Nghiên cứu một số hoạt động tính sinh học của đài hoa bụp giấm hibiscus sabdariffal

Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết bụp giấm của các loại dung môi tách chiết khác nhau đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị .... Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết bụp g

Lớp 13DSH04

MSSV: 1311101077

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG v

DANH SÁCH CÁC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Đại cương về cây atiso đỏ 3

1.1.1 Tên gọi và phân loại thực vật 3

1.1.1.1 Tên gọi 3

1.1.1.2 Phân loại thực vật 3

1.1.2 Mô tả thực vật 3

1.1.3 Phân bố 4

1.2 Giá trị sử dụng của cây atiso đỏ 4

1.3 Các thành phần hóa học từ thực vật 5

1.3.1 Carbohydrate 5

1.3.2 Alkaloid 7

1.3.3 Glycoside 9

1.4 Tổng quan về cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ TV 19

1.4.1 Khái niệm về hoạt tính kháng khuẩn 19

1.4.2 Cơ chế kháng khuẩn 19

1.4.3 Một số hợp chất có khả năng kháng khuẩn từ thực vật 21

1.4.4 Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thế giới và tại VN 27

1.4.5 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 30

1.5 Ảnh hưởng của dung môi đến khả năng tách chiết cao từ thực vật 31

1.6 Tổng quan về một số nhóm vi khuẩn gây bệnh 32

1.6.1 Nhóm vi khuẩn Escherichia coli 32

1.6.2 Nhóm vi khuẩn Salmonella spp 33

1.6.3 Nhóm vi khuẩn Shigella spp 35

1.6.4 Nhóm vi khuẩn Listeria spp 36

1.6.5 Nhóm vi khuẩn Vibrio spp 37

1.6.6 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Pseudomonas spp 38

1.6.7 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Enterococcus spp 39

1.6.8 Nhóm vi khuẩn Staphylococcus aureus 40

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42

2.1 Địa điểm 42

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 42

2.1.2 Thời gian nghiên cứu 42

2.2 Vật liệu nghiên cứu 42

2.2.1 Nguồn mẫu 42

2.2.2 Vi khuẩn chỉ thị 42

2.2.3 Hóa chất dung môi 42

2.2.4 Dụng cụ và thiết bị 43

2.3 Phương pháp nghiên cứu 44

2.3.1 Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu 44

2.3.2 Phương pháp tách chiết và thu nhận cao thực vật 44

2.3.3 Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 45

2.3.4 Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật chỉ thị 46

2.3.5 Phương pháp pha loãng mẫu 46

2.3.6 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 47

2.3.7 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC 48

2.3.8 Phương pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết 49

2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 52

2.4 Bố trí thí nghiệm 52

2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất thu hồi cao chiết từ đài hoa atiso đỏ 54

2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các loại cao chiết ethanol đối với VSV chỉ thị 56

2.4.3 Thí nghiệm 3: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết ethanol

50% từ cây bụp giấm đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh 59

2.4.4 Thí nghiệm 4: Định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết ethanol 50% từ đài hoa atiso đỏ 62

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 64

3.1 Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết đài hoa bụp giấm từ các dung môi tách chiết khác nhau 64

3.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết bụp giấm của các loại dung môi tách chiết khác nhau đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị 65

3.2.1 Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli 65

3.2.2 Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp 67

3.2.3 Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp 69

3.2.4 Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp 71

3.2.5 Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp 72

3.2.6 Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da 75

3.2.7 Tổng hợp kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với 20 vi khuẩn gây bệnh gây bệnh 76

3.3 Kết quả định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết bụp giấm từ ethanol 50% 86

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 90

4.1 Kết luận 90

4.2 Đề nghị 90

TÀI LIỆU THAM KHẢO 91

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

DMSO: Dimethyl sulfoxide

DNA: Deoxyribonucleic acid

MBC: Minimal Bactericidal Concentration: Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MIC: Minimum Inhibition Concentration: Nồng độ ức chế tối thiểu RNA: Ribonucleic acid

TSA: Trypton Soya Agar

TSB: Trypton Soya Broth

NA: Non - activity

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Chức năng sinh lý của một số amino acid trong quá trình trao đổi chất 17 Bảng 1.2 Những nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn (theo Cowan, 1999) 20 Bảng 3.1 Kết quả đường kính vòng ức chế (mm) của cao chiết bụp giấm từ các loại dung môi ethanol khác nhau trên 20 chủng vi khuẩn gây bệnh 81 Bảng 3.2 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết bụp giấm từ ethanol 50% đối với 20 chủng vi khuẩn gây bệnh 84 Bảng 3.3 Kết quả định tính một số thành phần hóa học của cao chiết bụp giấm từ ethanol 50% 87

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây và đài hoa atiso đỏ 4

Hình 1.2 Sơ đồ phân loại nhóm carbohydrate 6

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học một số chất thuộc nhóm alkaloids 8

Hình 1.4 Sơ đồ phân loại glycoside 9

Hình 1.5 Sơ đồ phân loại nhóm saponin 10

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của flavonoid (A) và các dạng flavonoid, (B) Euflavonoid, (C) Isoflavonoid, (D) Neoflavonoid 13

Hình 1.7 Caffeic acid 14

Hình 1.8 Phân loại nhóm phenolics theo cấu trúc hóa học 14

Hình 1.9 Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật (Burt, 2004) 19

Hình 1.10 Cấu trúc hóa học của phân tử quinone, anthraquinone và hypericin 22

Hình 1.11 Cấu trúc hóa học của catechine 23

Hình 1.12 Cấu trúc hóa học của coumarine 24

Hình 1.13 Cấu trúc hóa học của phân tử Solamargine 25

Hình 1.14 Cấu trúc hóa học của berberine 26

Hình 1.15 E.coli quan sát dưới kính hiển vi với kích thước 2 µm (Bact, 2005) 33

Hình 1.16 Hình thái vi khuẩn Salmonella spp (Taragui, 2005) 34

Hình 1.17 Hình thái của vi khuẩn Shigella spp (Reynolds, 2011) 35

Hình 1.18 Vi khuẩn Listeria spp 36

Hình 1.19 Hình thái vi khuẩn Vibrio spp (Microscopy, 2004) 37

Hình 1.20 Vi khuẩn Pseudomonas 39

Hình 1.21 Vi khuẩn Enterococcus 40

Hình 1.22 Vi khuẩn Staphylococcus aureus 41

Hình 2.1 Mẫu bụp giấm ngâm trong ethanol (tỷ lệ 1:20 (w/v)) 45

Hình 2.2 Phương pháp pha loãng mẫu 47

Hình 2.3 Đường kính vùng ức chế vi khuẩn của cao EtOH 70% và ciprofloxacin 48 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 53

Hình 2.5 Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ cây atiso đỏ 54

Hình 2.6 Mẫu bụp giấm cắt nhỏ 55

Hình 2.7 Dịch chiết mẫu từ bụp giấm ngâm với ethanol 70% 55

Hình 2.8 Quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết 57

Hình 2.9 Giếng thạch trước và sau khi bổ sung cao 58

Hình 2.10 Vòng kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% (100 mg/ml) đối với chủng Staphylococcus aureus (A) và Samolnella enteritidis (B) 59

Hình 2.11 Quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết 60

Hình 2.12 Quy trình định tính một số thành phần hóa học của cao chiết ethanol 50% từ cây atiso đỏ 62

Hình 3.1 Hiệu suất thu hồi cao chiết từ bụp giấm với các dung môi khác nhau 64

Hình 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết bụp giấm từ các loại dung môi khác nhau và ciprofloxacin đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli 66

Hình 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết bụp giấm từ các loại dung môi khác nhau và ciprofloxacin trên nhóm vi khuẩn Listeria spp 68

Hình 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết bụp giấm từ các loại dung môi khác nhau và ciprofloxacin trên nhóm vi khuẩn Salmonella spp 69

Hình 3.5 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết bụp giấm từ các loại dung môi khác nhau và ciprofloxacin trên nhóm vi khuẩn Shigella spp 71

Hình 3.6 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết bụp giấm từ các loại dung môi khác nhau và ciprofloxacin trên nhóm vi khuẩn Vibrio spp 73

Hình 3.7 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết bụp giấm từ các loại dung môi khác nhau và ciprofloxacin trên nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da 75

Cây bụp giấm có tên khoa học là Hibiscus sabdariffa L., thuộc họ bông Cây

cao từ 1,5 – 2 m, thân màu lục hoặc đỏ tía, phân nhánh gần gốc, cành nhẵn hoặc hơi

có rang cưa Hoa đơn độc, mọc ở nách, gần như không có cuống, đường kính từ 8 –

10 cm Tràng hoa màu vàng hồng hay tía, có khi trắng Quả nang hình trứng, có lông thô mang đài màu đỏ sáng tồn tại bao quanh quả Hạt màu đen, gần tròn và thô, chứa nhiều tinh dầu

Đài hoa bụp giấm là một loại dược liệu rất có lợi cho sức khỏe Tính theo hàm lượng chất khô đài hoa bụp giấm chứa khoảng 1,5% anthocyanin, axit hữu cơ khoảng 15 – 30%, các vitamin A, B1, B2, C, E, F và nhiều loại khoáng chất như sắt, đồng, canxi, magie, kẽm… Đài hoa bụp giấm chứa một loại chất chống oxy hóa rất hiếm là flavonoid lên tới 12% Chất này oxy hóa chậm hay ngăn cản một cách hiệu quả quá trình oxy hóa của các gốc tự do, có thể là nguyên nhân khiến các tế bào hoạt động khác thường Từ đó giúp làm chậm quá trình lão hóa Theo nghiên cứu của nhà khoa học dinh dưỡng Diane McKay và đã được trình bày trong hội nghị thường niên của Hiệp hội Tim mạch Mỹ đã chỉ ra rằng:”Chỉ với ba tách trà đài hoa bụp giấm mỗi ngày sẽ hỗ trợ giảm cao huyết áp của những người có nguy cơ mắc các bệnh về tim, đột quỵ hay các vấn đề về thận”

Theo tìm hiểu về cây bụp giấm đặc biệt là đài hoa ở Việt Nam, cho đến nay chỉ có một số ít tác giả có công trình nghiên cứu sơ bộ về từ đài hoa bụp giấm Để

đa dạng hơn về nghiên cứu kháng khuẩn của loại cây này nên tôi thực hiện đề tài

nghiên cứu ”Nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của đài hoa bụp giấm - Hibiscus

Sabdariffa L,.” đề tài này được thực hiện tại phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ

Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí

Minh

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết Đài hoa bụp giấm với nhiều loại dung môi tách chiết khác nhau Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của

cao chiết đài hoa bụp giấm

- Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của cao chiết từ đài hoa bụp giấm

3 Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá ảnh hưởng của các loại dung môi đến hiệu suất thu hồi cao chiết từ đài hoa bụp giấm với các dung môi ethanol 50%, 70% và 90%

- Khảo sát sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết Đài hoa bụp giấm từ các loại dung môi khác nhau đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh

- Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết Đài hoa bụp giấm

- Xác định sự hiện diện một số thành phần hóa học của cao chiết Đài hoa bụp

giấm

4 Phạm vi nghiên cứu

- Mẫu đài hoa bụp giấm được tách chiết cao từ các loại dung môi khác nhau: ethanol (50%, 70% và 90%) khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên các nhóm vi

khuẩn: Escherichia Coli, Samonella spp., Vibrio spp., Shigella spp., Listeria spp.,

Pseudomonas spp., Enterococcus spp., Staphylococcus spp

- Định tính các thành phần hóa học: carbohydrate, saponin, alkaloid, cardiac glycoside, anthraquinone glycoside, flavonoid, phenolic compound, tannin, steroid, amino acid

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về cây bụp giấm

1.1.1 Tên gọi và phân loại thực vật

1.1.1.1 Tên gọi

Tên khoa học : Hibiscus sabdariffa Linn

Tên tiếng anh : Roselle

Tên thường gọi : atiso đỏ, bụp giấm , hoa vô thường, hoa lạc thần, mai côi gia, đay nhật, lạc tề quỳ

Tên đồng nghĩa : Abelmoschus cruentus, Hibiscus digitatus, Hibiscus

gossypiifolius, Hibiscus sanguineus, Sabdariffa rubra

1.1.1.2 Phân loại thực vật

Theo phân loại thực vật học, cây bụp giấm được sắp xếp theo trình tự:

Tên khoa học (Binomial name) : Hibiscus sabdariffa

1.1.2 Mô tả thực vật

Bụp giấm là loại cây sống khoảng hằng niên, cây cao từ 1,5 – 2 m, thân màu lục hoặc đỏ tía, phân nhánh gần gốc, cành nhẵn hoặc hơi có lông Lá mọc so le, lá ở gốc nguyên, lá phía trên chia 3 – 5 thùy hình chân vịt, mép có răng cưa Hoa đơn độc, mọc ở nách, gần như không có cuống, đường kính từ 8 – 10 cm Tràng hoa màu vàng hồng hay tía, có khi trắng Quả nang hình trứng, có lông thô mang đài màu đỏ sáng tồn tại bao quanh quả

Chu kỳ sinh trưởng và phát triển của cây bụp giấm từ 4 – 6 tháng Cây ưa sáng, chịu hạn, có thể trồng ở đất đồi xấu, khô cằn bụp giấm được nhân giống từ hạt Hạt được gieo vào đầu mùa mưa và có thể thu hoạch sau 4 – 6 tháng

Hình 1.1 Cây và đài hoa bụp giấm

1.1.3 Phân bố

Cây bụp giấm có nguồn gốc ở Trung Mỹ và Bắc Phi, sau lan sang Ấn Độ, Malaysia, Philippin, Indonexia và Thái Lan

Ở nước ta, cây được trồng thử nghiệm để phủ đất trống, đồi trọc cho kết quả

ở Hà Tây, Hòa Bình, Bắc Giang, Thái Nguyên, Ba Vì và một số tỉnh sau này như

Bà Rịa Vũng Tàu, Đồng Nai Tuy nhiên, cây được trồng thành công ở Việt Nam chủ yếu thuộc các tỉnh miền Trung, thích hợp với đất đồi núi và trung du

1.2 Giá trị sử dụng của cây atiso đỏ

Cây bụp giấm là một trong hơn 300 loài thuộc giống cây bông được biết đến thế giới Giống cây này có rất nhiều ứng dụng trong đời sống con người và xu hướng sử dụng hiện nay như:

- Trồng để làm cây hoa cảnh

- Che phủ đất, cây hoang dại có sức sống cao

- Sử dụng để làm thảo dược và thực phẩm chức năng

Cây bụp giấm có thể được coi là cây thực phẩm chức năng với nhiều hoạt chất sinh học, tính sinh dược học cao, nhiều axit hữu cơ, các kích thích tố thực vật, giàu vitamin Nó cung cấp các chất dinh dưỡng cơ bản cho cơ thể

- Chống lại chứng cao huyết áp

- Làm giảm cholesterol trong máu

- Thay đổi thành phần nước tiểu, góp phần ngăn ngừa và làm tăng sỏi thận

- Có tác dụng chống viêm, sưng

- Chống sự oxy hóa và các gốc tự do bảo vệ tế bào

- Chống chứng co thắt gây nhồi máu cơ tim

- Sửa đổi những đột biến gen, ngăn ngừa ung thư

- Trích ly làm màu thực phẩm tự nhiên có tác dụng chống oxy hóa bảo vệ

tế bào cơ thể

- Tăng cường chức năng tiêu hóa

- Kháng nấm, kháng khuẩn

- Nâng đỡ chức năng gan, mật

- Hạn chế sự béo phì do tích tụ mỡ trong máu, bảo vệ thành mạch

Đông y cho rằng, cây bụp giấm có vị chua, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, giải khát, liễm phế, chỉ khái nên được sử dụng để trị liệu các bệnh như sau:

- Chữa bệnh gan mật, cao huyết áp: Lấy đài hoa bụp giấm 9 – 15g, sắc hoặc hãm nước uống

- Chữa cao huyết áp: Dùng cao đài hoa bụp giấm trộn cùng hydroxyl nhôm làm viên hoàn tương đương khoảng 0,64 g dược liệu Mỗi lần uống 3 – 5 viên, ngày 2 – 3 lần

uống hằng ngày thay nước trà

- Thực vật: chiếm khoảng 75% trong các bộ phận như củ, quả, lá, thân, cành

- Động vật: chiếm khoảng 2% trong gan, cơ máu,… (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013)

1.3.1.2 Phân loại

Dựa vào cấu tạo, tính chất carbohydrate được chia làm ba nhóm lớn: monosaccharide, oligosaccharide (Disaccharide) và polysaccharide (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013)

1.3.1.3 Vai trò

Trong cơ thể sống carbohydrate giữ nhiều vai trò quan trọng:

- Đảm bảo cung cấp khoảng 60% năng lượng cho các quá trình sống

- Có vai trò cấu trúc, tạo hình (ví dụ: cellulose, peptidglican )

- Có vai trò bảo vệ (mucopolysaccharide)

- Chống tạo thể cetone (mang tính acid gây độc cho cơ thể) (Nguyễn Phương Hà Linh Linh, 2011)

1.3.2 Alkaloid

1.3.2.1 Khái niệm

Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi trong động vật Thông thường các alkaloid kiềm không tan trong nước, dễ tan trong các dung môi hữu cơ Trái lại

Hình 1.2 Sơ đồ phân loại nhóm carbohydrate

các muối alkaloid thì dễ tan trong nước và hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ ít phân cực Từ đó, dựa vào độ tan khác nhau của các loại alkaloid mà sử dụng dung môi thích hợp để chiết xuất và tinh chế alkaloid

Alkaloid là amin có nguồn gốc tự nhiên do thực vật tạo ra, nhưng các amin do động vật và nấm tạo ra cũng được gọi là các alkaloid Nhiều alkaloid có các tác động dược lý học đối với con người và các động vật khác Các alkaloid thông thường là các dẫn xuất của các acid amin và phần nhiều trong số chúng có vị đắng Chúng được tìm thấy như là các chất chuyển hóa phụ trong thực vật (ví dụ khoai tây hay cà chua), động vật (ví dụ các loại tôm, cua, ốc, hến) và nấm Nhiều alkaloid có thể được tinh chế từ các dịch chiết thô bằng phương pháp chiết acid - base (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010)

Alkaloid có 2 phản ứng chính là phản ứng tạo tủa và phản ứng tạo màu Có 2 nhóm thuốc thử tạo tủa với alkaloid Nhóm thứ nhất cho tủa rất ít tan trong nước, tủa này sinh ra hầu hết là do sự kết hợp của 1 cation lớn là alkaloid với 1 nhóm anion lớn thường là anion phức hợp của thuốc thử và nhóm thứ hai cho kết tủa ở dạng tinh thể Đối với phản ứng tạo màu, có 1 số thuốc thử tác dụng với alkaloid cho những màu đặc biệt khác nhau Phản ứng tạo tủa cho ta biết có alkaloid hay không, còn phản ứng tạo màu cho biết những chất có trong alkaloid (Phạm Thanh

Kỳ, 1998)

1.3.2.2 Phân loại

Các nhóm alkaloid hiện nay bao gồm:

- Nhóm pyridine: piperin, coniin, trigonellin, arecaidin, guvacin, pilocarpin, nicotin, spartein, pelletierin

- Nhóm isoquinolin: các ancaloit gốc thuốc phiện như morphin, codein, thebain, papaverin, narcotin, sanguinarin, narcein, hydrastin, berberin

- Nhóm pyrrolidin: hygrin, cuscohygrin, nicotin

- Nhóm tropan: atropine, cocain, ecgonin, scopolamine

- Nhóm quinolin: quinine, quinidine, dihydroquinin, dihydroquinidin, strychnine, brucin, veratrin, cevadin

- Nhóm phenothylamin: mescalin, ephedrine, dopamine, amphetamine

- Nhóm indole:

o Các tryptamin: DMT, N-metyltryptamin, psilocybin, serotonin

o Các ergolin: Các ancaloit từ nhựa ngũ cốc/cỏ như ergin, ergotamine, acid lysergic v.v

o Các beta-cabolin: harmin, harmalin, yohimbin, reserpine, emetin

- Nhóm purin: Các xanthin như caffeine, theobromin, theophylline (Tôn Nữ

Minh Nguyệt và ctv, 2010)

1.3.2.3 Vai trò

Đa số các alkaloid đều có tác dụng diệt khuẩn, một số loại có tác động lên hệ thần kinh như morphin, codein, cocain,… Ngoài ra, alkaloid còn làm hạ huyết áp và giúp chống ung thư (Vũ Xuân Tạo, 2013)

1.3.3 Glycoside

 Khái niệm

Glycoside là những sản phẩm ngưng tụ của đường Cấu tạo gồm 1 phần đường (glycon) kết hợp với 1 phần không phải là đường (aglycon) theo Vũ Kim Dung và ctv (2011) Hai phần liên kết với nhau bằng dây nối acetal vì vậy phân tử glycoside

dễ bị phân huỷ khi có nước dưới ảnh hưởng của các enzyme (men) có chứa trong cây

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học một số chất thuộc nhóm alkaloids

Bản chất glycoside gồm cả phần carbohydrate và phi carbohydrate (alcohol) Đây là dạng tinh thể không màu và tác dụng của glycosides phụ thuộc vào phần aglycon còn phần glycon giúp tăng hoặc giảm tác dụng của chúng Glycoside dễ bị

hòa tan trong nước, có vị đắng và tạo mùi thơm đặc trưng (Trần Trường Hận, 2010)

Hình 1.4 Các nhóm glycoside

Saponin thường ở dạng vô định hình, có vị đắng, tan được trong nước, alcohol

và rất ít tan trong aceton, ether, hexan Khi hòa tan saponin vào nước sẽ làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo bọt (Nguyễn Tấn Thịnh, 2013)

 Phân loại

Saponin được chia thành 2 nhóm là saponin triterpenoid và saponin steroid (Nguyễn Tấn Thịnh, 2013)

 Vai trò

Vai trò của saponin:

- Tác dụng long đờm, chữa ho, lợi tiểu (liều cao gây nôn mửa, đi lỏng)

nhóm chức -OH, -OCH3, -CH3, -COOH, Tuỳ theo vị trí các nhóm chức đính vào nhân mà có các dẫn chất khác nhau (Ngô Văn Thu, 2011)

Những dẫn xuất anthraquinone glycoside đều có màu từ vàng, vàng cam đến

đỏ Ở thể glycoside thì dễ tan trong nước, còn thể tự do (aglycon) thì tan trong

ether, chloroform và một số dung môi hữu cơ khác (Ngô Văn Thu, 2011)

 Phân loại

Dẫn xuất anthraquinone glycoside có thể chia thành ba nhóm:

- Nhóm phẩm nhuộm các dẫn chất 1,2 - dihydroxy anthraquinone)

- Nhóm nhuộm tẩy (các dẫn chất 1,8 - dihydroxy anthraquinone)

- Nhóm dimer (Ngô Văn Thu, 2011)

 Vai trò

Vai trò của cardiac glycoside:

- Ở nồng độ thấp: có tác dụng điều hòa nhịp tim

- Ở nồng độ cao: gây nôn mửa, loạn nhịp tim, tiêu chảy, giảm sức co bóp của tim (Karkare, 2007)

1.3.3.4 Flavonoid

 Khái niệm

Flavonoid là 1 nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật, đây còn là sắc tố sinh học giúp tạo màu sắc cho hoa Flavonoid có cấu tạo gồm 2 vòng benzen A và B được nối với nhau qua một mạch 3 carbon Phần lớn các chất flavonoid có màu

vàng, tuy nhiên 1 số có màu xanh, tím, đỏ và 1 số khác lại không màu Trong thực vật cũng có 1 số hợp chất không thuộc flavonoid cũng có màu vàng như carotenoid, anthranoid, xanthon (Quỳnh Ngọc, 2011)

Chúng thường được cải biến bằng cách gắn thêm các gốc (-OH) hoặc (-OCH3)

và thường ở dạng phức với glucose và hữu cơ Trong số này có những nhóm chất phổ biến như flavonone, anthocyanin, flavon, catechine và rotenone Chỉ riêng hai nhóm flavon, flavonone với các nhóm thế là OH và OCH3 thì theo lý thuyết có thể gặp 38 627 chất (Ngô Văn Thu, 1998)

Các flavonoid có hoạt tính kháng khuẩn do chúng có khả năng tạo phức với các protein ngoại bào và thành tế bào vi khuẩn Flavonoid càng ưa béo thì càng có

khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật (Quỳnh Ngọc, 2011)

 Phân loại

Dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxy hóa của mạch 3C nên các flavonoid được chia thành 3 nhóm chính:

- Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-2: Euflavonoid

- Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3: Isoflavonoid

- Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-4: Neoflavonoid (Ngô Văn Thu, 2011)

 Vai trò

Hình 1.6.Cấu trúc hóa học của flavonoid (A) và các dạng flavonoid

(B) Euflavonoid, (C) Isoflavonoid, (D) Neoflavonoid

- Các chất flavonoid là những chất oxy hóa chậm hay ngăn chặn quá trình oxy hóa bởi các gốc tự do như OH+, ROO- (là các yếu tố gây biến dị, hủy hoại tế bào, ung thư, tăng nhanh sự lão hóa, ) làm cho tế bào hoạt động khác thường

- Flavonoid còn có khả năng tạo phức với các ion kim loại hay các hợp chất hữu cơ chứa các gốc nitrite, carboxyl, carbonyl,… giúp bảo vệ sinh vật chống lại quá trình oxy có hại như những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hóa Do đó, các chất flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, tổn thương do bức xạ Flavonoid còn có tác dụng chống độc, làm giảm thương tổn ở gan và bảo vệ chức năng gan

- Flavonoid còn có tác dụng chống dị ứng, kháng viêm bằng cách ngăn chặn

sự phóng thích hay tổng hợp các hợp chất làm tăng tình trạng viêm và dị ứng như histamine, serine protease, prostaglandin, leukotrien,… (Quỳnh Ngọc, 2011)

1.3.3.5 Phenolic

 Khái niệm

Hợp chất phenolic là các hợp chất có 1 hoặc nhiều vòng thơm với 1 hoặc nhiều nhóm hydroxyl, chúng được phân bố rộng rãi trong thực vật và các sản phẩm trao đổi chất của thực vật Hơn 8000 cấu trúc phenolic đã được tìm thấy từ các phân

tử đơn giản như các acid phenolic đến các hợp chất polymer như tannin Sự tích lũy các hợp chất phenolic phụ thuộc vào loài, trạng thái sinh lý và vị trí địa lý của các loài cây (Shetty và ctv, 2006)

Đa số các hợp chất phenolic được tổng hợp từ phenylalanine Ở thực vật nhóm phenolic chủ yếu được tìm thấy là caffeic acid, đây là 1 trong những hợp chất đơn giản có độc tính sinh học và được cấu tạo từ dẫn xuất thế vòng phenolic Một số phenolic như furanocoumarins thì không gây độc, nhưng khi tiếp xúc với nhiệt độ cao, dưới ánh sáng có bước sóng gần với tia tử ngoại (UV-A) thì nó trở nên rất độc (Nguyễn Thị Quỳnh Hoa, 2012)

 Phân loại

Phenolic chia làm hai nhóm:

 Vai trò

Vai trò của nhóm phenolic:

- Bảo vệ thực vật chống lại mầm bệnh, côn trùng và các động vật ăn cỏ

- Khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật và nấm sợi

- Chất chống oxi hóa tự nhiên và tìm thấy trong táo, trà xanh

- Chống ung thư, ngăn ngừa bệnh tim và kháng viêm (Nguyễn Thị Quỳnh Hoa, 2012)

Hình 1.7 Caffeic acid

Hình 1.8 Phân loại nhóm phenolics theo cấu trúc hóa học

hợp chất hữu cơ cao phân tử khác (amino acid và alkaloid) Chúng thường gặp chủ yếu trong thực vật bậc cao ở những cây hai lá mầm

Tannin tan trong nước, kiềm loãng, cồn, glycerin và aceton, đa số không tan trong các dung môi hữu cơ và đồng thời tủa với alkaloid, muối kim loại nặng (chì, thuỷ ngân, kẽm, sắt)

 Phân loại

- Tannin có thể chia thành hai loại chính:

- Tannin thủy phân được hay còn gọi là tanin pyrogalli (Gallic acid)

- Tannin ngưng tụ hay còn gọi là tanin pyrocatechic (Flavone)

 Vai trò

Vai trò của tannin:

- Bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng như thuốc trừ sâu

- Tác dụng kháng khuẩn, thường dùng làm thuốc súc miệng

- Công dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy…(Ngô Thị Thùy Dương, 2012)

1.3.3.7 Steroid

 Khái niệm

Steroid là một loại hợp chất hữu cơ, có bộ khung carbon stenan chứa bốn vòng cycloalkane được nối với nhau theo những cách đặc trưng riêng (Đặng Văn Hoài, 2009)

Steroid là hợp chất chất béo hữu cơ hòa tan, có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp dễ tan trong chloroform, ether, rượu nóng và không tan trong nước (Tôn Nữ

Minh Nguyệt và ctv, 2011)

 Phân loại

Steroid được chia làm 4 nhóm chính (Đặng Văn Hoài, 2009):

- Nhóm steroid động vật: Cholesterol, cholestan-3β-ol, coprostan-β-ol, desosterol, coprosterol, cerebrosterol và lathosterol

- Nhóm steroid của động vật biển không xương sống: Spongesterol, clionasterol, 24-methylencholesterol và fucosterol

- Nhóm steroid thực vật: Sistosterol (có các đồng phân α, β, ), stigmasterol, α

- spinasterol và brassicasterol

fecosterol

 Vai trò

- Tham gia vào các quá trình sinh học trong cơ thể sống

- Thường dùng làm các thuốc kích thích (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2011)

1.3.3.8 Amino acid

 Khái niệm

Amino acid là đơn vị cấu trúc cơ bản của protein Amino acid là một phân tử chứa cả nhóm amin và carboxylate, chúng tạo thành các xích polymer ngắn gọi là peptide hay polypeptides.Tất cả amino acid tự nhiên đều thuộc loại α-amino acid, nhóm amino (-NH2) gắn vào cacbon thứ 2 (hay cacbon α) của acid hữu cơ Ngoài các nhóm –NH2, −COOH, trong amino acid tự nhiên còn chứa các nhómchức khác

như: −OH, HS−, −CO−…

 Phân loại

Dựa vào cấu tạo gốc R để phân 20 amino acid cơ bản thành các nhóm Một trong các cách phân loại là 20 amino acid được phân thành 5 nhóm như sau (Hồ Chí Tuấn, 2009):

- Nhóm 1: Các amino acid có gốc R không phân cực kị nước, thuộc nhóm này

có 6 amino acid: Glysine (G), Alanine (A), Valine (V), Leucine (L), Isoleucine (I), Proline (P)

- Nhóm 2: Các amino acid có gốc R là nhân thơm thuộc nhóm này có 3 amino acid: Phenylanine (F), Tyrosine (Y), Tryptophan (W)

- Nhóm 3: Các amino acid có gốc R bazơ, tích điện dương, thuộc nhóm này có

3 amino acid: Lysine (K), Arginine (R), Histidine (H)

- Nhóm 4: Các amino acid có gốc R phân cực, không tích điện, thuộc nhóm này có 6 amino acid: Serine (S), Threonine (T), Cysteine (C), Methionine (M), Asparagine (N), Glutamine (Q)

- Nhóm 5: Các amino acid có gốc R acid, tích điện âm, thuộc nhóm này có 2 amino acid: Aspartate (D), Glutamate (E)

 Vai trò

Vai trò của amino acid trong cơ thể thực vật:

- Thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp trao đổi chất

- Tăng hiệu quả của thuốc bảo vệ thực vật

- Tăng khả năng ra hoa và quả

Amino Acid Hoạt động sinh hóa

Proline

Hydroxyproline

- Điều chỉnh trạng thái cân bằng nước

- Cấu tạo nên thành tế bào (nematostatic action)

- Thiết yếu để tạo phấn hoa (tốt cho đậu trái)

Glutamic

Glutamine

- Đạm hữu cơ dự trữ để tạo thành các amino acid khác

và protein thông qua phản ứng trao đổi

1.3.3.9 Isoprenoid (terpene)

 Khái niệm

Isoprenoid (terpene) là một nhóm chất lớn và đa dạng Bộ khung carbon được

tạo thành từ đơn vị cơ bản isoprene (-C5H8) Terpene có nhiều ở thực vật đặc biệt là loài họ Thông

- Có khả năng xua đuổi côn trùng

1.4 Tổng quan về cơ chế kháng khuẩn cùa các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật

1.4.1 Khái niệm về hoạt tính kháng khuẩn

Kháng khuẩn thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật, có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật Các chất kháng khuẩn thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở một nồng độ thường rất nhỏ (Silva và Fernandes, 2010)

1.4.2 Cơ chế kháng khuẩn

Cơ chế hoạt động khác nhau của các hợp chất kháng khuẩn có trong thực vật

đã được nghiên cứu Chúng có thể ức chế các vi sinh vật, gây trở ngại cho một số

quá trình trao đổi chất hoặc có thể điều chỉnh biểu hiện gen và con đường truyền tín hiệu (Etherton và ctv, 2002; Manson, 2003; Surh, 2003)

Không phải tất cả các cơ chế hoạt động đều làm việc trên các mục tiêu cụ thể,

và một số vùng khác của tế bào có thể bị ảnh hưởng bởi các cơ chế khác (Hình 1.8)

Cao chiết từ các loại thực vật có thể biểu hiện hoạt tính kháng lại các chủng vi khuẩn ở các mức độ khác nhau như sự can thiệp vào các lớp đôi phospholipid của màng tế bào gây hậu quả làm gia tăng độ thấm, tổn hại các thành phần tế bào, phá hủy các enzyme tham gia vào việc hình thành năng lượng tế bào, tổng hợp các thành phần cấu trúc, và đồng thời phá hủy hoặc làm bất hoạt các vật liệu di truyền Nói chung, cơ chế tác động của hợp chất kháng khuẩn tự nhiên có liên quan đến sự rối loạn, phá vỡ màng tế bào chất, làm gián đoạn mất ổn định lực chuyển động của proton (PMF), dòng điện tử, sự vận chuyển tích cực, và đông tụ các thành phần của

tế bào (Kotzekidou và ctv, 2008) cụ thể ở Bảng 1.2

Hình 1.9 Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật (Burt,

2004)

Ức chế enzyme Phá vỡ màng sinh chất Tạo phức hợp với thành tế

bào

Phá vỡ vách tế bào Tạo phức kim loại – ion

thực (hoạt tính kháng vius)

Bảng 1.2 Những nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn (theo

Cowan, 1999)

Mannose-Khóa sự kết hợp của virus hoặc hấp phụ

2(Z),9(Z)-diene-4,6-diyne-1,8-diol

tế bào, polypeptide ở thành tế bào vàcác enzyme trên màng Quinone cũng tạo ra chất nền không thể sử dụng được cho các vi sinh vật

Người ta nhận thấy rằng anthraquinone được lấy từ một loài cây có nguồn gốc

từ Pakistan có khả năng kìm hãm vi khuẩn Bacillus anthracis, Corynebacterium

pseudodiphthericum và Pseudomonas aeruginosa, có khả năng diệt khuẩn đối

vớiPseudomonas pseudomalliae Hypericin, một anthraquinone cho thấy là có khả

năng chống bệnh trầm cảm và có hoạt tính kháng khuẩn tổng hợp.(Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010)

Catechin là những hợp chất flavonoid được nghiên cứu rộng rãi do chúng có

mặt trong trà xanh oolong Qua những nghiên cứu, người ta nhận thấy trà xanh có

hoạt tính kháng khuẩn đã ức chế Vibrio cholerae O1, Streptococcus mutans,

Shigella spp., và các vi khuẩn, vi sinh vật khác.Catechin vô hoạt độc tố gây bệnh tả

của Vibrio, ức chế enzyme glucosyltransferase của vi khuẩn S mutans, cơ chế tác

dụng cũng là do khả năng tạo phức như được mô tả ở phần quinone Hoạt động Hình 1.10 Cấu trúc hóa học của phân tử quinone, anthraquinone và hypericin

nghiên cứu gần đây được tiến hành trên cơ thể chuột Khi chuột được cho ăn khẩu phần ăn có chứa 0.1% catechine có nguồn gốc từ trà thì khe nứt do sâu răng của

chuột do S.mutans gây ra giảm 40% (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010)

Nhiều nghiên cứu khác cũng cho thấy rằng các dẫn xuất của flavones có khả năng ức chế virus (RSV) Người ta đã tìm ra hoạt tính và phương thức hoạt động của quercetin, naringin, hesperetin và catechin Trong khi naringin không ức chế virus type 1(HSV-1) gây bệnh mụn giộp, polyvirus type 1, virus type 3 gây bệnh khó thở ở trẻ hoặc RSV, thì ba flavanoid khác lại có tác dụng theo những phương thức khác nhau Hesperetin làm giảm sự sao chép nội bào của các loài virus trên, catechin ức chếsự lây nhiễm nhưng không làm giảm sự sao chép nội bào của RSV

và HSV-1, quercetin là chất có hiệu quả tốt trong việc giảm tính lây nhiễm cácloại bệnh do vi sinhvật gây ra Người ta cho rằng sự khác nhau nhỏ về cấu tạo trong các hợp chất cũng ảnh hưởng rất quan trọng đến hoạt tính kháng khuẩn của chúng

 Coumarine

Coumarine là hợp chất phenolic được tạo thành bởi benzene nóng chảy và vòng α-pyrone.Chúng có hoạt tính chống đông máu, chống viêm và giãn mạch máu Warfarin là một coumarin đặc biệt nổi tiếng khi sử dụng như chất chống đông máu

sử dụng theo đường miệng và đồng thời cũng được sử dụng để diệt động vật gặm nhấm

Hình 1.11 Cấu trúc hóa học của catechine

Nhiều dẫn chất coumarine có tác dụng kháng khuẩn đặc biệt là chất novobiocine là một chất kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng có trong nấm

Stretptomyces niveus Nó cũng có hoạt tính chống lại virus Coumarin được biết là

có độc tính cao vì thế cần được xử lí rất cẩn thẩn bởi y tế cộng đồng Một vài coumarine khác cũng có hoạt tính chống lại vi sinh vật và có khả năng ức chế nấm

Candida albicans (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010)

 Tannin

Một trong những tính chất rất đặc trưng của tannin là tạo phức với các protein thông qua các liên kết không đặc hiệu như liên kết hydro và các liên kết cộng hóa trị Khi liên kết với protein chúng có thể làm mất hoạt tính của các protein chức năng Các protein này có thể là enzyme, các protein vận chuyển hay thành tế bào polypeptide…

Scalbert xem xét lại các tính chất kháng khuẩn của tannin vào năm 1991 Ông đưa ra 33 nghiên cứu ghi nhận tính kháng khuẩn của tannin.Theo các nghiên cứu này, tannin có thể ức chế sự phát triển của nấm sợi, nấm men và các vi khuẩn Tính kháng khuẩn của tannin được tăng cường bởi tia cực tím (UV) ởmức ánh sáng kích hoạt bước sóng khoảng 320 đến 400 nm Ngoài ra, có ít nhất hai nghiên cứu đã chỉ

ra rằng tannin có thể ức chế virus nhờ cơ chế đảo ngược quá trình phiên mã DNA

của virus

1.4.3.2 Nhóm alkaloid

 Solamargine

Solamargine là một glycoalkaloid kháng khuẩn tốt nhất đối với 2 nhóm

Giardia và Entamoeba, chúng liên quan trực tiếp đến việc kháng khuẩn đối với các

Hình 1.12 Cấu trúc hóa học của coumarine

vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy Thường có trong các cây quả mọng họ cà (Solanum

khasianum) và các alkaloid khác trong loài cây này có tác dụng chống lại sự lây

nhiễm khi đã mắc phải HIV

 Berberine

Berberine là một đại diện quan trọng của alkaloid có trong các cây: hoàng

đằng, hoàng bá, hoàng liên… có tác dụng kháng khuẩn rộng đối với Shigella spp.,

Staphylococcus spp (tụ cầu khuẩn), Vibrio spp., Streptococcus spp Những năm gần

đây, một số nghiên cứu mới nhất cho thấy berberine có tính kháng khuẩn với nhiều

vi khuẩn Gram dương, Gram âm và các vi khuẩn acid Ngoài ra, có còn chống lại một số nấm men gây bệnh và một số động vật nguyên sinh

Berberine kháng khuẩn hiệu quả đối với các nhóm vi khuẩn gây bệnh sốt rét

do berberine có khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn gây bệnh sốt rét, chính điều này mà tác dụng kháng khuẩn của Berberine khá mạnh đối với loại vi khuẩn gây bệnh này

Hình 1.13 Cấu trúc hóa học của phân tử Solamargine

Hình 1.14 Cấu trúc hóa học của berberine

1.4.3.3 Nhóm terpenoid và tinh dầu

Terpenene và terpenoid có hoạt tính kháng khuẩn đối với nấm, vi khuẩn, virus

và động vật nguyên sinh Năm 1977, có nghiên cứu cho rằng 60% các dẫn xuất của tinh dầu có khả năng ức chế nấm, trong khi khoảng 30% ức chế được vi khuẩn Đồng thời, các acid betulinic triterpenoid là một trong nhiều terpenoid có khả năng

ức chế được HIV Cơ chế tác động của tecpen chưa được khẳng định rõ ràng, nhưng được suy đoán là liên quan đến sự phá vỡ màng tế bào bởi các hợp chất lipophilic Các nhà khoa học cũng đã tìm thấy các terpenoid hiện diện trong các loại tinh

dầu thực vật có ích trong việc kiểm soátListeria monocytogene… Theo Mendoza,

việc tăng nhóm ưa nước (hydrophilicity) của kaurene diterpenoids thì làm giảm mạnh tính kháng khuẩn của chúng Các nhà khoa học thực phẩm cũng đã tìm thấy các terpenoids hiện diện trong các loại tinh dầu thực vật có ích trong việc kiểm soát

Listeria monocytogenes Dầu hung quế, một thảo dược được thương mại hóa, được

xác định là hiệu quả kháng khuẩn tương đương với 125 ppm clo khử trùng trong lá rau diếp (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010)

Thionin là peptide thường được tìm thấy trong lúa mạch và lúa mì, bao gồm

47 amino acid Chúng có khả năng ức chế nấm men, vi khuẩn Gram âm và Gram dương

Fabatin là một loại peptide có trong đậu fava, có cấu trúc liên quan tới

γ-thionins từ ngũ cốc và nó ức chế được E coli, P aeruginosa, và Enterococcus hirae nhưng lại không ức chế Candida hoặc Saccharomyces

1.4.4 Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thế giới và tại Việt Nam

1.4.4.1 Trên thế giới

- Năm 1858, nhà bác học Pháp Louis Pasteur đã chứng minh được công dụng diệt khuẩn của tỏi Năm 1944, nhà hóa học Chester J Cavallito đã phân tích được hợp chất Alicin trong tỏi có công dụng như thuốc kháng sinh Năm 1949, Dold và Knapp đã kiểm tra hoạt động kháng khuẩn của 27 chất chiết xuất từ thực vật chống

lại 8 chủng sinh vật thử nghiệm như: E coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhosa,

Shigella paradysenteria… và cho thấy tỏi có hoạt động chống lại tất cả các sinh vật

được kiểm tra Một nghiên cứu khác tại Brazil năm 1982 đã chứng minh, nước tinh chất từ tỏi có thể chữa được nhiều bệnh nhiễm độc bao tử, do thức ăn có lẫn vi

khuẩn, nhất là loại Salmonella spp (Fulder, 2005)

Năm 1959, Horak đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn từ chiết xuất cây

Cannabit sativa có nguồn gốc từ Ấn Độ, ông đã tìm thấy cannabiriolic là 1 chất có

tác dụng ức chế với vi khuẩn lao ở người và 1 số vi khuẩn gram dương như

Staphylococcus pyogenes aureus, Streptococcus alpha haemolyticus, Streptococcus beta haemolyticus, Enterococcus, Diplococcus pneumoniae, B.subtilis, B.anthracis, Corynebacterium diphtheriae và Corynebacterium cutis, đặc biệt có thể ức chế vi

khuẩn kháng lại penicilin (Kabelik và ctv, 1960)

Năm 1982, Ueda cũng đã thử nghiệm chất chiết xuất từ cây thuốc và gia vị bằng dung môi ethanol để ức chế vi khuẩn và nấm trong môi trường nuôi cấy tại pH khác nhau Đinh hương được nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn có thể chống lại tất

cả các sinh vật thử nghiệm bao gồm cả vi khuẩn B subtilis PCI, S.aureus 209P, E

coli, S typhimurium, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Proteus morganii

Năm 1997 tại Thái Lan, Satapon Direkbusarakom và ctv đã thử nghiệm thành

công khả năng kháng khuẩn của các loài cây thảo dược như: O.sanctum, C.alata,

Tinospora cordifolia, Eclipa alba, Tinospora cripspa, Psidium guajava, Clinacanhusnutans, Andrographic panniculata, Momordica charatina, Phyllanthus

reticulates, P.pulcher, P.acidus, P.debelis, P.amarus, và P.urinaria đối với Vibrio

spp Tuy nhiên, chỉ có hai cây Momordica charatina và Psidium guajava có hiệu quả ức chế đối với Vibrio spp

Năm 2000, nghiên cứu của Avancini CAM, Wiest JM, Mundstock EA cho kết

quả hoạt tính kháng khuẩn của “carqueja” (Baccharis trimera Less.) ức chế được nhóm vi khuẩn gram dương (S.aureus,Streptococcu uberis)và gram âm (Salmonella

gallinarumand, Escherichia coli)

Vào năm 2003, nhóm Candan và ctv đã nghiên cứu tinh dầu trong lá cỏ thi

(Achilleamillefolium) có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn mẫu cao được chiết từ

methanol Tinh dầu có thể ngăn chặn sự phát triển của các nhóm vi khuẩn

Streptococcus pneumoniae, Clostridium perfringes, nấm Candida albicans và ức

chế yếu hơn đối với Mycobacterium smegmatis, Acinetobacter lwoffiiand, Candida

krussei

Vào năm 2006, nghiên cứu của nhóm Asolini và ctv cho kết quả nhóm hợp chất phenolic tồn tại trong mẫu cao chiết ethanol có khả năng kháng khuẩn rất tốt

Mẫu dịch chiết từ atisô (Cynara scolymus) và mẫu cao ethanol (80%) của cả atisô

và “macela” (Achyrocline satureioides) ức chế sự phát triển của Bacillus cereus, B

subtilis, Pseudomonas aeruginosa và S aureus

Năm 2011, Naveed Ahmad và ctv đã nghiên cứu về sự chống oxi hóa và

kháng khuẩn của chiết xuất từ lá và hoa của cây Calotropis procera bằng nhiều loại

dung môi khác nhau Firdaus Jahan và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt động kháng

khuẩn của chiết xuất từ lá của cây Syzygium cumini (Jamun), Lawsonia

inermis(Mehndi), Zizyphus mauritiana (Ber), Ocimum sanctum (Tulsi) and Ficus religiosa (Peepal) chống lại Staphylococcus aureus

Chaghaby và ctv (2014) đã chứng minh các dịch chiết khác nhau từ lá cây

Annona Squamosa L đều có hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn gram dương

mạnh hơn gram âm Kết quả của ông được nghiên cứu dựa trên cơ sở khoa học của Chopra và Greenwood, cho rằng vi khuẩn gram âm ít bị ảnh hưởng nhiều bởi những chất có chiết xuất từ thực vật hơn so với vi khuẩn gram dương là do chúng có một

lớp màng ngoài bao gồm các lipoprotein và lipopolysaccharide Đó là lớp màng chọn lọc cho phép chúng có khả năng điều hòa lưu thông các chất ra vào bên trong

cơ cấu nội bào Mỗi một dịch chiết đều thể hiện khả năng kháng ít nhất 6/27 chủng

vi khuẩn chỉ thị, tuy nhiên hoạt tính kháng khuẩn ở những dịch chiết lên các chủng

vi sinh vật là khác nhau Sự khác nhau đó là do sự khác biệt giữa các hợp chất hóa

học có trong mỗi loại dịch chiết

1.4.4.2 Tại Việt Nam

Năm 1956, Phạm Văn Ngữ đã tiến hành nghiên cứu trên 500 cây thuốc và khẳng định nhiều cây có tác dụng kháng khuẩn mạnh Năm 1959, Nguyễn Văn Hưởng và ctv đã nghiên cứu trên 1000 cây thuốc và chỉ ra việc sử dụng những cây thuốc rất an toàn và có hoạt tính kháng khuẩn cao, từ đó nhóm đã đưa ra chế phẩm cây Tô Mộc trị tiêu chảy (Trần Nam Hà, 2008)

Năm 2007, Nguyễn Ngọc Phước và ctv đã tiến hành nghiên cứu sử dụng lá trầu không để trị bệnh do nấm, vi khuẩn gây ra trên đối tượng nuôi động vật thuỷ sản, bước đầu đã có kết quả tốt ở quy mô phòng thí nghiệm

Tác giả Đặng Xuân Cường (Đại học Nha Trang, 2009) đã nghiên cứu các phương pháp thu nhận dịch chiết có hoạt tính kháng khuẩn từ loài rong nâu

Dictyota dichotoma Việt Nam Tác giả cũng cho thấy dịch chiết thu nhận từ loài

rong nâu này có hoạt tính kháng khuẩn khá tốt và đã phân tích được các thành phần

có trong dịch chiết từ rong nâu Cùng năm 2009, Võ Thị Mai Hương đã nghiên cứu

về khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá Muồng trâu trên 5 nhóm vi khuẩn Vibrio spp., Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus và

cho kết quả kháng khuẩn cao hơn so với nghiên cứu tương tự vào năm 2002 của Elysha và ctv

Năm 2010, Phạm Văn Ngọt và ctv đã thông báo kết quả nghiên cứu khả năng

kháng khuẩn của loài Mộc kí ngũ hùng (Dendrophthoepentadra (L.) Miq.) thuộc họ

Tầm gửi

Năm 2011, Nguyễn Thị Thu Hương nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của

cao chiết từ tỏi (Allium Sativum) đối với một số vi khuẩn gây bệnh ở người

Năm 2012, tại Nha Trang, Lê Thị Hương Hà nghiên cứu tách chiết và khảo sát

hoạt tính kháng khuẩn – chống oxi hóa của cao dịch chiết từ củ hành tăm (Allium

schoenoprasum) trên các chủng vi khuẩn gây bệnh: Salmonella, E coli, S aureus, Pseudomonas, B subtilis, B cereus, Aspergillus, Penicillium

Võ Thị Mai Hương và Trần Thanh Phong (2013) đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn từ các loại dịch chiết ethanol, methanol và các phân đoạn n-Hexan, EtOAC, n-Butanol của methanol từ quả Nhàu và kết quả cho thấy các loại dung môi

trên đều cho hoạt tính kháng khuẩn cao với các vi khuẩn khảo sát Staphylococcus

aureus, Salmonella typhi, Escherichia coli, Bacillus pumilus

Năm 2014, Huỳnh Kim Diệu và Võ Thị Tuyết đã đánh giá sự thuần chủng và

hoạt tính kháng khuẩn của cây hẹ (Allium tuberosum Roxb et Spreng) trên 8 chủng

vi khuẩn: Staphylococus aureus, Streptococcus faecalis, Escherichia coli,

Aeromonas hydrophila, Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella tarda, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp Kết quả nghiên cứu cao hẹ có khả năng ức chế trên tất

cả các chủng vi khuẩn thí nghiệm (512 µg/ml ≤ MIC ≤ 4096 µg/ml)

1.4.5 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

1.4.5.1 Khái niệm

Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum inhibitory concentration (MIC)) là nồng

độ thấp nhất của chất kháng khuẩn (hoặc kháng sinh) có khả năng ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật sau khoảng 24 giờ nuôi cấy

Khi cho vi khuẩn tiếp xúc với chất kháng khuẩn (hoặc kháng sinh) ở các liều lượng nồng độ khác nhau, vi khuẩn bị ức chế hoặc bị tiêu diệt Một số vi khuẩn có thể nhạy cảm với một ít hoặc với rất nhiều chất kháng khuẩn (hoặc kháng sinh) Chỉ số MIC có tác dụng là tiêu chuẩn so sánh để lựa chọn chất kháng khuẩn (hoặc kháng sinh) phù hợp với từng loại vi khuẩn gây bệnh Việc loại trừ sạch vi khuẩn có thể dự đoán dựa vào dữ liệu MIC và MBC, đồng thời xác định được nồng độ tối ưu

để làm chậm sự chọn lọc vi khuẩn kháng thuốc

1.4.5.2 Phương pháp xác định

Tùy theo phương pháp áp dụng mà có nhiều cách xác định chỉ số MIC khác nhau Các phương pháp phổ biến như: phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch, phương pháp pha loãng, phương pháp đặt khoanh giấy…

Sau đó ta có thể xác định nồng độ kháng sinh thấp nhất ức chế hoàn toàn sự tăng trưởng của vi khuẩn bằng cách quan sát với mắt thường

1.5 Ảnh hưởng của dung môi đến khả năng tách chiết cao từ thực vật

Tách chiết bằng dung môi là quá trình di chuyển vật chất trong hệ hai pha rắn

- lỏng Quá trình này sẽ sử dụng một số dung môi thích hợp để hoà tan các hợp chất tan có trong thực vật, sau đó tách chúng ra khỏi phần không tan Phần dung môi hoà tan các chất tan được gọi là dịch chiết, phần không tan được gọi là bã thực vật Dung môi sẽ được loại khỏi dịch chiết bằng nhiều phương pháp và sau đó tiến hành thu hồi lượng cao có chứa nhiều hợp chất khác nhau của mẫu thực vật

Dựa vào tính phân cực của dung môi và của các nhóm hợp chất ta có thể dự đoán sự có mặt của các chất trong mỗi phân đoạn ly trích, từ đó lựa chọn dung môi tách chiết thích hợp:

- Trong dịch chiết ete và ete dầu hỏa sẽ có các thành phần của tinh dầu như monoterpen, các chất không phân cực như chất béo, carotene, các sterol, các chất màu thực vật, chlorophyl…

- Trong dịch chiết nước sẽ có các glycoside, tannin…

- Trong dịch chiết chloroform sẽ có mặt quinone, các aglycol do glycoside thủy phân, sesquiterpen, diterpen…

- Methanol và ethanol là những dung môi phân cực hơn các hydrocacbon thế clo Người ta cho rằng dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào, hòa tan được các chất không phân cực đồng thời cũng có khả năng tạo dây nối hydro với các nhóm phân cực khác, nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn thành phần các hợp chất tự nhiên

 Yêu cầu đối với dung môi:

- Dễ thấm vào dược liệu: dung môi có độ nhớt thấp, sức căng bề mặt nhỏ

- Hoà tan nhiều hoạt chất, ít tạp chất

- Có tính trơ về mặt hoá học: không làm biến đổi hoạt chất, không gây khó khăn trong quá trình bảo quản, không bị phân huỷ bởi nhiệt độ cao

- Dễ dàng được loại bỏ, phải bay hơi được khi cần cô đặc dịch chiết

- Không làm cao có mùi đặc biệt, khó chịu

- Cần có độ tinh khiết nhất định để không làm ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết cao

- Rẻ tiền, dễ kiếm

1.6 Tổng quan về một số nhóm vi khuẩn gây bệnh

1.6.1 Nhóm vi khuẩn Escherichia coli

1.6.1.1 Đặc điểm hình thái

E.coli là trực khuẩn Gram âm, hình que thẳng Kích thước dài, ngắn khác nhau

trung bình từ 2 – 3 µm, rộng 0,5 µm; trong những điều kiện nuôi cấy không thích hợp (ví dụ trong môi trường có kháng sinh) trực khuẩn có thể rất dài (6 – 8 µm)

Rất ít chủng E.coli có vỏ, không sinh bào tử, hầu hết có lông và có khả năng di

động (Bùi Thị Hải Hòa, 2012)

Trực khuẩn E coli hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, có thể phát triển ở nhiệt độ từ

150C – 400C, phát triển thích hợp ở nhiệt độ 370C với pH = 7,2 –7,4; phát triển được

ở pH = 5,5 – 8,0 (Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997)

Trong môi trường lỏng, sau 4 – 5 giờ, E coli đã làm đục nhẹ môi trường, càng

để lâu càng đục nhiều và sau vài ngày có thể có váng mỏng trên mặt môi trường, để lâu vi khuẩn lắng xuống đáy ống

Trên môi trường thạch thường, sau 18 – 24 giờ, khuẩn lạc tròn, bờ đều, bóng, không màu hay màu xám nhẹ, đường kính 2 – 3 mm