So sánh mối liên hệ di truyền giữa các chủng neisessria meningitidis (não mô cầu) ở khu vực phía nam bằng phương pháp điện di trong trườg xung điện (PFGE)

Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu, nội dung phương pháp nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Nội dung nghiên cứu 1.3 Phương pháp nghiên cứu CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nhiễm Neisseria meningitidis 2.1.1 Tình hình nhiễm N meningitidis giới 2.1.2 Tình hình nhiễm N meningitidis Việt Nam 2.2 Tổng quan về vi khuẩn Neisseria meningitidis 2.2.1 Phân loại N.meningitidis 2.2.2 Hình thái N meningitidis 2.2.3 Tính chất ni cấy 10 2.2.4 Đặc điểm sinh hóa 11 2.2.5 Đặc điểm dịch tễ 11 2.2.6 Cơ chế khả gây bệnh 13 2.2.6.1 Vật chủ đường lây nhiễm 13 2.2.6.2 Các yếu tố độc lực 13 2.2.6.3 Cơ chế gây bệnh 15 2.2.7 Biểu lâm sàng 17 2.2.7.1 Viêm họng 17 2.2.7.2 Nhiễm trùng huyết 17 2.2.7.3 Viêm màng não 19 2.2.8 Điều trị 20 2.2.9 Phòng ngừa 20 2.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử phân loại N meningitidis 22 i Đồ án tốt nghiệp 2.4 Kỹ thuật PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis): kỹ thuật điện di trường xung điện hay điện di trường điện thay đổi 27 2.4.1 Nguyên tắc chung PFGE 27 2.4.2 Quy trình PFGE 29 2.4.3 So sánh kỹ thuật PFGE với phương pháp phân loại sinh học phân tử khác thường sử dụng nghiên cứu 33 2.4.3.1 Ưu điểm 33 2.4.3.2 Nhược điểm: 33 2.4.4 Ứng dụng PFGE nghiên cứu dịch tễ học Neisseria meningitidis 34 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 3.1 Thời gian địa điểm thực hiện 39 3.2 Đối tượng nghiên cứu 39 3.3 Vật liệu - sinh phẩm - môi trường - thiết bị 41 3.3.1 Vật liệu 41 3.3.2 Sinh phẩm - hóa chất 41 3.3.3 Môi trường sử dụng 42 3.3.4 Thiết bị 42 3.4 Phương pháp nghiên cứu 44 3.4.1 Quy trình thực 44 3.4.2 Mô tả quy trình 45 3.4.2.1 Hoạt hóa chủng vi khuẩn tiến hành định danh sơ bộ bằng phương pháp truyền thống 45 3.4.2.2 Thí nghiệm thực test quy trình PFGE cải tiến 45 3.4.2.3 Thí nghiệm chủng 51 3.4.2.4 Tìm mối liên hệ di tryền giữa chủng 51 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52 4.1 Kết khảo sát hình thái chủng vi khuẩn thí nghiệm 52 4.2 Kết định danh 52 ii Đồ án tốt nghiệp 4.2.1 Nhuộm gram 52 4.2.2 Thử nghiệm Catalase 53 4.2.3 Thử nghiệm Oxidase 54 4.2.4 Thử nghiệm phân giải loại đường 54 4.3 Kết kiểm tra quy trình PFGE chủng 12 – 705 DK 56 4.4 Kết điện di 17 chủng để xây dựng mối liên hệ di truyền 57 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 5.1 Kết luận 66 5.2 Kiến nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 iii Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism A baumannii : Acinetobacter baumannii BA : Blood Agar Bp : Base pairs CA : Chocolate Agar CD : Chủng dịch CFU : Colony Forming Units CLB : Cell Lysis Buffer CSB : Cell Suspension Buffer CSF : Kit for collection of cerebrospinal fluid CTA : Cystine Trypticase Agar DNA : Deoxyribonucleoic Acid DK : Đông khô EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid EtBr : Ethidium Bromide ESBL : Extended spectrum beta-lactamase Kb : Kilo base pairs LOS : Lipooligosaccharide MLST : Multilocus Sequence Typing MLEE : Multilocus enzyme electrophoresis NAD : Nicotine Adenine Dinudeotide N meningitidis : Neisseria meningitidis OMP : Outer Membrane Protein PCR : Polymerase Chain Reaction PFGE : Pulsed Field Gel Electrophoresis PS : Polysaccharide RNA : Ribonucleic acid RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism iv Đồ án tốt nghiệp S typhi : Salmonella typhi S aureus : Staphylococcus aureus TBE : Tris-Borate-EDTA TD : Tự TP.HCM : Thành phố Hồ Chí Minh UV : Ultra Violet VCN : Vacomycin-Colistin-Nystatin WHO : World Health Organization µl : Microliter v Đờ án tớt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Phân bố phân nhóm N meningitidis gây dịch tồn giới Hình 2.2 Vành đai viêm màng não châu Phi Hình 2.3 Tiêu nhuộm dịch não tủy (A) vi khuẩn N meningitidis sau nhuộm Gram (X100) từ khuẩn lạc (B) 10 Hình 2.4 Hình thái khuẩn lạc N meningitidis môi trường BA CA 11 Hình 2.5 Các protein bề mặt thành phần màng ngồi N meningitides 14 Hình 2.6 Q trình xâm nhiễm N meningitidis 16 Hình 2.7 Mợt số phương pháp phân loại sinh học phân tử 24 Hình 2.8 Các bước thực hiện quy trình PFGE 29 Hình 2.9 Khả di động phân tử DNA trường xung điện 31 Hình 3.1 Sơ đồ thực hiện quy trình PFGE xác định mối liên hệ di truyền 44 Hình 3.2 Các bước quy trình PFGE chuẩn 45 Hình 4.1 Khuẩn lạc sau cấy qua đêm môi trường CA BA từ chủng 12705DK 52 Hình 4.2 Kết nhuộm Gram 53 Hình 4.3 Kết thử nghiệm Catalase 53 Hình 4.4 Kết thử nghiệm Oxidase 54 Hình 4.5 Kết thử nghiệm loại đường sau 24 giờ 54 Hình 4.6 Kết chạy điện di PFGE chủng N meningitidis (12-705 DK) 57 Hình 4.7 Kết chạy điện di PFGE 17 chủng N meningitides 58 Hình 4.8 Kết phân tích mối liên hệ di truyền 17 chủng vi khuẩn N meningitidis 64 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Liều lượng sử dụng kháng sinh dự phòng 22 Bảng 2.2 Một số enzym cắt hạn chế dung cho kỹ thuật PFGE 30 Bảng 2.3 Tiêu chuẩn tương đồng về kiểu gen kỹ thuật PFGE 33 Bảng 2.4 Minh hoạ chủng vi sinh vật phân tích dựa kết PFGE thu từ đoạn nhiễm sắc thể 38 Bảng 3.1 Danh sách 17 chủng vi khuẩn N meningitidis thực hiện đề tài 39 Bảng 3.2 So sánh thông số thay đổi giữa PFGE theo WHO cải tiến 45 Bảng 3.3 Mô tả bước thực hiện quy trình PFGE cải tiến 46 Bảng 4.1 Kết test sinh hóa 17 chủng thí nghiệm 55 Bảng 4.2 Số băng 17 chủng N meningitidis cắt NheI từ kết PFGE hình 4.7 59 Bảng 4.3 Số băng khảo sát từ kết điện di PFGE 61 Bảng 4.4 Các chủng khảo sát theo serogroup 62 Bảng 4.5 Biến động di truyền 17 chủng N meningitidis 63 vii Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Neisseria meningitidis (còn gọi vi khuẩn não mô cầu) một những tác nhận hàng đầu gây hai thể bệnh viêm màng não mủ nhiễm trùng huyết nghiêm trọng tồn giới [9] Bệnh có những triệu chứng, biểu hiện lây lan rất phức tạp Ngay bệnh chẩn đoán sớm điều trị đầy đủ tỉ lệ tử vong chiếm - 10% Bệnh phát triển mạnh mẽ nhất vào mùa đông trẻ em tuổi có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất với tỷ lệ tử vong chiếm từ 20 – 50% N meningitidis ký sinh nhiều quan thể người niêm mạc mũi hầu, họng, đường hô hấp, hệ thần kinh, máu, khớp, màng tim, đường niệu sinh dục [1], [13], [14] N meningitidis truyền từ người sang người theo dịch tiết qua đường hơ hấp rất dễ lây lan có khả phát triển thành dịch cao, đặc biệt những nơi tập trung đông người Theo thống kê Tổ chức Y tế giới, hàng năm có khoảng 300.000 – 500.000 trường hợp bệnh nhiễm não mơ cầu [14] Tại Việt Nam, tính từ năm 2011 đến tháng năm 2013, trung bình năm có 150 trường hợp mắc bệnh não mô cầu với tỷ lệ tử vong khoảng 3,3% (theo số liệu viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh) Trong năm 2014, theo Tổng cục thống kê, nước có 24 trường hợp mắc bệnh viêm màng não não mơ cầu gây ra, trường hợp tử vong [18] Mười ba nhóm huyết N meningitidis ghi nhận, dựa cấu trúc vỏ polysaccharide khác nhau, nhiên có nhóm huyết có khả gây dịch: A, B, C, X, Y W – 135 Hiện nay, cách điều trị hữu hiệu nhất N meningitidis dùng kháng sinh, nhiên N meningitidis biết đến rất nhạy cảm với loại thuốc kháng sinh sử dụng để điều trị dự phòng Chính thế, cần có những nghiên cứu dịch tễ nhằm đưa đánh giá, cảnh báo kịp thời về diễn biến bệnh N meningitidis rất đa dạng phức tạp về mặt di truyền nghiên cứu nước về dịch tễ học vi khuẩn Bên cạnh việc chẩn đốn Đờ án tớt nghiệp giám sát thường niên việc quan tâm đến dịch tễ học phân tử chủng vùng dịch có ý nghĩa hết sức quan trọng Nhằm phục vụ cơng tác phòng chống dịch, xác định nguồn gốc, thực hiện thử nghiệm vắc-xin, nghiên cứu biến đổi di truyền mối liên quan giữa chủng vùng dịch, giữa chủng vụ dịch trước để có biện pháp ứng phó kịp thời, đề tài “So sánh mối liên hệ di truyền chủng Neisessria meningitidis (Não mơ cầu) khu vực phía Nam phương pháp điện di trường xung điện (PFGE)” thực hiện 1.2 Mục tiêu, nội dung phương pháp nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu - So sánh mối liên hệ di truyền giữa chủng N meningitidis khu vực phía Nam phương pháp điện di trường xung điện 1.2.2 Nội dung nghiên cứu - Thực hiện PFGE 17 chủng phân lập định danh N meningitidis theo quy trình cải tiến - Phân tích kết điện di, so sánh xây dựng mối liên hệ di truyền giữa chủng N meningitidis 1.3 Phương pháp nghiên cứu Hiện nay, một những phương pháp áp dụng rộng rãi để phân tích mối quan hệ giữa chủng vi khuẩn N meningitidis điện di trường xung điện PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) Bằng phương pháp này, mối liên hệ di truyền chủng vi khuẩn sẽ xác định Tại Việt Nam, có rất nghiên cứu đánh giá về mối liên hệ di truyền chủng vi khuẩn N meningitidis Vì vậy, nghiên cứu này, ứng dụng phương pháp PFGE để đánh giá mối liên hệ di truyền chủng vi khuẩn N meningitidis thu nhận phân lập Mối liên hệ di truyền một số chủng vi khuẩn N meningitidis xác định phương pháp PFGE Phòng xét nghiệm Vi Khuẩn Hô Hấp, thuộc Khoa Vi sinh miễn dịch, Viện Pasteur Tp.HCM Quy trình thực hiện dựa theo tiêu chuẩn WHO theo nghiên cứu Nguyễn Thúy Nga, “Hồn thiện quy trình điện di trường xung điện (PFGE) chủng N meningitidis”, năm 2014 Quy Đờ án tớt nghiệp trình thực hiện sau: Các chủng vi khuẩn cấy lên môi trường BA/CA, ủ ấm 37oC, 19 - 24 giờ, CO2 5% Sau 24 giờ, quan sát khuẩn lạc, tiến hành định danh sơ bộ phương pháp truyền thống, chọn khuẩn lạc thuần, sau tiến hành tạo huyền phù tế bào dung dịch Cell Suspension Buffer Tiếp tục hòa vi khuẩn vào thạch agarose 1% có bổ sung Proteinase K, cho vào những plugs, kết tạo plugs nhỏ có chứa tồn bợ tế bào vi khuẩn Vi khuẩn cố định plugs sẽ chịu tác dụng Protein K dung dịch Cell Lysis Buffer, ly giải tế bào qua đêm để giải phóng tồn bợ DNA, DNA sẽ bị phân cắt những vị trí đặc hiệu enzyme giới hạn NheI Các plugs chứa DNA sau phân cắt đặt vào những giếng tương ứng khuôn thạch agarose tiến hành điện di Trong đó, bợ điện di đặt với dòng điện có điện 160V, cường đợ 140mA, chạy vòng 24 giờ với ba pha : 2,2 giây – giờ, 10 giây – giờ, 35 giây – giờ Mẫu DNA sau điện di nhuộm Ethidiumbromide, chụp ảnh phân tích kết dựa tiêu chuẩn Tenover cs (1995) Đồ án tốt nghiệp khuẩn bị đợt biến di trùn để thích nghi với môi trường mới, chủng 13 – 515 DK 14 – 32 TD serogroup B, có mối liên hệ di truyền rất gần phân lập từ năm khác xa năm 1986 năm 2012, điều cho thấy, cấu trúc về mặt di tuyền chủng tương đối ổn định Nếu so sánh chủng vi khuẩn với chủng vi khuẩn khác cùng một thời gian phân lập chủng vi khuẩn coi chủng mới, lại chủng cũ so sánh cùng một serogroup Việc xác định nguồn gốc gây vụ dịch rất quan trọng việc điều trị, điều góp phần quan trọng dịch tễ học phân tử vi khuẩn N meningitidis Việc phân tích biến đợng di trùn, nhận thấy mức đợ tương đồng chủng vi khuẩn giữa serogroup khơng đồng nhất, chủng tḥc serogroup B có mức độ tương đồng cao chủng thuộc serogroup C Một số nghiên cứu trước cho kết mức độ di truyền serogroup B cao nhiều so với serogroup C [5] Qua việc phân tích trên, ta đưa kết luận sau: hai chủng 12 – 092CD 12 – 094CD không phân biệt được; chủng có mối quan hệ rất gần chủng 12 – 117 CD, 12 – 343 CD, 12 – 713 DK; giữa chủng 12 – 093CD, 12 – 095CD; giữa chủng 12 – 705 DK, 12 – 707 DK, 12 – 704 DK; giữa chủng 13 – 515 DK, 14 – 032 TD; chủng có quan hệ 12 – 712 DK 12 – 706 DK, 12 – 714 DK 12 – 711 DK Như vậy, theo Tenover có 11/17 chủng tương đồng mức 85% Các chủng vi khuẩn gây bệnh địa điểm khác mang mợt số yếu tố gây bệnh khác hoặc có những biến đổi nhỏ bộ máy di truyền Các chủng khảo sát phân lập từ nhiều năm trước đó, sai khác đợt biến di trùn đơt biến điểm, chèn thêm, xóa hoặc xếp lại…Điều sẽ tạo nên tính đa dạng về mặt di truyền chủng vi khuẩn gây bệnh Vì vậy, chiến lược nghiên cứu phát triển vaccine, cần ý tìm chủng có tính tương đồng cao với chủng gây bệnh khác khu vực nhằm đảm bảo khả bảo hộ vaccine Sử dụng kỹ thuật PFGE cơng cụ để phân tích nguồn dữ liệu, đặc điểm 64 Đồ án tốt nghiệp dịch tễ mức độ phân tử quan sát vi biến đổi chủng N meningiditis chọn lọc những vi khuẩn điển hình dung nghiên cứu, sản xuất vắc – xin 65 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đề tài hồn thành có những kết luận sau đây:  17 chủng phân lập định danh N meningitidis phương pháp truyền thống  Áp dụng quy trình cải tiến cho 17 chủng, sử dụng enzyme cắt NheI cho kết rõ ràng băng tách biệt  Xây dựng mối quan hệ di truyền giữa 17 chủng nghiên cứu, bổ sung vào đặc điểm dịch tễ học loài Neisseria bước đầu nhằm thực hiện thử nghiệm vaccine mang tính bảo hợ cao 5.2 Kiến nghị Tiến hành kỹ thuật MLST nhằm phân tích chi tiết biến đổi genome vi khuẩn 66 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước Bộ môn nhiễm đại học y dược TP Hồ Chí Minh, 1997, Bệnh truyền nhiễm Nhà xuất y học Bộ Y Tế, 2012, Hướng dẫn Chẩn đốn điều trị bệnh nhiễm Não Mơ Cầu, Quyết định số 975/QĐ-BYT ngày 29 tháng năm 2012 Đặng Minh Hoàng, 2004, Nghiên cứu ảnh hưởng Dexamethasone lên đáp ứng miễn nhiễm bệnh nhân viêm màng não mũ, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Nguyễn Trần Chính, 1997 Bệnh truyền nhiễm Nhà xuất y học Nguyễn Thúy Nga, Hoàn thiện quy trình điện di trường xung điện (PFGE) chủng Neisseria meningitidis, 2014 Tài liệu nước Abadi FJR, Population genetic and epidemiological studies of Neisseria meningitidis, PhD thesis, University of Aberdeen, 1996 Arlet G, Rouveau M, Casin I, Bouvet P.J, Lagrange P.H, Philippon A (1994), Molecular epidemiology of Klebsiella pneumoniae strains that produce SHV - beta -lactamase and which were isolated in 14 French hospitals, J Clin Microbiol, 32, pp 2553 – 2558 Arthur M, Arbeit R, Kim C, Beltran P, Crowe H, Steinbach S, Campanelli C, Ra W, SelADNer RK, Goldstein R (1990), Restriction fragment length polymorphisms among uropathogenic Escherichia coli isolates: pap related sequences compared with rrn operons, Infect Immun, 58, pp 471 – 479 Bartual, S G H Seifert, C Hippler, M.A Luzon, H Wisplinghoff, ADN F Rodriguez - Valera (2005), Development of a multilocus sequence typing scheme for characterization of clinical isolates of Acinetobacter baumannii, J Clin Microbiol, 43, pp 4382 – 4390 67 Đồ án tốt nghiệp 10 Bevanger L, et al., Identification of nasopharyngeal carriage of an outbreak strain of Neisseria meningitidis by pulsed-field gelelectrophoresis versus phenotypic methods, 1998 11 Bingen E.H, Denamur E, Elion J (1994), Use of ribotyping in epidemiological surveillance of nosocomial outbreaks, Clin Microbiol Rev, 7, pp 311 – 327 12 Brown J.C, Shanahan P.M, Jesudason M.V, Thomson C.J, Aymes S.G (1996), Mutations responsible for reduced susceptibility to - quinolones in clinical isolates of multi - resistant Salmonella typhi in India, Antimicrob Chemother, 37, pp 891 - 900 13 Caugant DA, et al., Genetic structure of Neisseria meningitidis populations in relation to serogroup, serotype, and outer membrane protein pattern, J Bacteriol 1987; 169: 278 - 2792 14 Caugant DA, Population genetics and molecular epidemiology of Neisseria meningitides, APMIS 1998; 106: 505 - 25 15 Caugant DA, Frerholm LO, Bervre K et al., Intercontinental spread of a genetically distinctive complex of clones of Neisseria meningitidis causing epidemic disease Proc Nut1 Acad Sci USA 1986; 83: 4927 - 4931 16 CD alert, Monthly Newsletter of National Intitute of Communicable Diseases Directorate General of Health Services: Government of India; 2005; : – 17 David S Stephens , Conquering the Meningococcus, - 14 ,1 January 2007 18 Enright, M C, Day N P, Davies C E, Peacock S J, ADN Spratt B G (2000), Multilocus sequence typing for characterization of methicillinresistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus, J Clin Microbiol, 38, pp 1008 – 1015 19 Feil, E J.Smith J M, Enright M C., and Spratt B G (2000), Estimating recombinational parameters in Streptococcus pneumonia from multilocus sequence typing data, Genetics, 154, pp 1439 – 1450 68 Đồ án tốt nghiệp 20 Frasch CE, Zollinger WD, Poolman JT (1985) Serotype of Neisseria scheme meningitidis and a proposed for antigens designation of serotypes Rev Infect Dis 7: 504 – 510 21 Fred FC, Arbeit RD, Goering RV, (1995), Interpreting Chromosomal DNA Restriction Patterns Produced by Pulsed-Field Gel Electrophoresis: Criteria for Bacterial Strain Typing, Journal of Clinical Microbiology 33 (9), pp 2233 2239 22 Greenwood BM, Bradley AK, Wall RA (1985), Meningococcal disease and season in sub-Saharan Africa, Lancet 2: 829 – 830 23 Greenfield S, Sheehe PR, Feldman HA(1971), Meningococcal carriage in a population of “normal” families, J Infect Dis 123: 67 – 73 24 Jane A Bygraves and Martin C J Maiden, Analysis of the clonal relationships between strains of Neisseria menirrgitidis by pulsed field gel electrophoresis, in Journal of General Microbiology, (1992), 138, 523 - 531 25 Jelfs, J, B Jalaludin, R Munro, M Patel, M Kerr, D Daley, S Neville, and A Capon 1998, A cluster of meningococcal disease in western Sydney, Australia initially associated with a nightclub Epidemiol, Infect 120: 263 – 270 26 Jorgensen M, Givney R, Pegler M, Vickery A, Funnel G (1996), Typing multidrug - resistant Staphylococcus aureus: conflicting pidemiological data produced by genotypic and phenotypic methods clarified by phylogenetic analysis, J Clin Microbiol, 34, pp 398 – 403 27 Luzzaro F, Perilli M, Migliavacca R, Lombardi G, Micheletti P, Agodi A, Stefani S, Amicosante G, Pagani L (1998), Repeated epidemics caused by extended spectrum beta - lactamase - producing Serratia marcescens strains, Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 17, pp 629 – 636 28 Maiden, M C, Bygraves J A, Feil E, Morelli G, Russell J E, Urwin R, and et al (1998), Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms, Proc Natl Acad Sci, 95, pp 3140 – 3145 69 Đồ án tốt nghiệp 29 Maynard Smith J, Smith NH, O’Rourke My Spratt BG, How clonal are bacteria? Proc Nut1 Acad Sci USA 1993; 90: 4384 - 4388 30 Morelli G, Malorny B, Muller K et al, Clonal descent and microevolution of Neisseria meningitidis during thirty years of epidemic spread, Mol Microbiol 1997; 25: 1047 -1064 31 Nicolas P, Parzy D, Martet G, Pulsed-field gel electrophoresis analysis of clonal relationships among Neisseria meningitidis A strains from different outbreaks, 1997 32 Olyhoek T, Crowe BA, Achtman M, Clonal population structure of Neisseria meningitidis serogroup A isolated from epidemics and pandemics between 1915 and 1983, Rev Infect Dis 1987; 9: 665 - 692 33 Outbreak News (2006) Meningococcal disease, African meningiti belt, epidemic season 2006, Wkly Epidemiol Rec 81: 119 – 120 34 Pena C, Pujol M, Ardanuy C, Ricart A, Pallares R, Linares J, Ariza J, Gudiol F (1998), Epidemiology and succesful control of a large outbreak due to Klebsiella pneumoniae producing extended - spectrum beta - lactamases, Antimicrob Agents Chemother, 42, pp 53 – 58 35 Popovic T, Schmink S, Rosenstein NA, Ajello GW, Reeves MW, Plikaytis B, Hunter SB, Ribot EM, Boxrud D, Tondella ML, Kim C, Noble C, Mothershed E, Evaluation investigations of pulsed-field gel electrophoresis in of meningococcal disease epidemiological outbreaks caused by Neisseria meningitidis serogroup C 36 Privitera O, Agodi A, Puntorieri M, Primavera A, Santagati M, Privitera A, Mezzatesta M, Giuffrida E, Stefani S (1995), Molecular epidemiology of enterococci with high level resistance to aminoglycosides, Microb Drug Res, 1, pp 293 – 297 37 Riesbeck K, Orvelid - Mölling P, Fredlund H, Olcén P, Long - term persistence of a discotheque-associated invasive Neisseria meningitidis group C 70 Đồ án tốt nghiệp strain as proven by pulsed field gel electrophoresis and por A gene sequencing, 1990 38 Rosenstein NE, Bradley BA, Stephens DS, Popovic T, Hughes JM (2001) M eningococcal disease, N Engl J Med 344: 1378 – 1388 39 Shao ZJ, Ren HY, et al., Molecular typing of Neisseria meningitidis serogroup C strains with pulsed field gel electrophoresis in China 40 Schwartz B, Moore PS, Broome CV, Global epidemiology of meningococcal disease, Clin Microbiol Rev 1989; 2:S118 - 24 41 Stefani S, Agodi A, Russo G (1994), Role of molecular methodologies in the epidemiologic studies of infections, Ig Mod, 102, pp 181 – 190 42 Swaminathan B, Matar GM Molecular typing methods, In: Persing DH, Smith TF, Tenover FC, White TJ (eds) Diagnostic molecular microbiology: Principles and applications, Washington, DC, American Society for Microbiology 1993: 26 - 50 43 Swaminathan B, Matar GM, Reeves MW, et al., Molecular subtyping of Neisseria meningitidis serogroup B: comparison of five methods, J Clin Microbiol 1996; 34: 1468 - 1473 44 Tenover F, Arbeit R, et al., (1995), Interpreting chromosomal and restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing, J Clin Microbiol, 33, pp 2333 – 2339 45 Ulrich Vogel, Giovanna Morelli, Kerstin Zurth, et al., Necessity of Molecular Techniques To Distinguish between Neisseria meningitidis Strains Isolated from Patients with Meningococcal Disease and from Their Healthy Contacts 46 Van Deuren M, Brandtzaeg P, et al., Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management, Clin Microbiol Rev 2000; 13: 144 - 66 47 V.Manchanda, S.Gupta and P.Bhalla, Meningococcal disease: history, epidemiology, pathogenesis, clinical manifestations, diagnosis, antimicrobial 71 Đồ án tốt nghiệp susceptibility and prevention, Indian journal of medical microbiology, vol 24, p 7, 2006 48 V.Racloz and S.Luiz, The elusive meningococcal meningitis serogroup: a systematic review of serogroup B epidemiology, BMC infectious diseases, vol.10, p.175, 2010 49 Yakubu DE, PenningtonTH, Epidemiological evaluation of Neisseria meningitidis serogroup B by pulsed – field gel electrophoresis, 1995 50 Wain J, Hoa N.T, Chinh N.T, Vinh H, Everett M.J, Diep T.S, et al (1997), Quinolone -resistant Salmonella typhi in Viet Nam: molecular basis of resistance and clinical response to treatment, Clin Infect Dis, 25(6), pp.1404 - 1410 51 World Health Organization Working Group (1995) Control of epidemic meningococcal diseases: WHO practical guidelines Edition Foundation Marcel Merieux, Lyon, France 52 World Health Organization, Meningococcal disease: 2013 epidemic season in the African Meningitis Belt, June 2013 53 W.H Organization, Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae: WHO communicable disease surveillance and response, Organization, pp - 74, 1999 Tài liệu net 54 http://www.giangduongykhoa.net/component/content/article/75-truyennhiem/1190.html 55 http://www.vncdc.gov.vn/DiseasesDetail.aspx?id=125 56 http://benhnhietdoi.vn/tin-tuc/Tin-y-te/bo-y-te-huong-dan-nguoi-dan-phongbenh-nao-mo-cau-7778.html 57 http://www.tin247.com/5-tinh-thanh-xuat-hien-benh-nao-mo-cau-1021895169.html 58 https://gso.gov.vn/default.aspx?tabid=621&ItemID=14188 59 http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs141/en/ 72 Đồ án tốt nghiệp 60 http://bioweb.uwlax.edu/bio203/s2008/bingen-sama/Pathogenesis%20&%20 Diagnosis.html 61 http://vnexpress.net/tin-tuc/thoi-su/benh-viem-mang-nao-gia-tang3211948.html 62 http://microbeonline.com/virulence-factors-produced-by-neisseriameningitidis and-their-roles-in-pathogenesis 63 http://www.khoahocphothong.com.vn/newspaper/detail/11839/nguy-coviem-mang-nao-do-nao-mo-cau-lay-lan-la-rat-lon.html 64 http://nihe.org.vn/new-vn/tin-trong-nuoc/1139/Ghi-nhan-3-ca-viem-mangnao-do-nao-mo-cau-dip-Tet.vhtm 65 http://yduochoc.vn/Truyen-nhiem/Benh-Nhiem-Nao-Mo-Cau-la-gi trieuchung-chan-doan-dieu-tri-phong-benh.htm 66 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/ 67 http://www.cdc.gov/pulsenet/pathogens/protocol-images.html 68 http://www.biochem.arizona.edu/miesfeld/teaching/Bioc4712/pages/Lecture 8/Lecture8.html 69 http://www.open-access-biology.com/probiotics/osullivan/f2.gif 70 http://www.foodsafetynews.com/2009/08/genetic-testing-1/#.VbBUrXj0ESY 71 http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanloaivisinhbangsinhho cphantu.htm 73 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A: HÌNH ẢNH Hình ảnh thiết bị sử dụng quy trình Hình1 Lò vi sóng Hình Tủ ni cấy vi khuẩn Hình Bể ủ nhiệt Hình Kính hiển vi (Olumpus CX2) Hình Hệ thống điện di Hình Tủ ủ 37°C (Incucell) Đờ án tớt nghiệp Hình Tủ ấm (memmert) Hình Máy Votex Hình Laptop máy chụp hình gel Hình 11 Tủ giữ chủng (-70°C) Hình 10 Cân điện tử Hình 12 Máy đo huyền phù vi khuẩn Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: NỘI DUNG A) Định danh sơ bộ phương pháp truyền thống Tăng sinh Môi trường thạch máu động vật 5% hoặc mơi trường máu chín (thạch sơcơla) Phân lập môi trường tăng sinh chọn lọc Tiến hành cấy ria mơi trường máu chín 5% có bổ sung VCN (Vancomycin 3µg/ml thạch, Colistin 7,5 µg/ml, Nystatin 12,5 µ/ml Sau ủ hợp mơi trường 35 - 37°C, 18 - 24 giờ, 5% CO2 Quan sát hình thái khuẩn lạc tìm khuẩn lạc đặc trưng cho N.meningitidis Sau 16 – 24 giờ nuôi cấy, quan sát khuẩn lạc mơi trường thạch máu chín có bổ sung VCN Khuẩn lạc tròn vồng nhẹ, bờ đều có màu xám (đường kính khoảng mm) Khuẩn lạc N.meningitidis khơng gây tan huyết mơi trường khơng có mùi Các khuẩn lạc có xu hướng liên kết với nhau, có ánh xanh Khuẩn lạc tan dễ dàng nước muối sinh lý, nhiên, sau 24 giờ ni cấy, khuẩn lạc trở nên dẻo dính N.meningitidis tự ly giải, chất nucleo – protein từ bên tế bào ngồi Chọn những khuẩn lạc nghi ngờ cấy chuyền qua môi trường BA hoặc CA Khuẩn lạc dùng làm phản ứng sinh hóa định danh Kiểm tra hình thái vi sinh vật phương pháp nhuộm Gram Lấy một phiến kính sạch, nhỏ mợt giọt nước muối sinh lý lên phiến kính, dùng que cấy lấy mợt khuẩn lạc điển hình, trợn đều vi khuẩn với giọt nước muối sinh lý Sau đó, để khơ tự nhiên hoặc hơ nhẹ tiêu lửa đèn cồn vài giây Tiến hành nḥm Gram kiểm tra hình thái vi khuẩn kính hiển vi Các phản ứng sinh hóa định danh sơ bợ 5.1 Phản ứng oxidase  Ngun tắc: vi khuẩn hiếu khí có enzyme cytochrome oxidase sẽ oxy hóa tetramethyl-p-phenylenediamino hydrochloride có thuốc thử thành hợp chất có màu tím Đờ án tớt nghiệp  Thuốc thử: khoanh giấy có tẩm thuốc thử tetramethyl-p- phenylenediamino dihydrichloride 1%  Cách thực hiện: lấy khuẩn lạc que cấy latin hoặc que nhựa chấm lên khoanh giấy oxidase Trong vòng 5-10 giây chuyển sang màu tím, đậm dần oxidase dương tính Vẫn giữ nguyên màu cũ âm tính 5.2 Phản ứng catalase  Nguyên tắc: vi sinh vật hiếu khí kị khí tùy ý chứa chuỗi trùn điện tử có cytochrome đều có enzyme catalase Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O O2 Sự phân hủy hydrogen peroxide sẽ giải phóng O2 ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí  Cách thực hiện: Thử phiến kính (lame): chia phiến kính thành phần ( phần làm đối chứng phần làm thí nghiệm), nhỏ vào bên một giọt H2O2 lên phiến kính Dùng que cấy lấy mợt sinh khối từ khuẩn lạc đặt lên lame có chứa H2O2 Ghi nhận sủi bọt có  Đọc kết quả: dương tính có hiện tượng sủi bọt khí O2 tạo Khơng có hiện tượng sủi bọt âm tính 5.3 Thử nghiệm oxy hóa đường môi trường Cystine Trypticase Agar (CTA) Thử nghiệm phản ứng sinh hóa với loại đường glucose, maltose, lactose sucrose xác định đặc tính oxy hóa carbohydrate sinh axit vi khuẩn (có đỏ phenol thị màu) sau:  Cấy vi khuẩn nghi ngờ lên môi trường thạch máu cừu 5% (BA) hoặc thạch máu chín (CA) 16-18 giờ  Lấy mợt vài khuẩn lạc, dùng que cấy thẳng ria cấy sâu 10 mm vào ống thạch CTA 10% loại đường sau: glucose, maltose, lactose sucrose, lần cấy khuẩn lạc phải đốt que cấy  Đậy nút ống nghiệm sinh hóa này, ủ tủ ấm 35°C - 37°C khơng có CO2  Đọc kết sau –72 giờ Sau 72 giờ âm tính hủy ống thử nghiệm Đồ án tốt nghiệp Phản ứng dương tính (+) khi: phần ống nghiệm sẽ thấy đục chuyển màu vàng N.meningitidis sinh axit sử dụng đường glucose maltose (theo kiểu oxy hóa đường), khơng sử dụng đường lactose sucrose Đối với N.meningitidis cho phản ứng dương tính với glucose, maltose âm tính với lactose, sucrose B) Tiêu chuẩn xác định vi khuẩn não mô cầu  Đặc điểm khuẩn lạc: tròn vồng nhẹ, xám nhạt (gần giống khuẩn lạc vi khuẩn H influenzae có vỏ) khơng có mùi đặc biệt, khơng gây tan huyết môi trường nuôi cấy Não mô cầu phát triển thạch máu (cừu hay thỏ) 5% thạch sơcơla  Hình thể vi khuẩn: dạng song cầu hình hạt đậu hay hạt cà phê xếp úp vào nhau, bắt màu Gram âm  Thử nghiệm Oxidase: cytochrome oxidase (+)  Thử nghiệm phản ứng sinh hoá loại đường (vi khuẩn sử dụng carbohydrate sinh axit, đỏ phenol thị màu): Glucose (+), Maltose (+): màu vàng Lactose (-), Sucrose (-): màu đỏ ... giữa chủng vùng dịch, giữa chủng vụ dịch trước để có biện pháp ứng phó kịp thời, đề tài So sánh mối liên hệ di truyền chủng Neisessria meningitidis (Não mơ cầu) khu vực phía Nam phương pháp. .. pháp điện di trường xung điện (PFGE) thực hiện 1.2 Mục tiêu, nội dung phương pháp nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu - So sánh mối liên hệ di truyền giữa chủng N meningitidis khu vực phía Nam phương. .. hệ di truyền chủng vi khu n N meningitidis Vì vậy, nghiên cứu này, ứng dụng phương pháp PFGE để đánh giá mối liên hệ di truyền chủng vi khu n N meningitidis thu nhận phân lập Mối liên