Nghiên cứu vi tảo biển dị dưỡng thraustchytrids ở rừng ngập mặn xuân thủy, nam định

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Đình Tuấn NGHIÊN CỨU VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG thraustochytrids Ở RỪNG NGẬP MẶN XUÂN THỦY, NAM ĐỊNH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Đình Tuấn NGHIÊN CỨU VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG thraustochytrids Ở RỪNG NGẬP MẶN XUÂN THỦY, NAM ĐỊNH Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Hoài Hà TS Phạm Thế Hải Hà Nội – 2017 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Hoài Hà, TS Phạm Thế Hải người Thầy, Cơ tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên Tơi suốt q trình thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn đóng góp quý báu cho luận văn ThS Phạm Thị Bích Đào, TS Trần Văn Tuấn, ThS Nguyễn Thị Khuyến Xin cảm ơn Thầy, Cô, Anh, Chị, Em Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học, tổ Bộ môn Vi sinh vật học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội hết lòng giúp đỡ, tạo điều kiện để Tôi thực nghiên cứu Xin cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp quan tâm động viên, giúp đỡ Tơi hồn thành luận văn Hà Nội, ngày 25 tháng năm 2017 Học viên Nguyễn Đình Tuấn DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết đầy đủ Chữ viết tắt DHA Docosahexaenoic Axit DPA Docopentaenoic Axit EPA Eicosapentaenoic Axit FAS Fatty Axit synthase – Tổng hợp axit béo MUFA Monounsanturated fatty Axit - Axit béo không no nối đôi GPY Glucose – Peptone – Cao nấm men (Yeast extract) PUFA Polyunsanturated fatty Axit - Axit béo không no đa nối đôi TLK Tổng lượng khô VTBDD Vi tảo biển dị dưỡng ω-3 Omega-3 ω-6 Omega-6 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây phả hệ thraustochytrid dựa trình tự gen 18S rRNA thu từ nghiên cứu trước [10, 14] Hình 1.2 Đặc điểm hình thái dạng tế bào họ thraustochytrid .11 Hình 1.3 Chu kỳ sinh trưởng chi họ thraustochytrid [15] .12 Hình 1.4 Tổng hợp axit béo bão hòa thơng qua đường FAS [18] 16 Hình 1.5 Tổng hợp DHA trình kéo dài chuỗi khử bão hòa [19] 18 Hình 1.6 Con đường sinh tổng hợp axit béo polyketide 20 Hình 2.1 Các vị trí thu mẫu Rừng ngập mặn Xuân Thủy …………………… 25 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc 10 chủng thraustochytrid đĩa thạch GPY sau 72h nuôi cấy (thanh kích thước 5mm)…………………………………………… 35 Hình 3.2 Hình thái tế bào chủng PT-268 (thanh kích thước 10 µm) (A) Tản trưởng thành; (B) Túi bào tử với phân chia hướng tâm động bào tử; (C) Giải phóng động bào tử; (D) Tế bào sinh dưỡng; (E) Động bào tử hai roi 36 Hình 3.3 Hình thái tế bào chủng PT-271 (thanh kích thước 10 µm) (A, B, C) Sự thay đổi hình dạng tế bào dạng amip; (D, E, F) Túi bào tử .37 Hình 3.4 Hình thái tế bào chủng PT-272 (thanh kích thước 10 µm) (A) Tản trưởng thành; (B,C) Túi bào tử; (D) Tản chưa trưởng thành .37 Hình 3.5 Hình thái tế bào chủng PT-277 (thanh kích thước 10 µm) (A) Tản chưa trưởng thành; (B) Túi động bào tử; (C) Thay đổi hình dạng tế bào dạng amip; (D) Các cấu trúc giống động bào tử giải phóng .38 Hình 3.6 Hình thái tế bào chủng PT-278 (thanh kích thước 10 µm) (A) Tản chưa trưởng thành; (B, C) Túi động bào tử; (D) Tế bào dạng amip; (E) Thay đổi hình dạng tế bào dạng amip 39 Hình 3.7 Hình thái tế bào chủng PT-279 (thanh kích thước 10 µm) (A) Nang bào tử; (B) Tản chưa trưởng thành; (C) Túi động bào tử; (D) Thay đổi hình dạng tế bào dạng amip; (E) Giải phóng động bào tử 39 Hình 3.8 Hình dạng tế bào chủng PT-280 (thanh kích thước 10 µm) (A) Túi bào tử; (B) Sự phân cắt hướng tâm động bào tử nguyên phát từ túi động bào tử; (C) Tế bào dạng amip 40 Hình 3.9 Hình dạng tế bào chủng PT-281 (thanh kích thước 10 µm) (A) Thay đổi hình dạng tế bào dạng amip; (B) Sự vê tròn tế bào dạng amip; (C) Sự giải phóng cấu trúc dạng động bào tử 40 Hình 3.10 Hình thái tế bào chủng PT-283 (thanh kích thước 10 µm) (A) Tản trưởng thành với hạt tế bào; (B, C, D) Túi bào tử 41 Hình 3.11 Hình dạng tế bào chủng PT-286 (thanh kích thước 10 µm) (A, B) Tản; (C) Túi bào tử 41 Hình 3.12 Cây phả hệ chủng đại diện PT-268 dựa trình tự gen 18S rRNA chủng có mối quan hệ gần 43 Hình 3.13 Tỷ lệ % tổng số axit béo no (SFA), axit béo không no nối đôi (MUFA) axit béo không no đa nối đôi (PUFA) mười VTBDD thraustochytrid 46 Hình 3.14 So sánh thành phần axit béo không no đa nối đôi mười VTBDD thraustochytrid 50 Hình 3.15 Tỷ lệ % axit béo EPA, DPA so với tổng số axit béo (TFA) mười VTBDD thraustochytrid .51 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Các chủng phân lập đặc điểm vị trí thu mẫu .31 Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 10 chủng Thraustochytrid 72 32 Bảng 3.3 Hình thái tế bào mười chủng thraustochytrid 37 Bảng 3.4 So sánh trọng lượng khô % TFA 10 chủng nghiên cứu với số chủng thraustochytrid khác công bố 45 Bảng 3.5 Thành phần axit béo 10 VTBDD Thraustochytrid 48 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh trưởng Lipit tổng số mười VTBDD thraustochytrid 52 Bảng 3.7 Ảnh hưởng nguồn nitrogen đến sinh trưởng Lipit tổng số mười VTBDD thraustochytrid 54 MỤC LỤC Chương - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu vi tảo biển dị dưỡng thraustochytrid 1.1.1 Vị trí phân loại VTBDD thraustochytrid 1.1.2 Đặc điểm sinh học VTBDD thraustochytrid 10 1.1.2.1 Đặc điểm tế bào 10 1.1.2.2 Chu kỳ sinh trưởng 12 1.1.3 Vai trò thraustochytrid hệ sinh thái 13 1.2 Axit béo VTBDD thraustochytrid 15 1.2.1 Tổng hợp axit béo đường FAS (Fatty Axit Synthase) 15 1.2.2 Tổng hợp axit béo đường PKS (polyketide synthase) 18 1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng sản xuất PUFA 22 1.3.1 Dinh dưỡng 22 1.3.1.1 Nguồn Cacbon 22 1.3.1.2 Nguồn Nitơ 23 1.3.2 Hệ thống nuôi cấy 23 1.3.3 Pha sinh trưởng 24 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25 2.1 Vật liệu nghiên cứu 25 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 25 Môi trường nuôi cấy 25 2.1.2 2.2 Hóa chất thiết bị 26 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Phương pháp thu mẫu chuẩn bị mẫu 26 2.2.2 Phương pháp phân lập 27 2.2.2.1 Phân lập micropipette 27 2.2.2.2 Kiểm tra khiết giống đĩa thạch 27 2.2.3 Phương pháp phân loại hình thái học 27 2.2.4 Phương pháp phân tích trình tự gen 27 2.2.4.1 Tách chiết DNA 27 2.2.4.2 Giải trình tự gen 18S 28 2.2.5 Phân tích thành phần axit béo 29 2.2.5.1 Phân tích Lipit tổng số 29 2.2.5.2 Xác định thành phần axit béo sắc ký khí 29 Thành phần axit béo sắc ký khí theo tiêu chuẩn ISO/FDIS 5590:1998, LB Đức 29 2.2.6 Ảnh hưởng nguồn cacbon nitơ đến sinh trưởng tổng hợp Lipit 30 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Đặc điểm mười chủng VTBDD Thraustochytrid phân lập từ RNM Xuân Thủy 31 3.1.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 32 3.1.2 Đặc điểm hình thái tế bào 10 chủng thraustochytrid 35 3.2 Phân tích trình tự gen 18S 31 3.3 Thành phần axit béo mười VTBDD thraustochytrid 44 3.4 Ảnh hưởng nguồn cacbon nitơ đến sinh trưởng tổng hợp Lipit 51 3.4.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon 51 3.4.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 MỞ ĐẦU Việt Nam có 3200 km bờ biển vùng rừng ngập mặn ven biển, vườn quốc gia Xuân Thủy khu rừng ngập mặn thuộc khu dự trữ sinh châu thổ sông Hồng Đây rừng ngập mặn Việt Nam quốc tế công nhận theo công ước Ramsar, rừng ngập mặn thứ 50 giới Với nguồn sinh vật biển nhiệt đới đa dạng phong phú thành phần loài giàu hợp chất tự nhiên ứng dụng công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, y dược… Trong lồi vi tảo biển dị dưỡng nguồn sinh khối sơ cấp quan trọng chuỗi thức ăn biển đồng thời chúng chứa nhiều hợp chất quan trọng cho người động vật nuôi như: loại sắc tố, vitamin, khoáng chất, protein, Lipit… đặc biệt loại axit béo không no đa nối đôi PUFA (polyunsaturated fatty axit) Trong năm gần đây, vi tảo biển dị dưỡng (VTBDD) thu hút quan tâm nhà khoa học doanh nghiệp Sự quan tâm có sở lồi vi tảo biển dị dưỡng chứa nhiều axit béo không no cần thiết PUFA Thraustochytrid nhóm sinh vật có khả tạo Axit béo không no omega-3, Axit docosahexaenoic (DHA), astaxanthin, carotenoids, docopentaenoic Axit omega-6 (DPA), chất có vai trò quan trọng sức khỏe người nuôi trồng thủy sản (NTTS) Bên cạnh đó, nhiên liệu sinh học chủ yếu có nguồn gốc từ thực vật động vật Nguồn nguyên liệu làm cho chi phí sản xuất cao, tốn lượng Thraustochytrid tạo hàm lượng lớn Axit béo không no, điều làm cho thraustochytrid trở thành đối tượng tiềm sản xuất dầu diesel sinh học Tập trung sản xuất dầu diesel sinh học từ thraustochytrid cho hiệu kinh tế cao hơn, thân thiện với môi trường giảm leo thang chi phí nhiên liệu nhu cầu sử dụng ngày tăng Ngồi ra, VTBDD có khả sinh trưởng nhanh, dễ dàng trì điều kiện ni cấy tối ưu, không bị ảnh hưởng mùa vụ khí hậu, kiểm sốt q trình sản xuất chất lượng sản phẩm Trên giới, vài năm gần đây, loài VTBDD thuộc chi Thraustochytrium, Schizochytrium, dạng khác đường tổng hợp axit béo (Fatty Axit Synthase-FAS) trình kéo dài khử bão hòa Năm 2001 đường tổng hợp thay mô tả Metz cộng gọi đường sinh tổng hợp polyketide (Polyketide Synthase-PKS) Lượng lớn axit béo tổng số PUFA sản xuất thraustochytrid làm cho thraustochytrid trở thành mơ hình lý tưởng để nghiên cứu chế sinh tổng hợp Lipit Theo quan điểm hai giải thích trình tổng hợp sản xuất PUFA, 10 VTBDD chọn mơ hình, hàm lượng cao DPA có PUFA khác phong phú Hình 3.15 Tỷ lệ % axit béo EPA, DPA so với tổng số axit béo (TFA) mười VTBDD thraustochytrid 3.4 Ảnh hưởng nguồn cacbon nitơ đến sinh trưởng tổng hợp Lipit 3.4.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon Với hình thức dinh dưỡng dị dưỡng hóa năng, VTBDD thraustochytrid sử dụng nhiều loại hợp chất hữu cung cấp cacbon trình sinh trưởng nguồn cung cấp lượng Kết trình bày bảng 3.6 51 Trong số bốn nguồn cacbon khác nhau, mười VTBDD cho tỷ lệ sinh trưởng cao bổ sung nguồn cacbon glucose fructose với trọng lượng khô thu sau 72 nuôi đạt từ 9,00 – 18,48 g/l Trọng lượng khô thu cao môi trường sử dụng nguồn cacbon glucose đạt 13; 11,44; 17,68; 18,48; 15,15; 15,36 g/l tương ứng với chủng PT- 271, PT-272, PT-277, PT-278, PT-280, PT-283 Trong đó, với chủng PT-268, PT-279, PT-281, PT-286 lại sinh trưởng tốt sử dụng nguồn cacbon fructose, trọng lượng khô 15,48; 11,52; 17,88; 12,84 g/l Bảng 3.6 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh trưởng Lipit tổng số mười VTBDD thraustochytrid Nguồn Cacbon 2% Glucose Fructose Mantose Chủng TLK (g/l) Lipit tổng số (%TLK) TLK (g/l) Lipit tổng số (%TLK) TLK (g/l) Lipit tổng số (%TLK) Lactose TLK (g/l) Lipit tổng số (%TLK) PT-268 14,56 12,35 15,48 9,30 7,25 4,68 2,00 1,01 PT-271 13,00 8,80 9,00 8,33 6,20 3,75 2,00 2,40 PT-272 11,44 9,62 8,16 9,19 3,80 6,91 2,10 2,86 PT-277 17,68 11,48 9,12 9,21 2,10 3,57 6,10 1,48 PT-278 18,48 10,53 10,50 10,83 3,35 2,57 2,80 6,43 PT-279 10,92 11,90 11,52 9,38 4,80 6,25 3,14 4,30 PT-280 15,15 8,07 9,04 2,12 2,10 9,52 2,73 4,35 PT-281 10,40 7,00 17,88 4,70 1,90 2,95 2,00 3,50 PT-283 15,36 9,47 12,24 9,80 5,40 1,56 2,50 5,00 PT-286 10,92 11,67 12,84 5,14 3,10 3,16 4,70 1,06 52 Mantose lactose hai nguồn cacbon nghèo cho sinh trưởng mười chủng VTBDD Trọng lượng khô thu giảm 2-8 lần so với môi trường bổ sung nguồn cacbon glucose fructose Trên nguồn cacbon mantose, trọng lượng khô cao thu chủng PT-268 7,25 g/l Với chủng PT-281 đạt lượng thấp 1,9 g/l Trọng lượng khô thu bổ sung nguồn cacbon lactose PT-277 6,1 g/l; thraustochytrid PT-286 4,7 g/l, tám chủng VTBDD lại đạt khoảng - g/l Lipit tổng số tăng dần sử dụng nguồn cacbon lactose, mantose, fructose glucose Tỷ lệ dao động khoảng 1,01 – 12,35% TLK Khả sinh tổng hợp Lipit môi trường bổ sung nguồn glucose chủng PT-268, PT- 277, PT-278, PT-279, PT-286 tương ứng 12,35, 11,48, 10,53, 11,9 11,67% TLK Từ kết thu cho thấy với nguồn cacbon mantose, lactose tốc độ sinh trưởng thấp, khả tổng hợp Lipit không cao, đạt 2-6% TLK Hai chủng PT-268, PT-286 sử dụng nguồn cacbon lactose đạt 1,01 1,06% TLK 3.4.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ Ngồi bổ sung nguồn cacbon khả sinh trưởng tổng hợp Lipit VTBDD chịu ảnh hưởng nguồn nitơ Kết thể bảng 3.7 Với nguồn nitơ ban đầu cao nấm men, tốc độ sinh trưởng khả sinh Lipit cao so với nguồn nitơ khác Lipit tổng số đạt 18,87%; 17,48% TLK với hai chủng PT-279, PT-272 Trọng lượng khô mười VTBDD tương đối cao, khoảng từ 9,01 đến 15,9 g/l Trong với nguồn nitơ thay pepton tốc độ sinh trưởng giảm 0,5 – lần so với nguồn nitơ cao nấm men, Lipit tổng số sau tách chiết thu chủng PT-286 đạt 18,03% TLK Các chủng PT-271, PT-272, PT-277, PT-278, PT-281 PT-283, Lipit tổng số sau tách chiết 14,15; 15,81; 16,90; 14,31; 13,24 14,63% TLK Kết cho thấy tốc độ sinh trưởng Lipit tổng số với nguồn nitơ hữu tốt so với nguồn nitơ vô Chủng PT-286 bổ sung nitơ NaNO3, KNO3 hàm lượng Lipit khơng có chênh lệch nhiều, 4,6% 5,5% TLK Điều đáng ý là, nuôi VTBDD nguồn nitơ (NH4)2SO4 cho hàm lượng Lipit thấp 53 đạt 1,05% Với VTBDD chủng PT-280, bổ sung nguồn nitơ từ KNO3 cho hàm lượng Lipit thấp (1,21%) Nuôi VTBDD nguồn nitơ khác (NH4)2SO4, NaNO3 cho hàm lượng Lipit có lênh lệch khơng đáng kể (6,45% 6% TLK) Bảng 3.7 Ảnh hưởng nguồn nitrogen đến sinh trưởng Lipit tổng số mười VTBDD thraustochytrid Nguồn Nitơ 1% Cao nấm men Chủng TLK (g/l) Lipit tổng số (%TLK) Peptone TLK (g/l) Lipit tổng số (%TLK) (NH4)2SO4 TLK (g/l) Lipit tổng số (%TLK) KNO3 TLK (g/l) Lipit tổng số (%TLK) NaNO3 TLK (g/l) Lipit tổng số (%TLK) PT-268 13,95 12,79 12,67 5,36 6,08 1,05 5,00 5,50 11,1 4,60 PT-271 15,90 11,79 7,00 14,15 5,70 3,18 4,50 8,56 2,46 3,00 PT-272 15,45 17,48 10,61 15,81 5,40 3,70 5,30 2,83 4,02 1,44 PT-277 13,35 14,61 8,34 16,90 2,57 5,60 4,30 4,65 4,30 3,63 PT-278 10,54 11,29 7,73 14,31 8,64 3,24 2,70 4,63 5,20 6,00 PT-279 9,01 18,87 7,11 6,96 3,50 9,20 3,20 6,25 4,80 5,83 PT-280 13,50 11,11 7,52 6,85 6,20 6,45 3,50 1,21 3,70 6,00 PT-281 12,60 11,90 8,76 13,24 6,40 5,47 3,70 2,16 6,80 7,35 PT-283 15,75 8,57 8,45 14,63 3,80 7,89 2,70 2,04 6,60 4,61 PT-286 10,35 10,14 6,28 18,03 7,07 5,45 2,80 3,57 2,60 6,46 Từ kết nghiên cứu cho thấy bổ sung cao nấm men nguồn nitơ thích hợp cho VTBDD Những kết hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu Shene et al (2010), nuôi VTBDD nguồn nitơ hữu cao nấm men khả sinh Lipit cao nguồn nitơ vô 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã phân lập 10 chủng VTBDD từ mẫu rụng vị trí khác vùng đệm vùng lõi quanh RNM Xuân Thủy, Nam Định Với đặc điểm hình thái khác hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào Kết phân tích trình tự gen 18S rRNA 10 chủng cho thấy có hai loại khác cho gen 18S rRNA gen chủng thraustochytrid phân lập được, cho thấy chủng thraustochytrid nghiên cứu thuộc nhóm giống lai hai lồi vi tảo Phân tích chủng đại diện (PT-268) cho thấy có hai loại trình tự khác cho gen 18S rRNA có gen chủng VTBDD Những loại trình tự rRNA 18S (loại loại 2) có liên quan chặt chẽ với hai lồi Aurantiochytrium khác Sự sinh trưởng mười VTBDD đạt cao sử dụng nguồn cacbon glucose, trọng lượng khô thu sau 72 nuôi đạt từ đến 18,48 g/l Lipit tổng số – 12,35% TLK Và nguồn nitơ cao nấm men, trọng lượng khô mười chủng VTBDD đạt từ 9,01 đến 15,9 g/l, Lipit tổng số khoảng 8,57-18,87% TLK Cả mười chủng VTBDD có khả sinh tổng hợp lượng lớn DPA (20,22-39,35% TFA) EPA (0,2-1,95% TFA) Kiến nghị Thực kỹ thuật lai DNA Southerm blot phân tích để xác minh giả thiết tồn giống lai hai loài VTBDD khác Tối ưu nuôi cấy chủng VTBDD thraustochytrid hệ thống lên men quy mô lớn nhằm ứng dụng chủng thraustochytrid nuôi trồng hải sản sản xuất PUFA, DHA đại trà 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO Abulencia C B., Wyborski D L., Garcia J a, Podar M., Chen W., et al (2012) “Biosynthesis of Polyketides in Heterologous Hosts,” Appl Environ Microbiol., vol 65, no 1, pp 106–118 Arafiles K H V., Alcantara J C O., Batoon J a L (2011) “Cultural optimization of thraustochytrids for biomass and fatty acid production,” Mycosphere, vol 2, no 5, pp 521–531 Barclay W R., Meager K M., Abril J R (1994) “Heterotrophic production of long chain omega-3 fatty acids utilizing algae and algae-like microorganisms,” J Appl Phycol., vol 6, no 2, pp 123–129 Beakes G W., Honda D., Thines M (2006) “Systematics of the Straminipila: Labyrinthulomycota, Hyphochytriomycota, and Oomycota,” in THE MYCOTA: A Comprehensive Treatise on Fungi as Experimental Systems for Basic and Applied Research, Second., Esser, K., D J McLaughlin, and J W Spatafora, Eds Springer, 2006, pp 39–99 Beser J., Hagblom P., Fernandez V (2007) “Frequent in vitro recombination in internal transcribed spacers and during genotyping of Pneumocystis jirovecii,” J Clin Microbiol., vol 45, no 3, pp 881–886 Blight E G., Dyer W J (1959) “Canadian Journal of Biochemistry and Physiology,” Can J Biochem Physiol, vol 37 Bongiorni L (2012) “Thraustochytrids, a neglected component of organic matter decomposition and food webs in marine sediments,” Prog Mol Subcell Biol., vol 53, no 53, pp 1–13 Bongiorni L., Jain R., Raghukumar S., Aggarwal R K (2005) “Thraustochytrium gaertnerium sp nov.: A new thraustochytrid stramenopilan protist from mangroves of Goa, India,” Protist, vol 156, no 3, pp 303–315 Bongiorni L., Pusceddu A., Danovaro R (2005) “Enzymatic activities of 56 epiphytic and benthicthraustochytrids involved in organic matter degradation,” Aquat Microb Ecol., vol 41, no 41, pp 299–305 10 Bowles R D., Hunt A E., Bremer G B., Duchars M G., Eaton R A (1999) “Long-chain n - polyunsaturated fatty acid production by members of the marine protistan group the thraustochytrids: screening of isolates and optimisation of docosahexaenoic acid production,” Prog Ind Microbiol., vol 35, no C, pp 193–202 11 Bremer G B (1976) “The Ecology of Marine Lower Fungi,” Adv Aquat Mycol., pp 313–333 12 Burja A M., Radianingtyas H., Windust A., Barrow C J (2006) “Isolation and characterization of polyunsaturated fatty acid producing Thraustochytrium species: Screening of strains and optimization of omega-3 production,” Appl Microbiol Biotechnol., vol 72, no 6, pp 1161–1169 13 Coleman K., Robie J., June A (1987) “An epifluorescent microscopy study of enzymatic hydrolysis of fluorescein diacetate associated with the ectoplasmic net elements of the protist Thraustochytrium striatum,” Can J Microbiol, no Cmc, pp 2–4 14 Dick M (1973) “Saprolegniales In: Ainsworth GC, Sparrow EK, Sussman AS (eds) The fungi: an advanced treatise.,” Acad Press New York, vol 2, p 62 15 Facciotti D., Metz J G., Lassner M (2000) “Production of polyunsaturated fatty acids by expression of polyketide-like synthesis genes in plants,” 2000 16 Fan K W., Vrijmoed L L P., Jones E B G (2002) “Physiological Studies of Subtropical Mangrove Thraustochytrids,” vol 45, pp 50–57 17 Fan K W., Chen F (2007) “Production of High-Value Products by Marine Microalgae Thraustochytrids,” Bioprocess Value-Added Prod from Renew Resour., pp 293–323 18 Fawley M., Fawley K (2004) “a Simple and Rapid Technique for the Isolation of Dna From Microalgae1,” J Phycol., vol 225, no 40, pp 223– 57 225 19 Fell J W., Newell S Y (1998) “Biochemical and molecular methods for the study of marine fungi,” Mol Approaches to Study Ocean, no pp, pp 259– 283 20 Gaertner A (1977) “Revision of the Thraustochytriaceae (lower marine fungi) I Ulkenia nov gen., with description of three new species.,” Veröffentlichungen des Institutes für Meeresforsch Bremerhaven, vol 16, no 3, pp 139–157 21 Hasegawa M., Kishino H., Yano T (1985) “Dating the human-ape split by a molecular clock of mitochondrial DNA,” Evolution (N Y)., vol 22, no 2, pp 160–174 22 Hauvermale A., Kuner J., Rosenzweig B., Guerra D., Diltz S., et al (2006) “Fatty acid production in Schizochytrium sp.: Involvement of a polyunsaturated fatty acid synthase and a type I fatty acid synthase,” Lipids, vol 41, no 8, pp 739–747 23 Honda D., Yokochi T., Nakahara T., Raghukumar S., Nakagiri A., et al (1999) “Molecular phylogeny of labyrinthulids and thraustochytrids based on the sequencing of 18S ribosomal RNA gene.,” J Eukaryot Microbiol., vol 46, no 6, pp 637–647 24 Hopwood D A (1997) “Genetic Contributions to Understanding Polyketide Synthases,” Chem Rev., vol 97, no 7, pp 2465–2498 25 Iida I., Nakahara T., Yokochi T., Kamisaka Y., Yagi H., et al (1996) “Improvement of docosahexaenoic acid production in a culture of Thraustochytrium aureum by medium optimization,” J Ferment Bioeng., vol 81, no 1, pp 76–78 26 Kamlangdee N., Fan K W (2003) “Polyunsaturated fatty acids production by Schizochytrium sp isolated from mangrove,” Songklanakarin J Sci Technol, vol 25, no March 2003, pp 643–650 27 Kimura H., Fukuba T., Naganuma T (1999) “Biomass of thraustochytrid 58 protoctists in coastal water,” Mar Ecol Prog Ser., vol 189, no Schneider 1977, pp 27–33 28 Lambalot R H., Gehring A M., Flugel R S., Zuber P., LaCelle M., et al (1996) “A new enzyme superfamily — the phosphopantetheinyl transferases,” Chem Biol., vol 3, no 11, pp 923–936 29 Leander C (2001) “Phylogeny of the Labyrinthulomycota,” The University of Georgia, 2001 30 Lee Chang K J., Nichols C M., Blackburn S I., Dunstan G A., Koutoulis A., et al (2014) “Comparison of Thraustochytrids Aurantiochytrium sp., Schizochytrium sp., Thraustochytrium sp., and Ulkenia sp for Production of Biodiesel, Long-Chain Omega-3 Oils, and Exopolysaccharide,” Mar Biotechnol., vol 16, no 4, pp 396–411 31 Lewin R A (1959) “The isolation of algae,” Rev Algol, no 3, pp 181–197 32 López-García P., Rodriguez-Valera F., Pedrós-Alió C., Moreira D (2001) “Unexpected diversity of small eukaryotes in deep-sea Antarctic plankton,” Nature, vol 409, no 6820, pp 603–607 33 Metz J G., Metz J G., Roessler P., Facciotti D., Levering C., et al (2001) “Production of Polyunsaturated Fatty Acids by Polyketide Synthases in Both Prokaryotes and Eukaryotes,” Science (80- )., vol 290, no 5528, pp 290– 293 34 Moss S T (1991) “Thraustochytrids and other zoosporic marine fungi,” “The Biol Free Heterotrophic Flagellates”\nThe Syst Assoc., vol Special Vo, no Clarendon, Oxford, pp 415–425 35 Nagano N., Hayashi M (2011) “Detection of Genes Involved in Fatty Acid Elongation and Desaturation in Thraustochytrid Marine Eukaryotes,” vol 481, no 9, pp 475–481 36 Naganuma T., Miura S (1997) “Abundance, Production and Viability of Bacterioplankton in the Seto Inland Sea, Japan,” J Oceanogr., vol 53, no September 1995, pp 435–442 59 37 Naganuma T., Takasugi H., Kimura H (1998) “Abundance of thraustochytrids in coastal plankton,” Mar Ecol Prog Ser., vol 162, no Raghukumar 1992, pp 105–110 38 Nakai R., Naganuma T (2015) “Marine protists: Diversity and dynamics,” in Marine Protists: Diversity and Dynamics, 2015, pp 1–637 39 Porter D (1989) “Phylum Labyrinthulomycota In Handbook of protoctista Margulis L, Corliss JO, Melkonian M, and Chapman D (eds),” Boston, USA Jones Bartlett Publ., pp 388–398 40 Qiu X (2003) “Biosynthesis of docosahexaenoic acid (DHA, 22:6-4, 7,10,13,16,19): Two distinct pathways,” Prostaglandins Leukot Essent Fat Acids, vol 68, no 2, pp 181–186 41 Qiu X., Hong H., MacKenzie S L (2001) “Identification of a ??4 Fatty Acid Desaturase from Thraustochytrium sp Involved in the Biosynthesis of Docosahexanoic Acid by Heterologous Expression in Saccharomyces cerevisiae and Brassica juncea,” J Biol Chem., vol 276, no 34, pp 31561– 31566 42 Raghukumar S (2002) “Ecology of the marine protists, the labyrinthulomycetes (thraustochytrids and labyrinthulids),” Eur J Protistol., vol 38, no 2, pp 127–145 43 Raghukumar S (1988) “Schizochytrium mangrovei sp nov., a thraustochytrid from mangroves in India,” Trans Br Mycol Soc., vol 90, pp 627–631 44 Raghukumar S (1980) “Thraustochytrium benthicola sp.nov.: A new marine fungus from the north sea,” Trans Br Mycol Soc., vol 74, no 3, pp 607– 614 45 Raghukumar S (2008) “Thraustochytrid marine protists: Production of PUFAs and other emerging technologies,” Mar Biotechnol., vol 10, no 6, pp 631–640 46 Raghukumar S., Damare V S (2011) “Increasing evidence for the important role of Labyrinthulomycetes in marine ecosystems,” Bot Mar., vol 54, no 1, 60 pp 3–11 47 Raghukumar S., Schaumann K (1993) “An epifluorescence microscopy method for direct detection and enumeration of the fungilike marine protists, the thraustochytrids,” Limnol Ocean., vol 38, no 1, pp 182–187 48 Ren L J., Huang H., Xiao A H., Lian M., Jin L J., et al (2009) “Enhanced docosahexaenoic acid production by reinforcing acetyl-CoA and NADPH supply in Schizochytrium sp HX-308,” Bioprocess Biosyst Eng., vol 32, no 6, pp 837–843 49 Sakaguchi K., Matsuda T., Kobayashi T., Ohara J I., Hamaguchi R., et al (2012) “Versatile transformation system that is applicable to both multiple transgene expression and gene targeting for thraustochytrids,” Appl Environ Microbiol., vol 78, no 9, pp 3193–3202 50 Sathe-pathak V., Raghukumar C., Raghukumar S., Sharma S., Chandramohan D (1994) “Thraustochytrid and fungal component of marine detritus II Laboratory studies on decomposition of the brown alga Sargassum cinereum J Ag.,” J Exp Mar Bio Ecol., vol 175, no 2, pp 227–242 51 Singh A., Wilson S., Ward O P (1996) “Docosahexaenoic acid (DHA) production by Thraustochytrium sp ATCC 20892,” World J Microbiol Biotechnol., vol 12, no 1, pp 76–81 52 Sparrow F K (1936) “Biological Observations on the Marine Fungi of Woods Hole Waters,” Biol Bull., vol 70, no 2, p 236 53 Stokes N A., Ragone Calvo L M., Reece K S., Burreson E M (2002) “Molecular diagnostics, field validation, and phylogenetic analysis of Quahog Parasite Unknown (QPX), a pathogen of the hard clam Mercenaria mercenaria,” Dis Aquat Organ., vol 52, no 3, pp 233–247 54 Tran V T., Braus-Stromeyer S A., Timpner C., Braus G H (May 2013) “Molecular diagnosis to discriminate pathogen and apathogen species of the hybrid Verticillium longisporum on the oilseed crop Brassica napus,” Appl Microbiol Biotechnol., vol 97, no 10, pp 4467–4483 61 55 Voss A., Reinhart M., Sankarappa S., Sprecher H (1991) “The metabolism of 7,10,13,16,19-docosapentaenoic acid to 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid in rat liver is independent of a 4-desaturase,” J Biol Chem., vol 266, no 30, pp 19995–20000 56 Yazawa K (1996) “Production of eicosapentaenoic acid from marine bacteria,” Lipids, vol 31, no 1, pp S297–S300 57 Yokochi T., Honda D., Higashihara T., Nakahara T (1998) “Optimization of docosahexaenoic acid production by Schizochytrium limacinum SR21,” Appl Microbiol Biotechnol., vol 49, no 1, pp 72–76 58 Yokoyama R., Salleh B., Honda D (2007) “Taxonomic rearrangement of the genus Ulkenia sensu lato based on morphology, chemotaxonomical characteristics, and 18S rRNA gene phylogeny (Thraustochytriaceae, Labyrinthulomycetes): Emendation for Ulkenia and erection of Botryochytrium, Parietichytrium, ,” Mycoscience, vol 48, no 6, pp 329–341 59 Yu R., Yamada a, Watanabe K., Yazawa K., Takeyama H., et al (2000) “Production of eicosapentaenoic acid by a recombinant marine cyanobacterium, Synechococcus sp.,” Lipids, vol 35, no 10, pp 1061–1064 62 Phụ lục Phụ lục Hình ảnh quan sát mẫu kính lúp Carl Zeiss độ phóng đại 6,5x với T (tản) S (túi bao tử), Thanh kích thước: 10 µm 63 Phụ lục Sắc đồ từ giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR gen 18S rRNA nhân từ hệ gen mười chủng thraustochytrid Các mũi tên hướng trình tự xi ngược 64 Phụ lục Phân tích phát sinh chủng loại mười chủng thraustochytrid phân lập dựa phân trình tự DNA đọc (khoảng 600 bp) gen 18S rRNA thu từ việc giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR 65 ... 56 MỞ ĐẦU Vi t Nam có 3200 km bờ biển vùng rừng ngập mặn ven biển, vườn quốc gia Xuân Thủy khu rừng ngập mặn thuộc khu dự trữ sinh châu thổ sông Hồng Đây rừng ngập mặn Vi t Nam quốc tế... nhật nguồn gen vi tảo biển dị dưỡng thraustochytrid rừng ngập mặn khu vực nghiên cứu Chương - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu vi tảo biển dị dưỡng thraustochytrid Vi tảo biển dị dưỡng (VTBDD) thraustochytrid... KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Đình Tuấn NGHIÊN CỨU VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG thraustochytrids Ở RỪNG NGẬP MẶN XUÂN THỦY, NAM ĐỊNH Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC