đánh giá hiệu quả sử dụng nano bạc và thảo dược với khả năng phòng trừ bệnh bạc lá lúa

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM VŨ THÀNH QUANG ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ SỬ DỤNG NANO BẠC VÀ THẢO DƯỢC VỚI KHẢ NĂNG PHÒNG TRỪ BỆNH BẠC LÁ LÚA Chuyên ngành: Khoa học trồng Mã số: 60.62.01.10 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thanh Hải TS Nguyễn Thanh Tuấn NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan khóa luận cơng trình nghiên cứu thân tơi hướng dẫn TS Nguyễn Thanh Hải thực khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Các số liệu, hình ảnh kết trình bày khóa luận hồn tồn trung thực Những thơng tin tham khảo sách, báo hay tạp chí trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng Tôi xin chịu trách nhiệm trước nhà trường lời cam đoan Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Vũ Thành Quang i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thể giáo viên môn Chọn giống- Di truyền, Khoa Nông học – Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình dạy, giúp đỡ suốt thời gian qua Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thanh Hải, TS Nguyễn Thanh Tuấn – người trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ động viên tơi q trình nghiên cứu hồn thiện tốt khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo, tập thể cán bộ, kỹ thuật viên khoa Công nghệ Sinh học, khoa Nông học, Trung tâm bảo tồn đa dạng nguồn gen- Học viện Nông nghiệp Việt Nam quan tâm tạo điều kiện giúp thực đề tài nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn hỗ trợ, giúp đỡ, động viên gia đình bạn bè suốt q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp, trình học tập vừa qua Mặc dù cố gắng song khóa luận khơng thể tránh khó thiếu sót, kính mong q thầy, góp ý để đề tài hồn thiện Sau cùng, tơi xin kính chúc q Thầy, Cơ giáo sức khỏe thành công nghiệp đào tạo hệ tương lai, kính chúc Khoa Nơng học đạt nhiều thành công Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Vũ Thành Quang ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục từ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract xi Phần Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu .3 1.4 Ý nghĩa khoa học .3 1.5 Ý nghĩa thực tiễn .3 Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Cơ sở lý luận bạc lúa 2.1.1 Lịch sử phát bệnh .4 2.1.2 Triệu chứng bệnh 2.1.3 Tác hại bạc lúa gây .5 2.1.4 Nguyên nhân gây bệnh bạc lúa .6 2.1.5 Quy luật yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh 2.1.6 Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.oryzae 2.2 Tình hình nghiên cứu thảo dược giới việt nam 2.2.1 Tình hình nghiên cứu thảo dược giới .9 2.2.2 Tình hình nghiên cứu thảo dược Việt Nam 11 2.3 Nano bạc 18 2.3.1 Giới thiệu nano bạc .18 2.3.2 Đặc tính kháng khuẩn nano bạc 19 2.3.3 Cơ chế tác động nano bạc 20 2.3.4 Ứng dụng nano bạc 21 iii Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 25 3.1 Địa điểm nghiên cứu 25 3.2 Thời gian nghiên cứu .25 3.3 Vật liệu nghiên cứu 25 3.3.1 Dược liệu nghiên cứu 25 3.3.2 Vi khuẩn nghiên cứu 25 3.3.3 Giống lúa nghiên cứu 25 3.3.4 Nano bạc 26 3.3.5 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất mơi trường 26 3.4 Nội dung nghiên cứu .26 3.5 Phương pháp nghiên cứu 27 3.5.1 Phương pháp thu hái xử lý thực vật .27 3.5.2 Phương pháp thu dịch chiết thực vật đánh giá hiệu suất tách chiết .27 3.5.3 Phương pháp định tính xác định số nhóm hợp chất có dịch chiết thực vật 28 3.5.4 Phương pháp pha loãng dịch chiết 29 3.5.5 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn môi trường rắn lỏng 30 3.5.6 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn 30 3.5.7 Phương pháp đánh giá khả diệt khuẩn in vitro dịch chiết thực vật .31 3.5.8 Phương pháp pha loãng nano bạc 32 3.5.9 Phương pháp đánh giá khả kháng khuẩn in vitro nano bạc vi khuẩn 32 3.5.10 Phương pháp đánh giá khả kháng khuẩn in vitro dịch chiết thực vật phối trộn với nano bạc .33 3.5.11 Phương pháp đánh giá tác dụng dịch chiết thực vật nano bạc lúa điều kiện thí nghiệm in vivo 34 3.5.12 Phương pháp xử lý số liệu 35 Phần Kết thảo luận 36 4.1 Đánh giá hiệu suất chiết xuất khả ức chế vi khuẩn in vitro cao khô dịch chiết thực vật 36 4.1.1 Đánh giá hiệu suất dịch chiết thực vật dung môi ethanol 70% 36 iv 4.1.2 Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro cao dịch chiết thực vật với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.oryzae 39 4.2 Đánh giá hiệu suất định tính nhóm chất cao khơ dịch chiết trầu không sử dụng dung môi tách chiết khác 43 4.2.1 Hiệu suất tách chiết cao khô dịch chiết trầu không sử dụng dung môi tách chiết khác 43 4.2.2 Định tính xác định số nhóm hoạt chất hòa tan cao khơ dịch chiết trầu khơng phương pháp hóa học 47 4.3 Đánh giá tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro cao khô dịch chiết Trầu không sử dụng dung môi tách chiết khác Xanthomonas oryzae pv.oryzae isolates 04 isolates 09 50 4.4 Đánh giá khả kháng khuẩn in vitro cao khô dịch chiết trầu không pha loãng 53 4.5 Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro nano bạc vi khuẩn Xanthomonas oryzae .56 4.6 Đánh giá tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro phối trộn cao khô dịch chiết Trầu không nano bạc với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.oryzae 61 4.7 Đánh giá tác dụng nano bạc cao khô dịch chiết Trầu khơng lúa điều kiện thí nghiệm in vivo 64 Phần Kết luận kiến nghị 68 5.1 Kết luận 68 5.2 Kiến nghị .69 Tài liệu tham khảo .70 Phụ lục 76 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt µl Microlit CNSH Công nghệ Sinh học Cs Cộng DMSO Dimethyl Sulphoxit g Gam LB Luria Bertani mg Milligam mg/ml Milligram/millimet mm Millimet nm Nanomet ppm Part per million Xoo Xanthomonas oryzae pv Oryzae vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Số nguyên tử bạc đơn vị thể tích .18 Bảng 3.1 Nguồn gốc ký hiệu isolates vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv Oryzae gây bệnh bạc lúa sử dụng nghiên cứu 25 Bảng 3.2 Hệ số pha loãng dịch chiết nồng độ dịch chiết tương ứng .30 Bảng 3.3: Hệ số nồng độ nano pha lỗng theo số ½ 32 Bảng 4.1 Hiệu suất chiết năm loại thực vật sử dụng dung môi ethanol 70% 37 Bảng 4.2 Khả ức chế vi khuẩn in vitro cao dịch chiết thực vật nồng độ 100mg/ml vi khuẩn Xoo (isolates 04) 41 Bảng 4.3 Khả ức chế vi khuẩn in vitro cao dịch chiết thực vật dịch chiết thực vật nồng độ 100mg/ml vi khuẩn Xoo (isolates 09) 41 Bảng 4.4 Hiệu suất tách chiết trầu không loại dung môi khác .44 Bảng 4.5 Kết định tính sơ thành phần hóa học cao khô dịch chiết trầu không sử dụng dung môi khác 47 Bảng 4.6 Khả ức chế vi khuẩn in vitro cao khô dịch chiết trầu không vi khuẩn isolates 04 isolates 09 .50 Bảng 4.7 Tác dụng kháng khuẩn in vitro cao khô dịch chiết trầu khơng pha lỗng 53 Bảng 4.8 Kết đánh giá tác dụng diệt khuẩn dung dịch nano bạc vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae 57 Bảng 4.9 Khả diệt khuẩn in vitro phối trộn cao khô dịch chiết trầu không nano bạc với vi khuẩn Xoo 61 Bảng 4.10 Chiều dài vết bệnh sau lây nhiễm đánh giá khả kháng nhiễm giống lúa IR 24 66 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.oryzae Hình 3.1 Sơ đồ pha lỗng dịch chiết 30 Hình 3.2 Sơ đồ pha loãng nồng độ nano bạc .32 Hình 4.1 Bột cao khô dịch chiết 05 loại dược liệu 37 Hình 4.2 Hiệu suất tách chiết loại dược liệu 38 Hình 4.3 Khả ức chế vi khuẩn in vitro cao dịch chiết dược liệu 42 Hình 4.4 Dịch chiết trầu khơng thu từ loại dung môi khác .44 Hình 4.5 Hiệu suất tách chiết trầu khơng sử dụng dung mơi khác .46 Hình 4.6 Phản ứng định tính xác định nhóm hoạt chất có cao dịch chiết Trầu khơng .49 Hình 4.7 Khả ức chế vi khuẩn in vitro cao dịch chiết Trầu không (100mg/ml) sử dụng dung môi khác vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (isolates 04) 52 Hình 4.8 Khả ức chế vi khuẩn in vitro cao khô dịch chiết pha loãng vi khuẩn .56 Hình 4.9 Khả diệt khuẩn in vitro nano bạc pha loãng nồng độ thời gian ngâm khác isolates 04 .59 Hình 4.10 Khả diệt khuẩn in vitro nano bạc pha loãng nồng độ thời gian ngâm khác isolates 09 .60 Hình 4.11 Khả diệt khuẩn in vitro phối trộn cao khô dịch chiết trầu không nano bạc với vi khuẩn Xoo 63 Hình 4.12 Chiều dài vết bệnh lúa sử dụng công thức phun khác (sau 18 ngày lây nhiễm) .66 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Vũ Thành Quang Tên Luận văn: “Đánh giá hiệu sử dung nano bạc thảo dược với khả phòng trừ bệnh bạc lúa” Ngành: Khoa học trồng Mã số: 60.62.01.10 Tên sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt nam Mục đích nghiên cứu: Nghiên cứu tiến hành nhằm kiểm tra hiệu suât tách chiết loại thảo dược dung môi ethanol 70% Trầu không (Piper betle) 07 loai dung mơi có độ phân cực khác (nước cất, methanol 80%, ethanol 70%, ethanol 96%, n –hexan, aceton 100%, aceton nitril 100%) Đồng thời đánh giá khả ức chế vi khuẩn in vitro, invivo cao khô dịch chiết thảo dược 02 chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lúa Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu sử dụng phương pháp chiết xuất loại thảo dược dung môi ethanol 70%; Trầu không ( Piper betle ) 07 dung môi với phân cực khác (nước cất, methanol 80 %, ethanol 70%, ethanol 96 %, n -hexan, acetone 100 %, acetone nitrile 100 % ) Phương pháp đánh giá khả ức chế vi khuẩn invitro dịch chiết xuất từ cao khô thảo dược, hạt nano bạc cho 02 isolates vi khuẩn Xanthomonas oryzae oryzae pv Phương pháp đánh giá tác dụng phòng trừ vi khuẩn invivo sử dụng riêng rẽ trộn hạt nano bạc cao khô dịch chiết vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lúa Phương pháp bố trí thí nghiệm phương pháp xử lý liệu phần mềm Excel 2007, IRRISTART 5.0 Kết kết luận: Kết thí nghiệm cho thấy, cao khơ loại dược liệu trừ Sài đất, có khả ức chế vi khuẩn in vitro hai chủng vi khuẩn nghiên cứu (04, 09) với đường kính vòng vơ khuẩn biến đổi từ 15,67 mm (cao khô Tỏi chủng vi khuẩn 09) đến đến 25,33 mm (cao khô dịch chiết Trầu không chủng vi khuẩn 09) Cao khô dịch chiết Trầu không cho kết ức chế vi khuẩn in vitro tốt ix Kết bảng 4.10 cho thấy khả ức chế in vitro vi khuẩn Xoo isolates 09 phối trộn nano bạc nồng độ 3,13 ppm với cao khô dịch chiết trầu không tách chiết dung môi ethanol 96% aceton nitril 100% nồng độ pha loãng 50mg/ml, 25mg/ml, 2,5mg/ml, 6,25mg/ml, 3,13mg/ml, 1,56mg/ml 0,78mg/ml, 0,39mg/ml có khả ức chế vi khuẩn thông qua xuất vòng vơ khuẩn Kết thí nghiệm Xoo isolates 04 cho thấy phối trộn nano bạc nồng độ 3,13 ppm với cao khô dịch chiết trầu không tách chiết loại dung môi ethanol 96% aceton nitril 100% nồng độ pha loãng 50mg/ml, 25mg/ml, 2,5mg/ml, 6,25mg/ml, 3,13mg/ml, 1,56mg/ml 0,78mg/ml, có khả diệt khuẩn thơng qua xuất vòng vơ khuẩn Cao khô dịch chiết trầu không nồng độ pha loãng 0,20 mg/ml, 0,10 mg/ml loại dung môi ethanol 96% aceton nitril 100% phối trộn với nano bạc nồng động 3,13 ppm không thấy xuất vòng vơ khuẩn Tương tự khả ức chế vi khuẩn in vitro cao khô dịch chiết Trầu không sử dụng đơn lẻ, phối hợp với nano bạc khả ức chế vi khuẩn in vitro cao khô dịch chiết Trầu không isolates vi khuẩn 09 tốt so với isolates vi khuẩn 04 Có sai khác nhiều nguyên nhân khác theo kết logic với việc isolates 04 có độc tính cao so với isolates 09 62 Aceton nitril 100% Ethanol 96% isolates 09 Ethanol 96% Aceton nitril 100% isolates 04 Hình 4.11 Khả diệt khuẩn in vitro phối trộn cao khô dịch chiết trầu không nano bạc với vi khuẩn Xoo So sánh với thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu dịch chiết trầu không ta thấy rằng, thí nghiệm khơng phối trộn dịch chiết với nano nồng độ khả ức chế vi khuẩn hai loại cao khô dịch chiết từ 3,15mg/ml đến 1,56mg/ml Khi tiến hành phối trộn nồng độ 0,78mg/ml đến 0,39mg/ml có khả ức chế vi khuẩn Vậy, nồng độ cao dịch chiết pha loãng từ 128 lần đến 256 lần so với nồng độ gốc quan sát thấy vòng vơ khuẩn Trong đó, cao dịch chiết khơng bổ sung thêm nano bạc có tác dụng diệt khuẩn pha loãng từ 64 đến 128 lần Mặc dù phối trộn, vòng vơ khuẩn lớn không đáng kể so với không phối trộn rõ ràng sắc nét nhiều Ở nồng độ nhỏ, thí nghiệm khơng phối trộn khơng thấy 63 vòng vơ khuẩn phối trộn xuất vòng vơ khuẩn dù đường kính khơng đáng kể nhìn thấy rõ 4.7 Đánh giá tác dụng nano bạc cao khô dịch chiết Trầu không lúa điều kiện thí nghiệm in vivo Kết thí nghiệm cho thấy, cao khô dịch chiết Trầu không nano bạc có khả ức chế sinh trưởng phát triển in vitro chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh bạc Mục đích thí nghiệm nhằm khảo sát kiểm chứng khả ứng dụng cao khô dịch chiết Trầu không nano bạc việc chống lại bệnh bạc lúa thực tế in vivo Theo kết thí nghiệm 4.5 chọn lựa cao khô dịch chiết Trầu không sử dụng dung môi ethanol 96% cho khả ức chế vi khuẩn in vitro tốt để tiến hành thí nghiệm Nồng độ cao khơ dịch chiết lựa chọn nồng độ nhỏ khả ức chế vi khuẩn in vitro (có xuất vòng vơ khuẩn) nồng độ MICDC 1,56 mg/ml Đối với nano bạc, theo kết thí nghiệm 4.6, sử dụng nồng ức chế tối thiểu MICnano 6,25 ppm để tiến hành thí nghiệm Ở nồng độ nano bạc có tác dụng diệt khuẩn in vitro 02 isolates vi khuẩn Nhằm đánh giá khả phối hợp nano bạc cao khô dịch chiết Trầu không điều kiện in vivo, chúng tơi sử dung dung dịch có chứa cao khơ dịch chiết nano bạc Nano bạc có nồng độ 3,13 (bằng ½ MICnano) cao khơ dịch chiết sử dụng có nồng độ nồng độ MICDC 1,56 mg/ml Sau lây nhiễm nhân tạo 48h tiến hành phun công thức lên lúa điều kiện thí nghiệm chậu vại Sau 18 ngày theo dõi, nhận thấy tất công thức lây nhiễm nhân tạo có biểu bệnh, chiều dài vết bệnh bình quan khác tùy thuộc vào công thức phun biến đổi từ 6,67 cm đến 21,06 cm Kết cho thấy, isolates vi khuẩn 04 (phân lập giống Bắc thơm Bình Gia Hải Dương) có khả gây bệnh cao giống lúa IR24 Ở công thức đối chứng phun nước cất sau 18 ngày lây nhiễm, chiều dài vết bệnh đạt 21,06 cm, lúa bị nhiễm bệnh nặng, khơng mầu xanh chuyển hồn tồn sang mầu xám khả quang hợp (hình 4.12) Theo tiêu chuẩn đánh giá rõ ràng giống IR24 nhiễm nặng với bệnh bạc lúa chủng 04 64 khuyến cáo Thuốc bảo vệ thực vật Kasumin 2SL chứa hoạt chất Kasugamicin có tác dụng làm giảm khả nhiễm bệnh bạc điều kiện thí nghiệm, chiều dài vết bệnh giảm nhiều (từ 21,06 cm xuống 6,67 cm) theo tiêu chuẩn đánh giá thuốc kasugamycin giúp làm giảm khả gây bệnh vi khuẩn từ mức nhiễm nặng xuống kháng Khi sử dụng thuốc, khả gây bệnh chủng 04 giảm 31,67% so với đối chứng sử dụng nước cất Ở công thức khác, sử dụng phun dung dịch nano bạc, cao khô dịch chiết phối hợp nano bạc với cao khô dịch chiết làm giảm khả gây bệnh bạc isolates vi khuẩn 04 Chiều dài vết bệnh có giảm rõ rệt từ 7,55 cm đến 13,67 cm, tức giảm 35,85% đến 64,91% so với đối chứng Khi sử dụng nano bạc nồng độ MICnano 6,25 ppm để phun, làm giảm khả nhiễm bệnh vi khuẩn thể qua chiều dài vết bệnh giảm 13,67 cm so với 21,06 cm, theo tiêu chuẩn đánh giá khả kháng nhiễm lúa đánh giá mức nhiễm nặng Sử dụng dịch chiết Trầu không nồng độ 1,56 mg/ml cho kết ức chế vi khuẩn khả quan, chiều dài vết bệnh giảm rõ rệt so với đối chứng từ 21,06cm xuống 11,84 cm Khả gây bệnh vi khuẩn 56,22% so với đối chứng, theo tiêu chuẩn đánh giá khả kháng nhiễm lúa, nhận định mức nhiễm vừa Đặc biệt sử dụng phối hợp nano bạc cao khô dịch chiết Trầu khơng, kết thí nghiệm cho thấy khả gây bệnh vi khuẩn giảm xuống 35,85% Chiều dài vết bệnh 7,55 cm, theo tiêu chuẩn đánh giá khả kháng nhiễm lúa đánh giá kháng Khi so sánh với sử dụng kháng sinh kasugamycin cho kết tương đương khơng có sai khác mặt thống kê 65 Bảng 4.10 Chiều dài vết bệnh sau lây nhiễm đánh giá khả kháng nhiễm giống lúa IR 24 Chiều dài vết bệnh 18 ngày sau lây nhiễm, cm CT1: Đối CT2: Phun dịch CT3: Phun hỗn hợp chứng sử dụng chiết trầu dịch chiết thực vật nước cất không nồng độ nano bạc (MICDC + MICDC 1/2MICnano) 21,06 11,84 7,55 Nhiễm nặng 100 Nhiễm vừa Kháng CT4: Phun nano bạc nồng độ MICnano 13,67 CT5: Sử dụng kasugamycin Nhiễm nặng Kháng Khả gây bệnh so với đối chứng, % 56,22 35,85 64,91 6,67 31,67 CV% 7,3 LSD 0,05 Hình 4.12 Chiều dài vết bệnh lúa sử dụng công thức phun khác (sau 18 ngày lây nhiễm) Theo nghiên cứu Rukhsana jabeen (2011), sử dụng dịch chiết 03 loại (Terminalia chebula, Amomum subulatum, Thuja orientalis), cho khả ức chế vi khuẩn bạc điều kiện in vivo chiều dài vết bệnh nhỏ so với đối chứng Dịch chiết Terminalia chebula cho kết tốt nhất, với khả kiểm soát bệnh bạc tăng 83,25% so với đối chứng Cũng theo nghiên cứu ứng dụng diện rộng cánh đồng dịch chiết Terminalia chebula cho kết khả quan 66 Kết nghiên cứu số tác giả khác khẳng định khả ức chế vi khuẩn in vitro dịch chiết thực vật, điều kiện thí nghiệm nhà lưới in vivo Một số tác giả nhận thấy ứng dụng điều kiện đồng ruộng dịch chiết thực vật cho khả giảm thiểu thiệt hại vi khuẩn bạc gây Những điều lần chứng minh tính khả thi cho việc sử dụng hợp chất thiên nhiên, không độc hại thay thuốc bảo vệ thực vật hóa học nhằm giảm thiểu ô nhiễm môi trường đảm bảo an toàn thực phẩm đảm bảo sức khỏe cộng động, nhằm phát triển nông nghiệp bền vững 67 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN - Cao khô dịch chiết loại thực vật sử dụng dung môi tách chiết ethanol 70% trừ Sài đất nồng độ 100mg/ml có khả ức chế vi khuẩn in vitro hai chủng vi khuẩn nghiên cứu Cao khô dịch chiết Trầu khả ức chế in vitro tốt hai isolates vi khuẩn (04; 09) với đường kính vòng vơ khuẩn 24,33±0,67mm đến đến 25,33±0,67 - Các loại dung môi tách chiết khác khả hòa tan hợp chất thực vật khác Khối lượng cao khô dịch chiết Trầu không từ 02 g bột ban đầu, tùy thuộc vào loại dung mơi có độ giao động lớn biến đổi từ 0,080±0,01 (dung môi n-hexan) đến 0,393±0,02 (dung mơi ethanol 96%) Trong dịch chiết có 10 loại nhóm chất khác (alkaloid, flavonoid, phytosterol, polyphenol, tanin, saponin, carotenoid, đường khử, chất béo, chất nhầy) Tùy loại dung mơi mà khả lơi kéo nhóm chất khỏi Trầu không khác Dung mơi ethanol lơi kéo nhiều loại nhóm chất (9 loại), sau Aceton nitril (8 loại) cuối nước cất với loại nhóm chất - Ở nồng độ 100mg/ml cao khơ dịch chiết trầu không sử dụng dung môi ethanol 96% cho kết đường kính vòng vơ khuẩn cao isolates vi khuẩn 04, 09 26,00±1,00 mm 25,67 ± 1,15 mm - Cao khô dịch chiết trầu không sử dụng dung môi ethanol 96% pha lỗng có tác dụng ức chế in vitro isolates vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae Nồng độ cao dịch chiết nhỏ khả ức chế in vitro 02 isolates vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae 04 09 0,78 mg/ml 1,56 mg/ml - Khả kháng khuẩn nano bạc phụ thuộc vào nồng độ nano bạc khoảng thời gian tiếp xúc với dịch khuẩn Nồng độ nano bạc cao thời gian ngâm lâu khả kháng khuẩn tốt Nồng độ kháng khuẩn tối thiểu nano bạc 6,25 ppm - Khi phối trộn cao dịch chiết Trầu không nano bạc nồng độ 3,13, mg/ml (1/2 MIC nano) cho khả ức chế vi khuẩn in vitro tốt chủng vi khuẩn thử nghiệm Ở nồng độ cao, phối trộn chưa làm 68 tăng rõ ràng hiệu ức chế vi khuẩn, nồng độ thấp hơn, khả ức chế vi khuẩn rõ ràng - Sử dụng riêng rẽ hay phối trộn nano bạc cao khô dịch chiết trầu không (sử dụng dung môi ethanol 96%) nồng độ ức chế tối thiểu cho khả ức chế vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae thí nghiệm in vivo giống lúa IR24 Khi kết hợp nano bạc với cao khô dịch chiết trầu không cho khả ức chế bệnh bạc cao so với sử dụng riêng loại dung dịch Khi sử dụng phối hợp nano bạc (3,13 ppm) cao khô dịch chiết trầu khơng (1,56 mg/ml), chiều dài vết bệnh 7,55 cm, tức giảm xuống 35,85% so với đối chứng 5.2 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu xác định nồng độ phù hợp hỗn hợp dịch chiết trầu không nano bạc cho khả phòng trừ hiệu bệnh bạc lúa vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây - Thử nghiệm khả ứng dụng nano bạc cao khô dịch chiết quy mô lớn để ứng dụng thực tế sản xuất 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bộ môn dược liệu (2011) Bài giảng dược liệu, tập I trường Đại học Dược Hà Nội Bùi Trọng Thủy, Furuya, N., Taura, S., Yoshimura, A., Lê Lương Tề Phan Hữu Tôn (2007) Một số nhận xét đa dạng nhóm nòi vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lúa miền bắc Việt Nam (20012005) Tạp chí BVTV, ISSN 0868-2801, số 3(213)-2007 tr 19-26 Đỗ Tấn Dũng Nguyễn Văn Viên (2005) Bệnh bạc lá, Một số bệnh hại lúa biện pháp phòng trừ NXB Nơng nghiệp, Hà Nội tr 42-45 Đỗ Tất Lợi (1999) Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB Y học, Hà Nội Hà Bích Thu, Ngơ Vĩnh Viễn, Vũ Thị Hợi, Đinh Thị Thanh Nguyễn Thị Thuý (2002) Kết điều ta bệnh hại giống lúa Trung Quốc 1993 – 1997 Hội thảo Bệnh sinh học phân tử 21-6-2002 Hoàng Thị Tuyết Nhung, Thái Nguyễn Hùng Thu Trịnh Văn Lẩu (2012) Nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn đối chiếu có nguồn gốc dược liệu Conessin, Kaempferol Nuciferin sau 15 tháng bảo quản Tạp chí Dược học 423 tr 31-34 Lê Lương Tề (1980) Bệnh bạc vùng đồng sơng Hồng Tuyển tập cơng trình nghiên cứu KHKTNN NXB Nông nghiệp, Hà Nội tr 184-197 Nguyễn Công Khoái (2002) Nghiên cứu bệnh bạc lúa (Xanthomonas oryzae Pv oryzae ) hại số giống lúa lai, lúa tỉnh Nam Định 2001 – 2002 Luận án thạc sĩ nông nghiệp Nguyễn Ngọc Hùng (2011) Nghiên cứu chế tạo hạt nano bạc khả sát khuẩn Đại học Cơng nghệ Hà Nội 10 Nguyễn Ngọc Tú (2009) Nghiên cứu gel nước thông minh nhạy pH lai nano bạc Khóa luận tốt nghiệp đại học tr 8-9 11 Nguyễn Nho Dũng (2011) Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học tinh dầu dịch chiết từ trầu không Trường Đại học Đà Nẵng 12 Nguyễn Thanh Hải, Bùi Thị Tho (2013) Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn in vitro dịch chiết tỏi (Allium sativum L.) E coli gây bệnh E coli kháng Ampicillin, Kanamycin Tạp chí Khoa học Phát triển 2013, tập 11, số 6: 804-808 70 13 Phan Hữu Tôn (2004) Chiến lược chọn tạo giống lúa chống bệnh bạc miền Bắc Việt Nam 14 Viện dược liệu (2005) Nghiên cứu phát triển dược liệu đông dược Việt Nam NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Tiếng nước ngoài: 15 Amadou C.K (1998) Promoting Alternative Medicine Africa Health Journal, pp 20-25 16 Cos, P.,et al., (2006) Antimicrobial agents Ethnopharmacology 106: 209-302 17 Dennis Dearth I.R (1992) Neem – A tree for solving global problem National Academy Press, Washington D.C., USA 141 pages.s 18 Gislence G.F., J.L Nascimento, C.F Paulo and L.S Giuliana (2000) Antibacterial activity of plant extracts and phytochemicals on antibiotic resistant Bacteria Brazilian J of Microbiology 31 pp 247 – 256 19 Huynh Kim Dieu (2005) The ethnobotanical and botanical study on Pseuderanthemum palatiferum as a new medicinal plant in the Mekong Delta of Vietnam, Jircas 20 Ishiyama, S (1922) Studies of bacterial leaf blight of rice Report Imp Agric Stn Konosu 45.pp 233–261 21 Leung H, RJ Nelson and J.E Leach (1993) Population structure of plant pathogenic fungi and bacteria Adv Plant Pathol 10 pp 157-205 22 Mahesh, B and S Satish (2008) Antimicrobial activity of some important medicinal plant against plant and human pathogens World J Agric Sci, [S] 839-843 23 Mew TW, SZ Wu and O Horino (1982) Pathotypes of Xanthomonas oryzae pv oryzae in Asia IRPS 75 pp 2-7 24 Mew T.W (1987) Current status and future prospects of research on bacterial blight of rice Annual Review Phytopathology 25 pp 359-382 25 Seyyedneiad, S.M and H Motamedi (2010) A review on Native medicinal Plant in Khuzestan, Iran with Antibacterial properties International journal of Pharmacology, pp 551-560 26 Adhikari T B and RC Basnya 1999 Virulence of Xanthomonas oryzae pv oryzae on rice lines containing single resistance genes and gene combinations In the American phytophathological society Plant Disease vol.83 No.1 pp 46-50 71 27 Brar, D S & Khush, G S 1997 Alien introgression into rice Plant Mol Biol 35 pp 35–47 28 Byoung-Moo Lee*, Young-Jin Park, Dong-Suk Park, Hee-Wan Kang, Jeong-Gu Kim, Eun-Sung Song., 2005 The genome sequence of Xanthomonas oryzae pathovar oryzae KACC10331, the bacterial blight pathogen of rice Nucleic Acids Research Volume33, Issue2 pp 577-586 29 Causse M., M Fulton, Y G Cho, S N Ahn, J Chunwongse 1994 Saturated molecular map of the rice genome based on an interspecific backcross population Genetics138 pp 1251–1274 30 Chu ZH, M Yuan, JL Yao, XJ Ge, B Yuan, CH Xu, XH Li, BY Fu, ZK Li, JL Bennetzen, QF Zhang, SP Wang 2006 Promoter mutations of an essential gene for pollen development result in disease resistance in rice Genes Dev 20 pp 1-5 31 Chu, Z., and Wang, S., 2007 Isolation, structure, function relationship, and molecular evolution of disease resistance genes In Genetics and Improvement of Resistance to Bacterial Blight in Rice, Zhang Q., ed (Beijing: Science Press) pp 349–377 32 De Datta, S.K., 1981 Principles and practices of rice production John Wiley & Son Inc., Canada 33 Ezuka A and Horino 1974 Classification of rice varieties and Xanthomonas oryzae strains on the basis of their differential interactions Bull Tokai-Kinki Natl Agric Exp Stn 27 pp 1-19 34 Flor, H.H 1956 The complementary genetic systems in flax and flax rust Adv Genet., pp 29–54 35 Giarrocco LE, Marassib MA and Salernoa GL 2007 Assessment of the Genetic Diversity in Argentine Rice Cultivars with SSR Markers Crop Sci 47 pp 853-858 36 Gu K, JS Sangha, Y Li, ZC Yin 2008 Highsolution genetic mapping of bacterial blight resistance gene Xa-10 Theor Appl Genet 116 pp.155-163 37 Hoang Dinh Dinh, Nghi Ky Oanh, Nguyen Duc Toan, Pham Van Du and Le Cam Loan 2008 Pathotype profile of Xanthomonas oryzae pv oryzae isolate from the rice cosystem in CuuLong rever delta OMONRICE 16, pp 34-41 38 Huang N, ER Angels, J Domingo, G Mangpantay, S Singh, G Zhang, N Kumar, BJ Vadivel, GS Khush 1997 Pyramiding of bacterial blight resistance genes in rice: marker-assisted selection using RFLP and PCR Theor ApplGenet 95 pp 313–20 39 Iyer AS, SR McCouch 2004 The rice bacterial blight resistance gene xa-5 encodes a novel form of disease resistance Mol Plant-Microbe Inter 17 pp 1348-1354 72 40 Jalaluddin M, Nakai H, and Yamamoto T 2007 Genetic diversity and DNA fingerprinting of some modern Indica and Japonica rice Breed and Genet SABRAO 39 (1) pp 43-52 41 Kalyan Chakravarthi B and Rambabu Naravaneni 2006 SSR marker based DNA fingerprinting and diversity study in rice (Oryza sativa L.) AJB (9): 684-688 42 Khush GS, DJ Mackill, GS Sidhu 1989 Breeding rice for resistance to bacterial blight In:Bacterial blight of rice, International Rice Research Institute, Manila, pp 207-217 43 Khush, G.S & Kinoshita, T 1991 Rice karyotype, marker genes, and linkage groups In G.S Khush & G.H Toenniessen, eds Rice biotechnology, p 83-108 Wallingford, UK, CAB International and Manila, the Philippines, IRRI 44 Kuhara A, T Kurita, Y Tagami, H Fuji and N Sekiya 1965 Studies on the strain of Xanthomonas Oryzae (Uyeda et Ishiyama) Dowson, the pathogen of the bacterial leaf blight of rice, with special reference to its pathogenicity and phage-sensitivity Bull Kyushu Agric Exp Stn 11: 263-312 (In Japanese with English summary) 45 Lai Van E, Tahito noda, Pham Van Du, 1999 Resistance assessment of rice cultivar to Xanthomonas oryzae pv Oryzae and pathogen testing of bacterial leaf blight isolate in Vietnam Omonrice pp.120-131 46 Li ZK, LJ , Mei HW, Paterson AH, Zhao XH, Zhong DB, Wang YP, Yu XQ, Zhu L, Tabien R, Stansel JW, Ying CS (1999) A "defeated" rice resistance gene acts as a QTL against a virulent strain of Xanthomonas oryzae pv oryzae Mol Gen Genet 261 pp 58-63 47 Lin, W., Anuratha, C.S., Datta, K., Potrykus, I., Muthukrishnan, S & Datta, S.K 1995 Genetic engineering of rice for resistance to sheath blight Biol Tech., 13 pp 686-691 48 Yan-chang, WANG Shou-hai, LI Cheng-quan, WU Shuang, WANG De-zheng, DU Shi-yun 2004 Improvement of Resistance to Bacterial Blight by MarkerAssistedSelection in a Wide Compatibility Restorer Line of Hybrid Rice Rice Research Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230031, China, 11 (5-6) pp 231-237 49 McCouch S R., M L Abenes, R Angeles, G S Khush, and S D Tanksley, “Molecular tagging of a recessive gene, xa-5, for resistance to bacterial blight of rice”, Rice Genet Newsl., 1992.8 pp 143-145 50 McCouch S R., L Teytelman, Y Xu (2002) Development and mapping of 2240 new SSR markers for rice (Oryza sativa L.) DNA Research, vol 9: 199–207 51 Mew TW, CM Vera-Cruz 1979 Variability of Xanthomonas oryzae in infection of rice differential Phytopathol 69 pp 152–155 73 52 Mew TW, SZ Wu and O Horino 1982 Pathotypes of Xanthomonas oryzae pv oryzae in Asia IRPS 75: pp 2-7 53 Mew TW 1987 Current status and future prospects of research on bacterial blight of rice Annual Review Phytopathology 25 pp 359-382 54 Mohad, Haroonkhan, Hamid Rashid, 2007 Agrobacterium mediated transformation to build resistance agaisnt bacteria blight in rice Pak J Bot., 39(4) pp.1285-1292 55 Muhammad SR, Rezwan MM, Samsul AM and Lutfur Radman 2009 DNA fingerprinting of rice (Oryza sativa L.) cultivars using microsatellite markers AJCS (3) pp 122-128 56 Nguyen Thi Lang and Bui Chi Buu 2004 Molecular genetic analysis and markerassisted selection for restore line and bacterial blight resistance in hybrid rice SABRAO 36(2) pp 83-93 57 Nguyen Thi Pha, Nguyen Thi Lang, 2004 Marker assited selection in rice breeding for Bacteria leaf blight Omonrice, 12 pp 19-26 58 Ninox-Lui D O., P C Ronald and A J Bogdanove (2006) Pathogen profile Xanthomonas oryzae pathovars: model pathogens of a model crop Molec Plant Pathol, pp 303-324 59 Nishimura, Y (1961) Studies on the reciprocal translocation in rice and barley Bulletin of the National Institute of Agricultural Sciences Series, pp 171–235 60 Noda T, Pham van Du, Lai van E, Hoang Dinh Dinh, and H Kaku 1999 Pathogenicity of Xanthomonas oryzae pv oryzae strains in Vietnam Annals of the Phytopathological Society of Japan: 65(3) pp 293-296 61 Nori Kurata, Kenoichi Nonomurai and Yoshiaki Harushima, 1994 Rice Genome Organization: the Centromere and Genome Interactions Oxford Journals, Life Sciences , Volume90, Issue4, pp 427-435 62 Ou S.H 1985 Bacterial leaf blight In Bacterial Diseases, Rice Disease 2nd edition pp 61-96 63 Panaud et al (1996) Development of microsatellite markers and characterization of simple sequence length polymorphism (SSLP) in rice (Oryza sativa L.) Mol Gen Genet 252:597 64 Rashid, H., Yokoi, S.I., Toriyama, K and Hinanta, K 1996 Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice Plant Cell Rep 15 pp 727730 65 Ronald P C., B Albano, R Tabien, M L P Abenes, K S Wu, S R McCouch and S D Tanksley 1992 Genetic and physical analysis of the rice bacterial blight disease resistance locus Xa-21 Mol Gen Genet, 236 pp 113-120 74 66 Sanchez CA, Brar DS, Huang N, Li Z, Khush GS., 2000 Sequence Tagged Site marker-assisted selection for three bacterial blight resistance genes in rice Crop Sci 40 pp 792-797 67 Saito, A., M Yano, N Kishimoto, M Nakagahra, A Yoshimura, K Saito, S Kuhara, Y Ukai, M Kawase, T Nagamine, S Yoshimura, O Ideta, R Ohsawa, Y Hayano, N Iwata and M 56 Sugiura, 1991 Linkage map of restriction fragment length polymorphism loci in rice Jpn J Breed 41 pp 665-670 68 Shiping Wang, Jing Fu, Hongbo Liu, Yu Li, Huihui Yu, Xianghua Li, Jinghua Xiao 69 70 71 72 73 74 75 2010 Manipulating Broad-Spectrum Disease Resistance by Suppressing PathogenInduced Auxin Accumulation in Rice Plant Physiology Preview, 44p Sidhu G S and G S Khush 1978 Dominance reversal of a bacterial blight resistance gene in some rice cultivars, Phytopathol 68 pp 461-463 Singh K., Y Vikal, Mahajan, R K K Cheema, D Bhatia, R Sharma, J S Lore, and T S Bharaj 2007 Three novel bacterial blight resistance genes identified, mapped and transfer to cultivated rice O.sativa L Proceedings of the 2nd International Conference on Bacterial Blight of Rice, Nanjing, China pp 82-84 Siriporn Korinsak, Saengchai Sriprakhon, Pattama Sirithanya, Jirapong Jairin, Siripar Korinsak, Apichart Vanavichit, and Theerayut Toojinda 2009 Identification of microsatellite markers (SSR) linked to a newbacterial blight resistance gene xa33(t) in rice cultivar ‘Ba7’ Maejo Int J Sci Technol, 3(02) pp 235-240 Sun XL, YL Cao, ZF Yang, CG Xu, XH Li, SP Wang, QF Zhang 2004 Xa-26, a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv oryzae in rice, encoding an LRR receptor kinase-like protein Plant J 37 pp 517-527 Suparyono Sudir and Suprihanto, 2004 Pathotype profile of Xanthomonas oryzae pv Oryzae isolates from the rice ecosystem in Java Indonesian Journal of Agriculture Science: 5(2) pp 63-69 Terada, R and K Shimamoto 2004 Expression of CaMV35S-GUS gene in transgenic rice plants Mol Gent., 220 pp 389-392 Yamamoto T, HR Hifni, M Muchmud, T Nishizawa, and DM Tantera 1977 Variation in pathogenicity of Xanthomonas oryzae pv, vol.83 No.1 pp 46-50 75 NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI PHỤ LỤC ∗ Thành phần môi trường nuôi Walimoto: Khoai tây gọt vỏ 300g NaHPO4.12H2O 2g Đường Saccarose 15g Ca(NO3).4H2O 0,5g Peptone 5g Agar 15g Nước cất 1000 ml pH 7,0 ∗ Môi trường LB (Luria Bertani) đặc Peptone: 10 g/l Cao nấm men (Yeast extract): g/l Muối NaCl: 10 g/l Agar 15g/l pH: 7,0 ± 0,2 ∗ Môi trường LB (Luria Bertani) lỏng Peptone: 10 g/l Cao nấm men (Yeast extract): g/l Muối NaCl: 10 g/l pH: 7,0 ± 0,2 76 ... thảo dược xu hướng góp phần nâng tầm giá trị thuốc Việt Nam hội nhập với quốc tế Từ thực tế trên, tiến hành đề tài: Đánh giá hiệu sử dung nano bạc thảo dược với khả phòng trừ bệnh bạc lúa 1.2... TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Vũ Thành Quang Tên Luận văn: Đánh giá hiệu sử dung nano bạc thảo dược với khả phòng trừ bệnh bạc lúa Ngành: Khoa học trồng Mã số: 60.62.01.10 Tên sở đào tạo:... chiết thảo dược đánh giá hiệu suất tách chiết sử dụng dung môi khác Xác định sơ nhóm hoạt chất có cao khô dịch chiết + Đánh giá khả diệt khuẩn in vitro cao dịch chiết nano bạc vi khuẩn gây bệnh bạc