Tuyển chọn vi khuẩn lactic kháng với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Vibrio parahaemolyticus) trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) (Luận án tiến sĩ)

Tuyển chọn vi khuẩn lactic kháng với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Vibrio parahaemolyticus) trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) (Luận án tiến sĩ)Tuyển chọn vi khuẩn lactic kháng với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Vibrio parahaemolyticus) trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) (Luận án tiến sĩ)Tuyển chọn vi khuẩn lactic kháng với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Vibrio parahaemolyticus) trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) (Luận án tiến sĩ)Tuyển chọn vi khuẩn lactic kháng với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Vibrio parahaemolyticus) trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) (Luận án tiến sĩ)Tuyển chọn vi khuẩn lactic kháng với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Vibrio parahaemolyticus) trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) (Luận án tiến sĩ)Tuyển chọn vi khuẩn lactic kháng với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Vibrio parahaemolyticus) trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) (Luận án tiến sĩ)Tuyển chọn vi khuẩn lactic kháng với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Vibrio parahaemolyticus) trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) (Luận án tiến sĩ)Tuyển chọn vi khuẩn lactic kháng với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Vibrio parahaemolyticus) trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) (Luận án tiến sĩ)Tuyển chọn vi khuẩn lactic kháng với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Vibrio parahaemolyticus) trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) (Luận án tiến sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ TRÚC LINH TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC KHÁNG VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH (Vibrio parahaemolyticus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CẦN THƠ, 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ TRÚC LINH TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC KHÁNG VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH (Vibrio parahaemolyticus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ: 62620301 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRƯƠNG QUỐC PHÚ CẦN THƠ, 2018 i LỜI CẢM TẠ Trước hết tơi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy hướng dẫn PGs.Ts Trương Q́c Phú PGs.Ts Đặng Thị Hồng Oanh năm qua ân cần hướng dẫn, động viên, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho học tập, nghiên cứu để chăm bồi kiến thức hồn thành Luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Đề án Trà Vinh 100 tỉnh Trà Vinh, Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo Khoa Nông nghiệp Thủy sản, Trường Đại học Trà Vinh tạo điều kiện cho tơi được thực chương trình Nghiên cứu sinh Xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến PGs.Ts Vủ Ngọc Út có ý kiến góp ý rất quý báo để giúp tơi hồn thành chuyên đề nghiên cứu sinh Hơn nữa, xin chân thành gởi lời cảm ơn sâu sắc đến dự án Vlir điều kiện cho có được nguồn kinh phí để thực đề tài Đồng thời, xin bày tỏ lòng biết ơn đến TS Phạm Thị Tuyết Ngân nhiệt tình hướng dẫn chuyên đề, góp ý đề cương luận án để tơi có thể hồn thành đúng tiến độ Trân trọng gởi lời cảm ơn đến PGS Ts Từ Thanh Dung PGS.Ts Trần Thị Tuyết Hoa tận tình giúp tơi việc góp ý đề cương Luận án, chuyên đề tiểu luận tổng quan Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản - Trường Đại học Cần Thơ rất nhiệt tình, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành chương trình học tập nghiên cứu Xin gửi lời cảm ơn đến anh chị em Ks Phan Công Minh (Giám đốc Công ty Trách nhiệm Hữu hạn Một thành viên APC); Ths Trần Trung Giang, Ts Huỳnh Kim Hường, NCS Nguyễn Thanh Tâm, Ks Nguyễn Trọng Nghĩa, NCS Trần Việt Tiên, NCS Nguyễn Hùng Sơn, Ks Lê Ngọc Huyền, Ks Nguyễn Thị Ngọc Huyền, Ks Huỳnh Thanh Phong, Ks Ngô Chí Nguyện, Ks Huỳnh Trung Kiên, Ks Trần Việt Khánh, NCS Hồng Mộng Huyền, Ks Nguyễn Ngọc Anh cùng anh chị em đồng nghiệp Trường Đại học Trà Vinh giúp đỡ tơi rất nhiều q trình thực đề tài hồn thành Luận án Ći cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè người thân chia sẻ, giúp đỡ động viên để có thêm nghị lực hoàn thành Luận án Nguyễn Thị Trúc Linh ii TÓM TẮT Tuyển chọn vi khuẩn lactic (LAB) kháng với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Vibrio parahaemolyticus) tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) được thực Trường Đại học Cần Thơ từ tháng 12/2014 đến 4/2017 Mục tiêu nghiên cứu tìm chủng LAB có khả phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) tôm thẻ chân trắng Nghiên cứu được thực với nội dung (1) Phân lập LAB từ ruột tôm thẻ, ruột cá rô phi bùn đáy ao nuôi tôm ở tỉnh Trà Vinh, Bến Tre Sóc Trăng sàng lọc chủng LAB chỉ tiêu: hình thái, sinh lý, sinh hóa; (2) Xác định tính đối kháng LAB phân lập được với vi khuẩn V parahaemolyticus phương pháp khuếch tán giếng thạch, đồng thời xác định khả kháng V parahaemolyticus bacteriocin khả chịu đựng nồng độ muối chủng LAB kháng với V parahaemolyticus mạnh nhất được tiến hành; (3) Thử nghiệm ảnh hưởng LAB bổ sung vào thức ăn lên khả kháng AHPND Thí nghiệm được tiến hành nhằm xác định ảnh hưởng LAB bổ sung vào thức ăn đến tỷ lệ sống khả kháng AHPND tôm thẻ chân trắng Đồng thời, ảnh hưởng việc bổ sung C, N P lên khả kháng AHPND chủng LAB được xác định; (4) Định danh chủng LAB có khả kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tôm thẻ Kết phân lập LAB từ ruột tôm thẻ, ruột cá rô phi bùn đáy ao nuôi tôm biển ở tỉnh Trà Vinh, Sóc Trăng Bến Tre thu được 94 chủng LAB bao gồm: 30 chủng LAB ở Trà Vinh, 25 chủng LAB ở Sóc Trăng, 39 chủng LAB ở Bến Tre Kết sàng lọc chỉ tiêu hình thái cho thấy tất khuẩn lạc phân lập được có màu trắng đục, tròn, lồi, có kích cỡ 1-2 mm sau 48 nuôi cấy môi trường MRS agar bổ sung 1,5% NaCl Đối với chỉ tiêu sinh lý cho thấy kính hiển vi LAB có hình cầu hình que, Gram dương, không sinh bào tử Kết xác định đặc điểm sinh hóa chỉ tất chủng LAB được lựa chọn có khả làm tan CaCO3, âm tính oxidase catalase dương tính với O/F Kết xác định tính đối kháng phương pháp khuếch tán giếng thạch cho thấy hầu hết 94 chủng LAB phân lập được có khả kháng với vi khuẩn V parahaemolyticus Trong 94 chủng phân lập được có 82 chủng LAB có khả kháng với V parahaemolyticus chỉ ở mức yếu (+) trung bình (++) Mười hai chủng LAB lại bao gồm 08 chủng phân lập được ở Trà Vinh 04 chủng LAB phân lập ở Bến Tre có khả kháng V parahaemolyticus ở mức cao (+++) với vòng kháng khuẩn lớn 16 mm, đặc biệt có 05 chủng LAB (T3.1, RP5.4.1, T4.2, RP5.5.1, RP6.5) có khả kháng V parahaemolyticus mạnh nhất với vòng kháng khuẩn từ 17,5-18,5 iii mm Kết thử nghiệm khả tạo bacteriocin tính kháng khuẩn LAB với V parahaemolyticus cho thấy chúng không có khả ức chế vi khuẩn V parahaemolyticus thí nghiệm Các chủng LAB dùng thí nghiệm phát triển ở độ mặn từ 0-25‰ phát triển tốt nhất ở độ mặn 5‰ với thời gian nuôi 48 phát triển chậm ở độ mặn 25‰ với thời gian nuôi 96 Kết xác định thời gian mật số LAB khác lên khả kháng vi khuẩn V parahaemolyticus cho thấy mật số LAB đến 107 CFU/mL với thời gian nuôi từ 24 đến 96 không có khả kháng vi khuẩn V parahaemolyticus Kết thử nghiệm ảnh hưởng việc bổ sung LAB vào thức ăn đến tỷ lệ sống khả kháng AHPND tôm thẻ chân trắng cho thấy ở nghiệm thức có bổ sung LAB vào thức ăn không cảm nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus tỷ lệ sớng tơm rất cao khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng âm (87,77%) Tỉ lệ sống tôm cao nhất ở nghiệm thức bổ sung chủng LAB5 (92,23%) Ngồi ra, tơm ở nghiệm thức không có dấu hiệu AHPND Ở nghiệm thức cảm nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus, tôm có dấu hiệu bệnh lý đặc trưng AHPND chết nhiều nhất ở nghiệm thức VP+LAB3, tỉ lệ chết lên đến 70,02%, nghiệm thức đối chứng dương (54,43%) nghiệm thức VP+LAB4 (43,33%) Tuy nhiên, ở nghiệm thức VP+LAB1,VP+LAB2 VP+LAB5 tôm có tỷ lệ sống cao từ (73,33-79,77%), khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức ĐCA (87,77%) phần lớn mẫu gan tụy thu được không có dấu hiệu bệnh lý đặc trưng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính phân tích mơ bệnh học Kết thử nghiệm khả kháng AHPND LAB có bổ sung thành phần acid glutamic, đường trehalose, KH2PO4, K2HPO4 với tỷ lệ C, N, P 15, 1, 0,1 cho thấy hầu hết nghiệm thức bổ sung thành phần trên, tỷ lệ sống tôm thấp so với nghiệm thức không bổ sung trường hợp có không có cảm nhiễm V parahaemolyticus Đối với nghiệm thức khơng cảm nhiễm V parahaemolyticus tơm không có biểu bệnh lý đặc trưng AHPND, tỷ lệ sống tôm lên đến 88,2% đối với nghiệm thức không bổ sung C, N, P 82% đối với nghiệm thức có bổ sung C, N, P Tuy nhiên, hai nghiệm thức khác biệt không có ý nghĩa thống kê với Kết phân tích mô bệnh học không thấy mẫu gan tụy có dấu bất thường Tuy nhiên, nghiệm thức có cảm nhiễm V parahaemolyticus bổ sung C, N, P tỷ lệ sớng tơm thấp so với nghiệm thức lại Tỷ lệ sớng thấp nhất ở nghiệm thức đối chứng dương có bổ sung không bổ sung C, N, P lần lượt (47 52%) tỉ lệ iv sống cao nhất nghiệm thức LAB1 (76 78%) Kết mô bệnh học cho thấy ở nghiệm thức bổ sung C, N, P LAB đồng thời cảm nhiễm V parahaemolyticus gan tụy tơm ít bị ảnh hưởng cảm nhiễm AHPND Việc bổ sung LAB vào thức ăn đặc biệt chủng LAB1 có khả làm hạn chế AHPND tôm thẻ Kết định danh chủng LAB1 phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S-rRNA xác định chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum Từ khóa: AHPND, LAB, Lactobacillus plantarum, Tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei), Vibrio parahaemolyticus v ABSTRACT Isolation and selection of lactic acid bacteria (LAB) that can antagonize V parahaemolyticus causing acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in white-leg shrimp (Penaeus vannamei) were conducted from December 2014 to April 2017 at Can Tho University The objectives of this research were selecting LAB strains that can antagonize V parahaemolyticus and using these strains to prevent from AHPND in culture shrimp The study was carried out with following four major contents: (1) Isolating LAB strains from gut of white-leg shrimp (Penaeus vannamei), gut of nile tilapia (Oreochromis niloticus) and shrimp pond sediment in Tra Vinh, Ben Tre, and Soc Trang provinces Isolated LAB strains were identified by using morphological, physiological and bio-chemical characteristics (2) Determining their antagonism against V parahaemolyticus of LAB strains by using agar well diffusion method Experiment can also determine their resistance to V parahaemolyticus by bacteriocin and the ability of salt tolerance of LAB strains that resist to the virulence V parahaemolyticus also conducted (3) The effects of dietary LAB additive on resistance to AHPND This experiment was conducted to determine the effects of dietary LAB additive on survival and the resistance to AHPND At the same time, the effects of C, N, and P supplementation on the resistance to AHPND of the three strains of LAB was also determined (4) Identification of LAB strain that is resistant to AHPND in white-leg shrimp The result of isolation LAB strains from gut of white-leg shrimp, gut of nile tilapia and shrimp pond sediment in Tra Vinh, Ben Tre, and Soc Trang provinces were found out 94 LAB strains including: 30 strains from TraVinh, 25 strains from Soc Trang and 39 strains from Ben Tre Screening results for morphological characters showed that all the isolated colonies were milky, round, convex, 1-2 mm in size and capable of dissolving CaCO3 after 48 hours of culture on MRS agar supplemented with 1,5% NaCl Physiological properties also indicate that the LAB has a spherical (56 stains) and rod (38 strains) shaped, Gram-positive, non-spore-forming Biochemical characteristics have shown that all strains of LAB indicate negative reaction for oxidase and catalase but positive for O/F The results of antagonistic determination by agar-well diffusion method showed that almost of 94 isolated LAB strains were resistant to V parahemolyticus Of these, 82 strains of LAB were weak (+) and medium (++) resistant to V parahaemolyticus Only 12 strains of LAB, strains were isolated in Tra Vinh and were isolated in Ben Tre were strongly resistant vi (+++) to V parahaemolyticus with zone of inhibition greater than 16mm Five strains of LAB (T3.1, RP5.4.1, T4.2, RP5.5.1, RP6.5) showed the strongest resistance to V parahaemolyticus with antibacterial rings from 17,5 to 18,5mm The results of resistance trials to V parahaemolyticus of the strains of LAB by bacteriocin indicated that they were not able to inhibit V parahaemolyticus bacteria All LAB strains used in the experiment were able to grow at a salinity of 0-25ppt, but grew well in 5ppt of salinity in 48 hours of culture They grew much slower in 25ppt of salinity in 96 hours of culture The results of the effects of different time culture and density of LAB on V parahaemolyticus resistance ability showed that at the density of LAB from 107 CFU/mL or less and culture time from 24 to 96 hours, LAB were not resistant to V parahaemolyticus The results of the effect of dietary LAB additive on survival rate and resistance to AHPND in Penaeus vannamei showed that the survival rate of shrimp was very high from 82,23 to 92,23% in the treatments of dietary LAB additive without challenged with V parahaemolyticus, and there were not significantly different to the negative control treatment (87,77%) The highest survival rate was obtained in the treatment of dietary LAB5 additive (92,23%) In addition, shrimps did not show any symptoms of AHPND In the challenged treatments with V parahaemolyticus, shrimps showed the typical clinical signs of AHPND The mortality rate was highest in VP+LAB3 treatment (70,02%), followed by the positive control treatment (54,43%) and VP+LAB4 treatment (43,33%) In the VP+LAB1, VP+LAB2 and VP+LAB5 treatments, shrimps also had the high survival rate (73,37% to 79,97%) and shrimp’s hepatopancreas were less affected by AHPND In summary, the survival rate and the resistance to AHPND were significantly improved in white-leg shrimp feeding with diets containing LAB1, LAB2, or LAB5 strains The results of the effects of dietary LAB additive and acid glutamic, Trehlose, KH2PO4, K2HPO4 supplementation into water with C, N, P ratio 15, 1, 0,1 on survival rate and resistance to AHPND in Litopenaeus vannamei showed that almost of treatments with C, N, P supplementation indicated the survival rate of shrimp were lower than those without C, N, P supplementation in case with or without V parahaemolyticus challenged In non-challenged V parahaemolyticus treatments, there were no signs of AHPND on shrimps The survival rate of shrimp was 88,2% for C, N, P non-supplementaiton treatment and 82% for C, N, P supplementation treatment Results from histological analyses did not show any abnormalities of hepatopancreas However, vii treatments with C, N, P supplementation and V parahaemolyticus challenged showed the survival rate of shrimp was lower than did of the other treatments The lowest survival rate was found in positive treatments with or without C, N, P supplementation (47% and 52%, respectively) and the highest survival rate was LAB1 treatments (76% and 78%) Results from histological analyses showed that in the treatments with C, N, P supplement, dietary LAB additive with V parahaemolyticus challenged, shrimp’s hepatopancreas were less affected by AHPND Dietary LAB additive (especially LAB1 strain) was able to reduce the effect of AHPND on white-leg shrimp The result of identification with RNA sequencing (16s-rRNA) have shown that LAB1 strain was Lactobacillus plantarum Keywords: AHPND, LAB, Lactobacillus plantarum, Penaeus vannamei, Vibrio parahaemolyticus viii ... lệ sống khả kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) 61 4.4 Thử nghiệm khả kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính chủng vi khuẩn lactic có bổ... động vi n để tơi có thêm nghị lực hồn thành Luận án Nguyễn Thị Trúc Linh ii TÓM TẮT Tuyển chọn vi khuẩn lactic (LAB) kháng với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Vibrio parahaemolyticus). .. kiện in vitro 41 3.3.3 Thử nghiệm khả kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp bổ sung chủng LAB vào thức ăn 43 3.3.4 Định danh chủng LAB có khả kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính