóa học theo TCVN 7045:2009 Kết phân tích trình bày Bảng cho thấy sản phẩm lên men rượu cà na đạt yêu cầu sản phẩm rượu vang lên men Bảng Kết phân tích tiêu sản phẩm rượu cà na theo TCVN 7045:2009 Chỉ tiêu Đường khử SO2 Acid acetic Aldehyde Ester Methanol Kết rượu cà na 83700 mg/L 19,5 mg/L 0,011% 1936,9 mg/L 150 mg/L Không phát MDL=0,5 Tiêu chuẩn TCVN 7045:2009 Nhà sản xuất công bố < 350 mg/L Nhà sản xuất công bố Nhà sản xuất công bố (TCVN 7045:2013) Nhà sản xuất công bố 0,05 mg/L Ghi chú: Kết phân tích từ Sở Khoa Học Và Công Nghệ Tp.HCM chi nhánh Cần Thơ – Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Tp.HCM Kết phân tích Bảng cho thấy hàm lượng ethanol tạo thành cao (11,29% v/v) giúp cho hương vị rượu thêm phần đậm đà Ngoài ra, thời gian lên men kéo dài tạo điều kiện cho nấm men sử dụng gần hết lượng đường để lên men nên hàm lượng đường lại sản phẩm thấp (83.700 mg/L), tăng hiệu suất cho trình lên men (Lương Đức Phẩm, 2006) Hàm lượng ester sinh cao (150 mg/L) Các ester tạo thành trình lên men enzyme esterase có vai trị quan trọng hình 748 TẠP CHÍ KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ NƠNG NGHIỆP ISSN 2588-1256 Tập 2(2) - 2018 thành hương vị rượu vang (Lương Đức Phẩm, 2006) Kết cho thấy hàm lượng acid acetic bay rượu cà na sau lên men thấp (0,011% v/v) đường hình thành ethanol chiếm ưu đường hình thành acid Hàm lượng aldehyde tạo sản phẩm đạt 1.936,9 mg/L không phát methanol sản phẩm Kết phân tích tiêu sản phẩm rượu cà na đạt TCVN quy định 3.6 Đánh giá cảm quan sản phẩm lên men Bên cạnh tiêu hóa học, rượu cà na cần phải đạt yêu cầu đánh giá cảm quan theo TCVN 3217-79 (Thang điểm từ - 5) Hội đồng đánh giá cảm quan phải có khả đánh giá khách quan, có kiến thức chun mơn có kinh nghiệm cảm quan Kết đánh giá cảm quan thể Bảng Kết cho thấy rượu cà na suốt, có màu, mùi vị đặc trưng cho sản phẩm Bảng Kết đánh giá cảm quan rượu cà na Kết đánh giá cảm quan rượu cà na Chỉ tiêu Điểm trung bình Độ màu sắc 4,8 Mùi 4,6 Vị 4,3 Yêu thích mẫu thử 4,5 Yêu cầu rượu vang (TCVN 3217-79) Nhận xét Chất lỏng suốt, không vẩn đục vật thể lạ Màu hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm Hịa hợp, thơm dịu, hồn tồn đặc trưng cho sản phẩm Hòa hợp, êm dịu, hậu tốt, đặc trưng cho sản phẩm Chất lỏng suốt, không vẩn đục vật thể lạ Màu hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm Hịa hợp, thơm dịu, hồn tồn đặc trưng cho sản phẩm Hịa hợp, êm dịu, hậu tốt, hồn tồn đặc trưng cho sản phẩm Rất thích Rất thích So với sản phẩm rượu vang mít bàng Nguyễn Phú Hơn (2017) (độ màu sắc - 4,4/5; mùi - 4,2/5; vị - 4,0/5 ý thích - 4,1/5) sản phẩm rượu cà na nghiên cứu cho kết đánh giá cảm quan tốt tất tiêu Ngoài ra, kết đánh giá cảm quan tương đồng với kết đánh giá cảm quan với rượu vang khóm Nguyễn Văn Thành cs (2013) độ màu sắc (4,5/5) mùi (4,0/5) Tuy nhiên vị rượu vang cà na (4,5/5) đánh giá cao vị rượu vang khóm (2,7/5) theo theo Lương Đức Phẩm (2006), hương vị khóm bị giảm đáng kể sau q trình lên men KẾT LUẬN Dịng nấm men R2B (được định danh Lachancea fermentati) phân lập từ cà na sử dụng hiệu tốt cho trình lên men rượu cà na quy mơ phịng thí nghiệm Kết đạt thông số cho điều kiện lên men tối ưu là: pH = 3,88; Brix = 24,01; mật số nấm men 107 TB/mL; với thời gian lên men rượu thích hợp 12 ngày Sản phẩm rượu cà na sau lên men với điều kiện tối ưu có độ cồn cao (11,29% v/v), tiêu kiểm tra đạt TCVN quy định sản phẩm rượu vang (TCVN 7045:2009) có giá trị cảm quan tốt Bên cạnh đó, kết khả quan có tiềm ứng dụng cao vào quy trình sản xuất bioethanol cho nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lương Đức Phẩm (2006) Nấm men công nghiệp Hà Nội: NXB khoa học Kỹ thuật Nguyễn Đức Lượng (2006) Thí nghiệm cơng nghệ sinh học (Vol Tập 2) NXB Đại học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh 749 HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY ISSN 2588-1256 Vol 2(2) - 2018 Nguyễn Minh Thủy, Nguyễn Văn Thành, & Phạm Thị Ngọc Ánh (2013) Phân lập tuyển chọn nấm men từ sim rừng Phú Quốc (Kiên Giang) Măng Đen (Kontum) Kỷ yếu Hội thảo Công nghệ sinh học vùng Đồng sông Cửu Long 2013, 1, pp 47-53 Nguyễn Phú Hơn (2017) Phân Lập tuyển chọn nấm men lên men rượu vang mít bàng tỉnh An Giang (Artocarpus heterophyllus) Đề tài luận văn Thạc sĩ khoa học, chuyên ngành Công nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Văn Thành, Nguyễn Minh Thủy, Trần Thị Quế, & Nguyễn Thị Mỹ Tuyền (2013) Phân lập, tuyển chọn định danh nấm men lên men rượu vang khóm Tạp chí khoa học – trường Đại học Cần Thơ, 25, 27-35 Võ Văn Chi (2003) Từ điển thực vật thông dụng (Vol 1) NXB khoa học Kỹ thuật Tài liệu tiếng nước Kurtzman, C P., & Fell, J W (1998) The Yeast: A Taxonomic study 4th ed Amsterdam: Elsevier Larpent J P (1991) Biotechnologie des levures Masson éditeur Tahir, A., M Aftab, & T Farasat (2010) Effect of cultural conditions on athanol production by locally isolated Sacharomyces cerevisiae bio-07 Journal of Applied Pharmaceutical, 3(2) ISOLATION, SELECTION OF YEASTS AND DETERMINATION OF FACTORS AFFECTING CANARIUM ALBUM WINE FERMENTATION Huynh Ngoc Thanh Tam, Nguyen Thi Niem, Nguyen Thi Minh Tram, Nguyen Duc Do Biotechnology Research and Development Institute, Can Tho University Contact email: hnttam@ctu.edu.vn ABSTRACT Canarium album is a popular plant in tropical countries of South Asia and Africa, including Vietnam Apart from contributing to the diversity of fermented fruit products, the producing products from Canarium album could increase the commercial value of this plant The objective of this study is to isolate and select healthy yeast strains, study the suitable conditions to make wine from Canarium album fermentation Fifty yeast strains isolated from the samples were divided into groups, basing on the shape of cell and biochemical characteristics The isolation shows that the yeast strain R2B (identified by sequencing as Lachancea fermentati) has the strong fermented activity, offering high volume of alcohol Next, the study about Canarium album wine processing from the yeast strain R2B was conducted basing on various factors, consisting of pH value, Brix, yeast cell density and fermentation time The findings illustrate that the canarium album wine processing by employing the yeast strain R2B could provide wine products, reaching a high volume of alcohol (11,29% v/v) and matching the the Vietnam standard 7045:2009, in the suitable conditions including the yeast levels of 107 cells/ml, the added saccharose concentration at 24.01 oBrix, pH = 3.88 and the fermentation time for 12 days, at 30°C Key words: Canarium album, Canarium album wine, fermentation, yeast Received: 18th April 2018 750 Reviewed: 20th May 2018 Accepted: 30th May 2018