Khảo sát khả năng kháng nấm nhiễm thực phẩm aspergillus niger và mucor sp của vi khuẩn lactobacillus sp l5

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM NHIỄM THỰC PHẨM ASPERGILLUS NIGER VÀ MUCOR SP CỦA VI KHUẨN LACTOBACILLUS SP.L5 Ngành: CÔNG NGHỆ INH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ INH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS N H Sinh viên thực : Phan Nguy n H MSSV: Lớp: 11DSH0 TP Hồ Chí Minh, H Thảo Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu tơi thực Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố nghiên cứu khác Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nghiên cứu Tp.Hồ Chí Minh, 8/2015 Sinh viên thực Phan Nguyễn Hương Thảo Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ gia đình bên cạnh, cổ vũ, động viên, quan tâm, chia sẻ, giúp em có thêm nghị lực gặp khó khăn suốt q trình học tập thực đồ án Em xin cảm ơn thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi trường trường Đại học Công Nghệ Tp.HCM quan tâm bảo, giảng dạy cung cấp kiến thức quý báu cho em suốt thời gian học tập trường Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn Nguyễn Hồi Hương tận tình giúp đỡ, hướng dẫn quan tâm theo dõi em suốt trình nghiên cứu thực đồ án tốt nghiệp Em xin cảm ơn quý thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học, khoa Cơng Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường trường Đại học Công Nghệ Tp.HCM tạo điều kiện tốt giúp em thực hoàn thành đồ án tốt nghiệp Tơi xin cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình cộng tất bạn làm việc phòng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học giúp đỡ tơi suốt q trình thực đồ án tốt nghiệp Tp Hồ Chí Minh, 8/2015 Sinh viên thực Đồ án tốt nghiệp Danh mục bảng iv Danh mục hình v MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nấm 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Độc tố nấm tiết 1.1.3 Tác hại nấm 1.1.3.1 Tác hại nấm gây cho người động vật 1.1.3.2 Tác hại nấm gây cho thực vật 1.1.4 Một số chủng nấm gây độc cho thực phẩm .7 1.2 Tổng quan vi khuẩn lactic .8 1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic 1.2.1.1 Giới thiệu chung .8 1.2.1.2 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus 10 1.2.1.3 Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn lactic 12 1.2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men - trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn lactic 14 1.2.2 Sản phẩm trao đổi chất ứng dụng vi khuẩn lactic 16 1.2.3 Khả kháng nấm chủng vi khuẩn lactic .18 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Địa điểm nghiên cứu 27 2.2 Thời gian thực 27 2.3 Vật liệu nghiên cứu 27 2.3.1 Giống vi sinh vật .27 i Đồ án tốt nghiệp 2.3.2 Hoá chất môi trường sử dụng .27 2.3.2.1 Hoá chất .27 2.3.2.2 Môi trường nuôi cấy 27 2.4 Thiết bị dụng cụ .28 2.4.1 Thiết bị 28 2.4.2 Dụng cụ 28 2.5 Phương pháp luận 28 2.6 Phương pháp nghiên cứu 29 2.6.1 Sơ đồ nghiên cứu 29 2.6.2 Thí nghiệm khảo sát lại đặc điểm ni cấy, hình thái khả lên men lactic chủng vi khuẩn lactic 31 2.6.3 Khảo sát khả đối kháng trực tiếp vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 nấm Aspergillus niger Mucor sp .33 2.6.4 Khảo sát khả đối kháng sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 nấm Aspergillus niger Mucor sp 35 2.6.5 Một số phương pháp khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hố 37 2.6.5.1 Nhuộm Gram 37 2.6.5.2 Nhuộm bào tử .37 2.6.5.3 Thử nghiệm khả lên men đường 37 2.6.5.4 Thử nghiệm khả sinh acid lactic 38 2.6.5.5 Xác định hàm lượng acid tổng .38 2.6.5.6 Thử nghiệm protease 39 2.6.5.7 Thử nghiệm chitinase 40 2.6.6 Ứng dụng vi khuẩn lactic kháng nấm đậu phộng 40 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 42 3.1 Định danh sơ khảo sát sinh lý – sinh hoá khiết chủng vi khuẩn lactic .42 3.1.1 Nhuộm Gram 42 ii Đồ án tốt nghiệp 3.1.2 Nhuộm bào tử 44 3.1.3 Thử nghiệm khả lên men đường khả sinh khí 45 3.1.4 Thử nghiệm khả sinh acid lactic 47 3.1.5 Xác định hàm lượng acid tổng 47 3.1.6 Thử nghiệm protease 49 3.1.7 Thử nghiệm chitinase 49 3.2 Khảo sát khả kháng nấm chủng vi khuẩn lactic 51 3.2.1 Khảo sát khả đối kháng trực tiếp chủng Lactobacillus sp.L5 nấm Aspergillus niger 52 3.2.2 Khảo sát khả đối kháng trực tiếp chủng Lactobacillus sp.L5 nấm Mucor sp 55 3.2.3 Khảo sát khả đối kháng sản phẩm trao đổi chất chủng Lactobacillus sp.L5 nấm Aspergillus niger 58 3.2.3.1 Không trung hoà 59 3.2.3.2 Trung hoà pH = 61 3.2.4 Khảo sát khả đối kháng sản phẩm trao đổi chất chủng Lactobacillus sp.L5 nấm Mucor 63 3.2.4.1 Khơng trung hồ 64 3.2.4.2 Trung hoà pH = 66 3.2.5 Thử nghiệm protease chitinase dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus sp.L5 không xử lý nhiệt xử lý nhiệt 68 3.2.5.1 Thử nghiệm protease 68 3.2.5.2 Thử nghiệm chitinase 70 3.3 Ứng dụng vi khuẩn lactic kháng nấm đậu phộng 71 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .76 TÀI LIỆU THAM KHẢO .78 iii Đồ án tốt nghiệp Danh mục bảng Bảng 1.1 Phân loại Lactobacillus (Sharpe 1981, Kandler Weiss, 1986) 12 Bảng 1.2 Một số hợp chất xác định có tiềm kháng nấm mốc nấm men (Corsetti cộng sự, 1998) .19 Bảng 1.3 Phân lập vi khuẩn lactic với khả ức chế độc tố sinh trưởng nấm mốc nấm men .21 Bảng 1.4 Các sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn lactic có tính kháng sinh (Holzapfel cộng sự, 1995) 22 Bảng 3.1 % acid lactic chủng khuẩn nuôi cấy 24 48 Bảng 3.2 Kết định danh sơ hai chủng vi khuẩn lactic 50 Bảng 3.3.Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus niger vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 53 Bảng 3.4.Tỉ lệ ức chế nấm Mucor vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 .56 Bảng 3.5.Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus niger canh trường nuôi cấy với dịch sau ly tâm khơng trung hồ chủng Lactobacillus sp.L5 khơng xử lý nhiệt xử lý nhiệt ngày 60 Bảng 3.6.Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus niger canh trường nuôi cấy với dịch sau ly tâm trung hồ chủng Lactobacillus sp.L5 khơng xử lý nhiệt xử lý nhiệt ngày .62 Bảng 3.7.Tỉ lệ ức chế nấm Mucor canh trường nuôi cấy với dịch sau ly tâm không trung hồ chủng Lactobacillus sp.L5 khơng xử lý nhiệt xử lý nhiệt ngày 65 Bảng 3.8.Tỉ lệ ức chế nấm Mucor canh trường nuôi cấy với dịch sau ly tâm trung hồ chủng Lactobacillus sp.L5 khơng xử lý nhiệt xử lý nhiệt ngày .67 Bảng 3.9.Khả kháng nấm canh trường nuôi cấy ứng dụng đậu phộng .71 Bảng 3.10.Khả kháng nấm huyền phù tế bào LAB ứng dụng đậu phộng 73 iv Đồ án tốt nghiệp Danh mục hình Hình 1.1 Hình dạng tế bào Lactobacillus 10 Hình 1.2 Sơ đồ tổng quát nghiên cứu khả kháng nấm vi khuẩn nói chung vi khuẩn lactic nói riêng .26 Hình 2.1.Sơ đồ tổng quát nghiên cứu khảo sát khả kháng nấm chủng Lactobacillus sp L5 30 Hình 2.2 Sơ đồ khẳng định chủng vi khuẩn lactic tính khiết chúng 31 Hình 2.3 Sơ đồ khảo sát khả kháng nấm chủng vi khuẩn lactic .33 Hình 2.4.Sơ đồ khảo sát kháng nấm sản phẩm trao đổi chất chủng vi khuẩn lactic 35 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic 42 Hình 3.2 Kết nhuộm gram chủng vi khuẩn 43 Hình 3.3 Kết nhuộm bào tử chủng vi khuẩn 44 Hình 3.4 Khả lên men đường vi khuẩn lactic 46 Hình 3.5 Khả sinh acid lactic chủng vi khuẩn 47 Hình 3.6 Đồ thị biểu % acid lactic chủng khuẩn sau 24 ni cấy .48 Hình 3.7 Thử nghiệm protease Chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 cho kết dương tính với đường kính D-d = 2,65 cm 49 Hình 3.8.Thử nghiệm chitinase Chủng Lactobacillus sp L5 cho kết dương tính với đường kính D-d = 3,15 cm .50 Hình 3.9.Khả ức chế nấm Aspergillus niger chủng Lactobacillus sp L5 ngày 52 Hình 3.10.Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus niger chủng Lactobacillus sp L5 theo độ pha loãng 54 Hình 3.11.Khả ức chế nấm Mucor chủng Lactobacillus sp L5 ngày 55 Hình 3.12 Tỉ lệ ức chế nấm Mucor chủng Lactobacillus sp.L5 theo độ pha loãng 57 Hình 3.13.Khả ức chế nấm Aspergillus niger dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 khơng trung hồ ngày (pH = 4,0) 59 v Đồ án tốt nghiệp Hình 3.14.Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus niger canh trường nuôi cấy dịch sau ly tâm khơng trung hồ chủng Lactobacillus sp L5 ngày 60 Hình 3.15.Khả ức chế nấm Aspergillus niger dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus sp.L5 trung hoà ngày (pH = 6,0) .61 Hình 3.16 So sánh tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus niger canh trường nuôi cấy dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 ngày 62 Hình 3.17.Khả ức chế nấm Mucor dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus sp.L5 không trung hoà ngày (pH = 4,0) 64 Hình 3.18.Tỉ lệ ức chế nấm Mucor canh trường nuôi cấy dịch sau ly tâm khơng trung hồ chủng Lactobacillus sp L5 ngày 65 Hình 3.19.Khả ức chế nấm Mucor dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 trung hoà pH = ngày 66 Hình 3.20 So sánh tỉ lệ ức chế nấm Mucor canh trường nuôi cấy dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus sp.L5 ngày 67 Hình 3.21.Thử nghiệm protease canh trường nuôi cấy dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 .69 Hình 3.22.Thử nghiệm chitinase canh trường nuôi cấy dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 70 Hình 3.23.Khả đối kháng nấm canh trường vi khuẩn lactic đậu phộng sau ủ 13 ngày 73 Hình 3.24.Khả đối kháng nấm huyền phù tế bào vi khuẩn lactic đậu phộng sau ủ 13 ngày .75 vi Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Ngày nay, với nhiều lĩnh vực khoa học phục vụ lợi ích người, cách mạng khoa học kỹ thuật đưa người bước vào văn minh đại Cùng với phát triển đó, người ngày quan tâm đến sức khoẻ Do đó, vấn đề an tồn thực phẩm lại trở nên cần thiết quan trọng Vệ sinh an tồn thực phẩm nước nói chung thực phẩm nói riêng vấn đề xã hội cần giải kịp thời để bảo vệ sức khoẻ người Theo thống kê hàng năm số ca ngộ độc thực phẩm tăng lên đáng kể bối cảnh xã hội phát triển, gây hoang mang cho người tiêu dùng Trong ngộ độc vi sinh vật chủ yếu nấm mốc chiếm phần lớn, bắt nguồn nhiễm từ nông sản, sản phẩm thực phẩm, Cuộc sống tất bật ngày vơ tình đưa người vào vòng quay sản phẩm đông lạnh, thức ăn nhanh mà hầu hết chúng bảo quản chất hoá học Hàng trăm loại hoá chất khác sử dụng cho mục đích bảo quản thực phẩm Tuy nhiên, có loại hoá chất bị nghiêm cấm sử dụng tính độc hại nó, chúng sử dụng trái phép gây hậu nghiêm trọng tới sức khoẻ người Trước thực trạng đó, người ln tìm kiếm sản phẩm vừa chăm sóc bảo vệ sức khoẻ, vừa dược phẩm để trị liệu số bệnh thời đại Trên quan điểm an toàn sinh học probiotics sản phẩm đáp ứng yêu cầu Probiotic vi sinh vật sống có tác dụng tốt cho sức khỏe người cân hệ sinh vật đường ruột Vi khuẩn dạng probiotic có hoạt tính sinh học cao, an tồn, có khả tiêu diệt vi sinh vật có hại nguồn vi sinh vật hữu ích, trì hệ cân vi khuẩn đường ruột Những nghiên cứu cho thấy bổ sung probiotic vào thực phẩm có tác dụng tốt cho sức khỏe giảm cholesterol máu, cải thiện hệ vi sinh vật hoạt động đường ruột, tăng hệ thống miễn dịch giảm nguy ung thư ruột kết, loại bỏ táo bón tiêu chảy Bảng D.7 Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus niger dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus sp.L5 (1 000 vòng/10 phút) trung hồ có xử lý nhiệt Tỉ lệ ức chế (%) Lần lặp lại Ngày Ngày Ngày Ngày 1, 0 , , 0 1, , Bảng D.8 Khả kháng nấm Aspergillus niger dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus sp.L5 (1 000 vòng/10 phút) trung hồ có xử lý nhiệt Ngày ĐC nấm Đối kháng Đối kháng Đối kháng  Khả kháng nấm Mucor dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus sp.L5  Xử lý số liệu Statgraphics tỉ lệ ức chế nấm Mucor dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus sp.L5 khơng trung hồ ngày Summary Statistics for Col_1 Count Average Standard Coeff of deviation variation dich ly tam 7.1 7777 dich ly tam 5 875 8.01 Minimum Maximum Range % % 5.71 78 % 5.71 50.0 105 50.0 7.1 7.15 xu ly nhiet Total 05 ANOVA Table for by Col_1 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 87.0 87.0 Within groups Total (Corr.) 1.5 0.0 11 Multiple Range Tests for by Col_1 Method: 95.0 percent LSD Col_1 Count Mean X 7.1 X dich ly tam xu ly nhiet dich ly tam Homogeneous Groups  Xử lý số liệu Statgraphics tỉ lệ ức chế nấm Mucor dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus sp.L5 trung hoà ngày Summary Statistics for Col_1 dich ly tam Count Average Standard Coeff of deviation variation 51 % 85 8.87 % Minimum Maximum Range 7.1 50.0 5.71 57.1 5.71 57.1 pH6 dich ly tam pH6 xu ly nhiet Total 5 8.5 18 % ANOVA Table for by Col_1 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 57.5 1 57.5 0.7 Within groups 11 Total (Corr.) 77 15 Multiple Range Tests for by Col_1 Method: 95.0 percent LSD Col_1 Count Mean dich ly tam pH6 xu ly nhiet 85 dich ly tam pH6 Homogeneous Groups X 7X Bảng D.9 Tỉ lệ ức chế nấm Mucor dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus sp.L5 (1 000 vòng/10 phút) khơng trung hồ khơng có ảnh hưởng nhiệt độ Lần lặp lại Tỉ lệ ức chế (%) ngày 1 ,8 8,57 50 Bảng D.10 Khả kháng nấm Mucor dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus sp.L5 (1 000 vòng/10 phút) khơng trung hồ khơng có ảnh hưởng nhiệt độ Ngày ĐC nấm Đối kháng Đối kháng Đối kháng Bảng D.11 Tỉ lệ ức chế nấm Mucor dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus sp.L5 (1 000 vòng/10 phút) khơng trung hồ có xử lý nhiệt Lần lặp lại Tỉ lệ ức chế (%) ngày 1 ,8 5,71 Bảng D.12 Khả kháng nấm Mucor dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus sp.L5 (1 000 vòng/10 phút) khơng trung hồ có xử lý nhiệt Ngày ĐC nấm Đối kháng Đối kháng Đối kháng Bảng D.13 Tỉ lệ ức chế nấm Mucor dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus sp.L5 (1 000 vòng/10 phút) trung hồ khơng có ảnh hưởng nhiệt độ Lần lặp lại Tỉ lệ ức chế (%) ngày 1 50 50 7,1 Bảng D.14 Khả kháng nấm Mucor dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus sp.L5 (1 000 vòng/10 phút) trung hồ khơng có ảnh hưởng nhiệt độ Ngày ĐC nấm Đối kháng Đối kháng Đối kháng Bảng D.15 Tỉ lệ ức chế nấm Mucor dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus sp.L5 (1 000 vòng/10 phút) trung hồ có xử lý nhiệt Lần lặp lại Tỉ lệ ức chế (%) ngày 1 57,1 5,71 5,71 Bảng D.16 Khả kháng nấm Mucor dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus sp.L5 (1 000 vòng/10 phút) trung hồ có xử lý nhiệt Ngày ĐC nấm Đối kháng Đối kháng Đối kháng Phụ lục E: Ứng dụng vi khuẩn lactic kháng nấm đậu phộng Bảng E.1 Kết khả kháng nấm đậu phộng ngày canh trường LAB huyền phù LAB CANH TRƯỜNG LAB NGÀY HUYỀN PHÙ LAB NGÀY Bảng E.2 Kết khả kháng nấm đậu phộng ngày canh trường LAB huyền phù LAB CANH TRƯỜNG LAB NGÀY HUYỀN PHÙ LAB NGÀY Bảng E.3 Kết khả kháng nấm đậu phộng ngày canh trường LAB huyền phù LAB CANH TRƯỜNG LAB NGÀY HUYỀN PHÙ LAB NGÀY Bảng E.4 Kết khả kháng nấm đậu phộng ngày canh trường LAB huyền phù LAB CANH TRƯỜNG LAB NGÀY HUYỀN PHÙ LAB NGÀY Bảng E.5 Kết khả kháng nấm đậu phộng ngày canh trường LAB huyền phù LAB CANH TRƯỜNG LAB NGÀY HUYỀN PHÙ LAB NGÀY Bảng E.6 Kết khả kháng nấm đậu phộng ngày 11 canh trường LAB huyền phù LAB CANH TRƯỜNG NUÔI CẤY LAB HUYỀN PHÙ TẾ BÀO LAB ...  Khảo sát khả đối kháng trực tiếp vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 nấm Aspergillus niger Mucor sp  Khảo sát khả đối kháng sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 nấm Aspergillus niger. .. 49 3.2 Khảo sát khả kháng nấm chủng vi khuẩn lactic 51 3.2.1 Khảo sát khả đối kháng trực tiếp chủng Lactobacillus sp.L5 nấm Aspergillus niger 52 3.2.2 Khảo sát khả đối kháng trực... động kháng nấm vi khuẩn lactic nhiều nước giới Mục đích nghiên cứu Khảo sát khả kháng nấm nhiễm thực phẩm Aspergillus niger Mucor sp vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 Mục đích cuối sản xuất chế phẩm vi