Tuyển chọn vi khuẩn lactic kháng với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (vibrio parahaemolyticus) trên tôm thẻ chân trắng (penaeus vannamei) tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chun ngành: Ni trồng Thủy sản Mã ngành: 9620301 NGUYỄN THỊ TRÚC LINH TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC KHÁNG VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH (Vibrio parahaemolyticus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) Cần Thơ, 2018 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: PGS.TS Trương Quốc Phú Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: Vào lúc … … ngày … tháng … năm … Phản biện 1: Phản biện 2: Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Isolation and selection of lactic acid bacteria that can antagonize Vibrio parahaemolyticus causing acute hepatopancreatic necrosis disease in whiteleg shrimp (Penaeus vannamei) Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Vol (74-81) Ảnh hưởng việc bổ sung vi khuẩn lactic vào thức ăn lên khả kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ 52b:122-130 Chương I GIỚI THIỆU 1.1 Giới thiệu Tôm biển xem sản phẩm có giá trị kinh tế cao trở thành nguồn xuất nhiều nước thê giới Thailand, Indo, Vietnam, Malaysia, (FAO, 2013) Tuy nhiên, người nuôi nuôi tôm với mật số cao nên họ phải đối mặt với nhiều rủi ro Đặc biệt bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) Bệnh gây tác hại lớn nhiều ao ni phía Nam Châu Á (FAO, 2013) Tổng số thiệt hại hàng năm tỷ USD (Zorriehzahra and Banaederakhshan, 2015) Bệnh lần xuất Trung Quốc năm 2009, sau lan truyền đến Việt Nam năm 2010, Malaysia Thailand năm 2011, lan truyền đến Mexico năm 2013 (Tran Loc et al., 2014) Bệnh AHPND xãy khoảng 30 ngày sau thả giống, tỷ lệ chết lên đến 70% (Zorriehzahra and Banaederakhshan, 2015) Hiện nay, có số biện pháp để ngăn ngừa bệnh AHPND dùng hóa chất, kháng sinh chế phẩm sinh học Tuy nhiên, dùng hóa chất, kháng sinh hiệu khơng cao dễ gây ô nhiễm môi trường tồn lưu hóa chất kháng sinh thể thịt tơm Vì thế, cách tốt sử dụng chế phẩm sinh học Vi khuẩn lactic (LAB) ứng dụng rộng rãi ngày phổ biến việc sản xuất chế phẩm sinh học, bổ sung thức ăn động vật thủy sản, thức ăn chăn ni việc bón vào ao ni để ức chế lồi vi khuẩn gây bệnh cho động vật thủy sản Trong nghiên cứu lồi vi khuẩn hữu ích có số dòng vi khuẩn tiết chất ức chế đề kháng lại với vi khuẩn khác Lactobacillus sp kháng lại vi khuẩn Vibrio sp (Trịnh Hùng Cường, 2011); Lactobacillus suntoryeus LII1 có khả kháng mạnh Escherichia coli Bacillus cereus (Hồ Lê Huỳnh Châu ctv., 2010) Trong trình lên men, vi khuẩn lactic sinh acid hữu cơ, chúng ức chế vi khuẩn gây bệnh tác động lên tế bào chất vi khuẩn, ảnh hưởng đến chức bảo vệ màng tế bào (Fooks et al., 1999; Jay, 2000; Gerald, 1999; Kuipers et al., 2000) Các nghiên cứu vừa nêu LAB có khả tiết chất ức chế vi khuẩn gây bệnh Việc nghiên cứu khả phòng trị bệnh chủng vi khuẩn khả thi đặc biệt việc giảm thiểu ô nhiễm môi trường Vi thế, nghiên cứu thực nhằm mục đích sử dụng LAB đối kháng với V parahaemolyticus, gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm 1.2 Mục tiêu tổng qt Sưu tập chọn lọc chủng vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ ao nuôi tôm cá nước mặn nhằm tạo nguồn vi khuẩn hữu ích để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng cho nuôi trồng thủy sản 1.3 Mục tiêu cụ thể Sưu tập chọn lọc chủng vi khuẩn lactic từ ruột tôm thẻ, ruột cá rô phi bùn đáy ao nuôi tôm đối kháng mạnh với chủng vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) tôm he, từ sử dụng chúng để phòng bệnh AHPND đàn tôm nuôi 1.4 Ý nghĩa nghiên cứu Luận án sưu tập chọn lọc chủng vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ ruột cá rơ phi ruột tơm thẻ nhằm góp phần tạo nguồn vi khuẩn hữu ích có khả ngăn ngừa bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm nước lợ nói chung tơm thẻ nói riêng Đồng thời, chủng LAB sử dụng để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng cho ni trồng thủy sản, đóng góp vào phát triển nơng nghiệp theo hướng bền vững Luận án góp phần mở rộng hội cho người nuôi tôm giảm thiểu việc sử dụng thuốc hóa chất ni tơm vùng ven biển, đồng thời tạo sản phẩm giảm thiểu ảnh hưởng tiêu cực nghề nuôi đến môi trường xung quanh 1.5 Điểm luận án Luận án sàng lọc 12 chủng LAB có khả kháng tốt với V parahaemolyticus với đường kính vòng vơ khuẩn từ 16,5-18,5mm Trong có 05 chủng có khả kháng V parahaemolyticus tốt, đường kính vòng vơ khuẩn 17,5-18,5mm Luận án định danh chủng LAB có khả làm giảm thiểu đáng kể bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ni tơm thẻ chủng Lactobacillus plantarum trộn vào thức ăn Chủng vi khuẩn sử dụng để sản xuất chế phẩm sinh học Luận án xác định bổ sung thành phần acid glutamic, KH2PO4, K2HPO4, đường trehalose theo tỷ lệ C, N, P theo tỷ lệ 15, 0,1 làm tăng phát triển vi khuẩn gây bệnh hoại tử cấp tính, đồng thời làm tăng khả gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm thẻ CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phân lập LAB từ nhiều nguồn khác a) Phương pháp thu mẫu bảo quản mẫu Mẫu tôm thẻ thu tỉnh Trà Vinh, Bến Tre Sóc Trăng, tỉnh thu ao ao thu tôm Tôm lựa chọn thí nghiệm phải khỏe mạnh có kích cỡ khoảng 20g/con Mẫu cá rô phi thu ao lắng ao nuôi tôm kết hợp với kích cỡ khoảng 100 gam/con Địa điểm, cách thu mẫu cá rô phi thực giống thu mẫu tôm Mẫu bùn thu ao thu mẫu tơm thí nghiệm (Somiri et al., 2006) Trong ao, mẫu thu vị trí (đầu ao, ao, cuối ao) lượng bùn thu vị trí khoảng 100 g Mẫu thu vị trí ao trộn lại với (mẫu hổn hợp), giữ lạnh nước đá thùng xốp chuyển phòng thí nghiệm b) Phân lập vi khuẩn lactic từ ruột tôm, ruột cá rô phi bùn đáy ao nuôi tôm (Nirunya et al., 2008) Mẫu tôm cá rô phi rửa nước cất vơ o trùng khử trùng bên ngồi ethanol 70 , dùng dụng cụ giải phẫu để tách lấy tồn ruột tơm ruột trước cá rô phi cho vào ống nghiệm chứa mL nước muối sinh lý khử trùng Sau đó, dùng que thủy tinh nghiền mẫu đồng với nước muối sinh lý, để lắng khoảng phút sau hút mL lấy dịch cho vào mL mơi trường MRS broth có bổ sung 1,5% NaCl Đối với mẫu bùn, cân gam mẫu hỗn hợp cho vào ống nghiệm chứa mL nước muối sinh lý tiệt trùng, lắc mẫu máy trộn, để lắng, sau hút mL phần dịch cho vào ống nghiệm có chứa mL mơi trường MRS broth có bổ sung 1,5% NaCl o Các ống nghiệm nuôi cấy LAB ủ 28 C 48 Sau ủ, dịch ni pha lỗng thành -1 -2 -3 10 , 10 , 10 muối sinh lý Kế đến, hút 50 µL từ ống nghiệm có độ pha lỗng nêu trải lên mơi trường MRS agar (có bổ sung 1,5% NaCl CaCO3 1%) đem ủ 28 C 48 Sau tiến hành chọn khuẩn lạc có màu trắng đục khơng màu có khả làm tan CaCO3, cấy ria đĩa petri có chứa mơi trường MRS agar để tách ròng 3.3.2 Xác định tính đối kháng chủng vi khuẩn phân lập với vi khuẩn V parahaemolyticus điều kiện in vitro (Sivakumar et al., 2012) Vi khuẩn V paraheamolyticus ni sinh khối mơi trường TSB có bổ sung 1,5% NaCl 24 Sau sử dụng tăm tiệt trùng nhúng vào ống nghiệm nuôi vi khuẩn tán đĩa petri chứa mơi trường NA có bổ sung 1,5% NaCl, đặt vào tủ mát C khoảng Sau làm mát, đĩa petri đục lỗ để tạo giếng có đường kính mm Các chủng LAB (94 chủng) dùng thí nghiệm xác định tính đối kháng ni ống nghiệm có chứa mL MRS broth có bổ sung 1,5% NaCl, ủ 28 C 48 Tiếp theo hút 1mL dịch nuôi cấy cho vào ống tuýp (1,5 mL), ly tâm 10000 rpm 20 phút C để lấy phần dịch Sau hút 50 µL phần dịch bơm vào giếng Trên đĩa petri, bơm dịch vào giếng, giếng lại bơm vào nước cất vô trùng Các o đĩa petri sau ủ 28 C 24 Sau ủ, khả kháng V parahaemolyticus LAB xác định thơng qua hình thành vòng vơ trùng Mức độ kháng khẩn V parahaemolyticus LAB đánh giá dựa đường kính vòng vơ trùng (Sivakumar et al., 2012) 3.3.3 Thử nghiệm khả kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp bổ sung chủng LAB vào thức ăn Thí nghiệm tiến hành bể kính tích 30 L, bể thí nghiệm rửa nước sau khử trùng trước sử dụng Nguồn nước xữ lý lỗng với nước để có độ mặn 20‰ Tơm thẻ chân trắng kích cỡ trung bình khoảng 1g/con tiến hành bố trí thí nghiệm Trước bố trí, tơm kiểm tra phương pháp PCR, mẻ tôm không mang mầm bệnh WSSV AHPND Sau bố trí vào bể thí nghiệm, tôm dưỡng ngày cho quen với điều kiện môi trường Chủng vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Nguyễn Trọng Nghĩa ctv., 2015) phục hồi môi trường nutrient broth (NB, + Merck) có bổ sung 1,5% NaCl (NB ), sau ủ 28 C 18 Ghi nhận màu sắc hình dạng khuẩn lạc, nhuộm Gram để kiểm tra tính vi khuẩn Khuẩn lạc vi khuẩn nuôi tăng sinh môi trường + NB 28 C 18 – 24 sau xác định mật độ vi khuẩn máy so màu quang phổ bước sóng 610 nm Năm chủng LAB (T3.1, RP5.4.1, T4.2, RP5.5.1, RP6.5) xác định có khả kháng mạnh với vi khuẩn V parahaemolyticus nuôi sinh khối môi trường 100 mL MRS broth có bổ sung 1,5% NaCl 48 Điều chỉnh để đạt mật số 10 CFU/mL Tiếp đến, đem ly tâm LAB với tốc độ 7000 vòng phút, rửa lại lần nước muối sinh lý tiệt trùng, sau chủng LAB hòa vào 10 mL nước muối sinh lý trộn vào 100g thức ăn áo 1mL dầu mực bên Thức ăn cho vào túi ni lon, dán nhãn bảo quản C sử dụng Phương pháp cảm nhiễm thực theo phương pháp Loc Tran et al (2013) Tôm ngâm dung dịch vi khuẩn V parahaemolyticus mật độ x 10 CFU/mL 15 phút sau vớt bố trí vào bể thí nghiệm bổ sung vi khuẩn V parahaemolyticus với mật độ vi khuẩn nước bể 10 CFU/mL Đối với nghiệm thức đối chứng âm tiến hành ngâm tôm môi trường TSB (có bổ sung 1,5% NaCl) tiệt trùng cho vào bể không bổ sung vi khuẩn Mẫu gan tụy tơm dùng phân tích mơ bệnh học thu tơm có dấu hiệu lờ đờ, bỏ ăn, ruột rỗng sau ngày cảm nhiễm với V parahaemolyticus Ngoài ra, mẫu thu (3 con/bể) kết thúc thí nghiệm Các chủng LAB vi khuẩn V parahaemolyticus dùng thí nghiệm chủng sử dụng thí nghiệm Mục 3.3.3a Tuy nhiên, thí nghiệm chọn chủng có khả phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính chủng LAB1, LAB2 LAB5 để thực Thí nghiệm bố trí với 10 nghiệm thức Các bước thí nghiệm thực tương tự thí nghiệm mục 3.3.3a với 10 nghiệm thức: ĐCA: Tôm ăn thức ăn không bổ sung LAB không gây cảm nhiễm V parahaemolyticus, không bổ sung C, N, P ĐCA+CNP: không cảm nhiễm V parahaemolyticus, cho ăn thức ăn khơng chứa LAB, có bổ sung C, N, P ĐCD: có cảm nhiễm V parahaemolyticus, cho ăn thức ăn không chứa LAB, không bổ sung C, N, P ĐCD+CNP: có cảm nhiễm V parahaemolyticus, cho ăn thức ăn khơng chứa LAB, có bổ sung C, N, P LAB1+CNP: cho ăn thức ăn có bổ sung LAB1, khơng cảm nhiễm V parahaemolyticus, có bổ sung C, N, P VPLAB1+CNP: cho ăn thức ăn có bổ sung LAB1, có cảm nhiễm V parahaemolyticus, có bổ sung C, N, P LAB2+CNP: Cho ăn thức ăn có bổ sung LAB2, khơng cảm nhiễm V parahaemolyticus, có bổ sung C, N, P VPLAB2+CNP: Cho ăn thức ăn có bổ sung LAB2, có cảm nhiễm V parahaemolyticus, có bổ sung C, N, P LAB5+CNP: Cho ăn thức ăn có bổ sung LAB5, khơng cảm nhiễm V parahaemolyticus, có bổ sung C, N, P 10 VPLAB5+CNP: Cho ăn thức ăn có bổ sung LAB5, có cảm nhiễm V parahaemolyticus, có bổ sung C, N, P 10 Các tiêu theo dõi tương tự Mục 3.3.3a 3.3.4 Định danh chủng LAB có khả kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính Sản phẩm PCR gen 16S rRNA gởi đến công ty Nam Khoa giải trình tự Kết giải trình tự so sánh chương trình Blast search sở liệu ngân hàng gen NCBI để định danh loài vi khuẩn 3.4 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thu thập tính tốn giá trị trung bình, độ lệch chuẩn phần mềm Excel, so sánh khác biệt nghiệm thức theo phương pháp phân tích ANOVA nhân tố nhân tố với phép thử Duncan thông qua phần mềm SPSS 22.0 11 Chương 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập chủng LAB xác định tiêu hình thái, sinh lý sinh hóa 4.1.1 Phân lập LAB Trong tổng số 198 mẫu thí nghiệm tìm 94 chủng LAB phân lập từ ruột tôm, ruột cá rô phi bùn đáy ao nuôi tôm biển Trong tổng số 94 chủng LAB phân lập có 30 chủng LAB phân lập tỉnh Trà Vinh, 25 chủng phân lập tỉnh Sóc Trăng 39 chủng phân lập Bến Tre Số lượng LAB phân lập nhiều ruột tôm (51/94 chủng), ruột cá rô phi 41/94 chủng Số lượng LAB phân lập bùn đáy ao nuôi tôm 2/94 chủng 4.1.2 Xác định tiêu hình thái, sinh lý sinh hóa LAB Tất khuẩn lạc có khả làm tan CaCO chọn để xác định đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa cho thấý tất khuẩn lạc LAB có màu trắng đục, tròn, lồi, có kích cỡ 1-2 mm có khả làm tan CaCO3 sau 48 nuôi cấy môi trường MRS agar (bổ sung 1,5% NaCl 1% CaCO 3) Kết tương đồng với nghiên cứu Klaenhammer (1987) vi khuẩn lactic nhóm vi khuẩn Gram dương, chúng trực khuẩn ngắn hay que (rod) cầu khuẩn (cocci) không sinh bào tử 4.2 Kết xác định tính đối kháng vi khuẩn lactic với vi khuẩn V parahaemolyticus 12 Kết xác định tính đối kháng LAB với V parahaemolyticus Trà vinh thể qua Hình Hình 1: Khả kháng khuẩn LAB với V parahaemolyticus phân lập Trà Vinh Kết xác định tính đối kháng với V parahaemolyticus chủng LAB cho thấy hai chủng LAB có khả kháng với V parahaemolyticus đường kính kháng khuẩn yếu (+) nhỏ 11 mm 20 chủng LAB có khả kháng V parahaemolyticus mức trung bình (++), với đường kính vơ trùng (11.00 16.00 mm) Tám chủng LAB lại có khả kháng vi khuẩn V parahaemolyticus với vòng kháng khuẩn lớn (+++), đặc biệt chủng LAB phân lập từ ruột cá rơ phi ruột tơm RP5.4.1, RP5.5.1 T4.2 có vòng tròn kháng khuẩn lớn tương ứng 18,2±0,289 mm, 18 mm 17,5 mm Do đó, chủng LAB sử dụng làm chế phẩm sinh học Kết tương tự Nguyễn Văn Minh ctv (2014) nghiên cứu Bacillus polyfermenticus F27 đối kháng với vi khuẩn V 13 parahaemolyticus NT7 với đường kính lớn 18,5 mm có khả sử dụng làm chế phẩm sinh học Kết xác định tính đối kháng vi khuẩn lactic với V parahaemolyticus Sóc Trăng thể qua Hình A B Hình 2: Khả kháng khuẩn chủng LAB với V parahaemolyticus thu Sóc Trăng Nhìn chung, kết từ Hình cho thấy chủng LAB phân lập Sóc Trăng có khả kháng vi khuẩn V parahaemolyticus vòng kháng khuẩn khơng lớn từ 11-15mm Kết xác định tính đối kháng LAB với V parahaemolyticus Bến Tre thể qua Hình 4.3 A B 14 Hình 3: Khả kháng khuẩn LAB với V parahaemolyticus thu Bến Tre Kết từ biểu đồ có 14 chủng LAB có khả kháng vi khuẩn V parahaemolyticus với đường kính vơ trùng yếu (+) nhỏ 11.00 mm Hai mươi mốt chủng LAB có khả kháng với V parahaemolyticus với vòng kháng khuẩn trung bình (++) vòng kháng khuẩn 11.00-16.00 mm Bốn chủng lại có khả kháng mạnh với vi khuẩn V parahaemolyticus với đường kính vòng vơ trùng lớn 16 mm (+++) Chủng vi khuẩn tạo vòng kháng khuẩn lớn RP6.5 T3.1, chủng vi khuẩn phân lập từ ruột cá rô phi ruột tôm với vòng kháng khuẩn lớn 17 mm Điều khẳng định chủng vi khuẩn xác định có tiềm phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính chủng RP6.5 T3.1 Tóm lại, hầu hết vi khuẩn lactic có khả đối kháng với vi khuẩn V parahaemolyticus có chủng 15 lựa chọn sử dụng để phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm biển T3.1, RP5.4.1, T4.2, RP5.5.1, RP6.5 4.3 Thử nghiệm khả kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính chủng LAB bằng phương pháp cho ăn 4.3.1 Ảnh hưởng việc bổ sung LAB vào thức ăn lên tỷ lệ sống khả kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm thẻ chân trắng a) Ảnh hưởng LAB lên tỷ lệ sống tôm thẻ Khi bổ sung chủng LAB vào thức ăn, tỷ lệ sống tơm thẻ có cải thiện đáng kể Kết thể qua hình Hình Tỷ lệ sống tôm thẻ cho ăn thức ăn có bổ sung LAB Ghi chú: a, b, c, d : số liệu biểu thị cột có chữ khác thể khác biệt có ý nghĩa thống kê Số liệu Hình cho thấy tơm có tỷ lệ sống cao nghiệm thức bổ sung LAB5 (92,23%), nghiệm thức LAB2 (90%) thấp nghiệm thức VP+LAB3 16 (29,97%) nghiệm thức đối chứng dương (45,57%) Kết thí nghiệm trộn LAB vào thức ăn điều kiện không cảm nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus, tơm thẻ có tỷ lệ sống cao khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng âm Cụ thể nghiệm thức bổ sung LAB (LAB1, LAB2, LAB3, LAB4, LAB5) vào thức ăn, tỷ lệ sống 88,9; 90; 86,6; 82,23%; 92,23% Các nghiệm thức khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với đối chứng âm (87,77%) Kết tương tự nghiên cứu Aly et al (2008), Lactobacillus có khả làm tăng tỷ lệ sống động vật thủy sản bổ sung vào thức ăn Đối với nghiệm thức có cảm nhiễm V parahaemolyticus tỷ lệ sống tôm nghiệm thức VP+LAB1; VP+LAB2 VP+LAB5 tương đối cao khác biệt khơng có ý nghĩa nghiệm thức với (lần lượt 73,37%; 79,97%; 73,33%) với nghiệm thức đối chứng âm (87,77%) lại khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng dương (45,57%) Tóm lại, nghiệm thức có bổ sung LAB1; LAB2 LAB5, tỷ lệ sống tơm có cải thiện so với nghiệm thức đối chứng dương Điều tương đồng với nghiên cứu Scharifuzzaman et al (2011) bổ sung vi sinh vật có lợi vào đường ruột mang lại hiệu mặt dinh dưỡng, tăng đáp ứng miễn dịch khả đề kháng bệnh vật nuôi Kết nghiên cứu phù hợp với với nghiên cứu Natesan et al.(2012), cho tôm sú ăn vi khuẩn Lactobacillus điều kiện có cảm nhiễm vi khuẩn V alginolyticus, tỷ lệ sống cải thiện từ 20% lên đến 87% 10 ngày cảm nhiễm 17 Tóm lại, bổ sung chủng LAB1; LAB2 LAB5 vào thức ăn tỷ lệ sống tôm tăng lên đáng kể kể điều kiện có cảm nhiễm V parahaemolyticus b) Kết phân tích mơ bệnh học Kết phân tích mơ học mẫu tơm thí nghiệm cho thấy mẫu tôm không cảm nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus vùng gan tụy tơm bình thường với cấu trúc hình ống gan tụy diện loại tế bào B, R,và F (Hình A, B) Trong đó, số nghiệm thức có cảm nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus có biến đổi vùng gan tụy với mức độ ảnh hưởng tùy thuộc theo nghiệm thức Ở nghiệm thức đối chứng dương có 70% mẫu gan tụy tơm thu có biểu số biến đổi đặc trưng vùng gan tụy mẫu tôm tương tự mô tả Lightner et al., (2012) tôm bệnh hoại tử gan tụy cấp tính cấu trúc mơ gan tụy bị biến đổi, ống gan tụy khơng có tế bào B, F R số tế bào ống gan tụy có nhân to khác thường, tế bào gan thối hóa rơi vào lòng ống, xuất melanin hóa vùng hoại tử (Hình C, D) 30% mẫu gan tụy tơm lại có biểu tế bào B, R, F bị giảm số lượng mẫu mơ phân tích Kết tương tự ghi nhận nghiệm thức VP+LAB3 VP+LAB4, nghiệm thức tìm thấy 40% số mẫu gan tụy tơm thu có biểu bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm ống gan tụy teo, giảm số lượng tế bào B, R, F, tế bào gan thối hóa rơi vào lòng ống 60% số mẫu gan tụy tơm lại khơng có dấu hiệu bệnh lý bệnh hoại tử gan tụy cấp tính Trong đó, hiệu nghiệm thức bổ sung LAB vào thức ăn lên bệnh hoại tử gan tụy cấp tính thể thơng qua phân tích mơ bệnh học nghiệm thức VP+LAB1, VP+LAB2 VP+LAB5 có cải 18 thiện đáng kể Các biến đổi gan tụy nghiệm thức tương ứng cho thấy 20, 30, 20% mẫu gan tụy tơm có biểu giảm tế bào B, R, F ống gan tụy bị teo Tất mẫu gan tụy lại có dấu hiệu bình thường tương tự đối chứng âm Nhìn chung, mức độ nhiễm bệnh hoại tử gan tụy cấp tính nghiệm thức VP+LAB1, VP+LAB2 VP+LAB5 thấp so với nghiệm thức cảm nhiễm khác, đồng thời tỉ lệ biểu bệnh thấp với đa số mẫu gan tụy có dấu hiệu bình thường Hình 5: Mơ bệnh học tơm thí nghiệm A, B: Mô gan tôm khỏe 19 4.3.2 Thử nghiệm khả kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính chủng LAB có bổ sung C, N, P (acid glutamic, KH2PO4, K2HPO4, đường trehalose) vào môi trường thí nghiệm a) Ảnh hưởng LAB lên tỷ lệ sống Kết xác định tỷ lệ sống tơm cảm nhiễm V parahaemolyticus điều kiện có bổ C, N, P bổ sung chủng LAB thể qua Hình Hình 6: Tỉ lệ sống tôm thẻ chân trắng sau 14 ngày cảm nhiễm Kết rằng, nghiệm thức có bổ sung C, N, P vào mơi trường nước tỷ lệ sống lại thấp khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức không bổ sung C, N, P Tỷ lệ sống thấp nghiệm thức ĐCD+CNP 53,33%, nghiệm thức ĐCD (50%) cao nghiệm thức đối chứng âm không bổ sung C, N, P bổ sung C, N, P 88,2% 82,5% Đối với nghiệm thức bổ sung LAB vào thức ăn tỷ lệ sống tăng lên cao khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng dương thể cụ thể sau: tỷ 20 lệ sống cao nghiệm thức cho ăn chủng LAB1 trường hợp không cảm nhiễm cảm nhiễm V parahaemolyticus 76,7 75% Tỷ lệ sống giảm nghiệm thức cho ăn chủng LAB2 76,3 66% tỉ lệ sống thấp nghiệm thức cho ăn vi khuẩn LAB5 69,2 67% Vậy, bổ sung chủng LAB1 vào thức ăn cho tôm, tỉ lệ sống đạt cao so với chủng LAB thí nghiệm Theo kết nghiên cứu Andlid et al (1995), Balcázar et al (2006) cho sinh vật ăn LAB, chúng làm tăng hệ thống miễn dịch để chống lại mầm bệnh vi sinh vật Ngoài ra, vi khuẩn lactic có khả ức chế trì điện màng tế bào, ức chế vận chuyển, giảm pH nội bào ức chế hàng loạt chức trao đổi chất (Ross et al., 2002) b) Kết phân tích mơ bệnh học Kết phân tích mô học cho thấy 100% mẫu tôm không cảm nhiễm V parahaemolyticus bình thường với diện số lượng lớn không bào (tế bào B) tế bào dự trữ (tế bào R) (Hình 4.7A) Trái lại, nghiệm thức có cảm nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus có biến đổi vùng gan tụy với mức độ ảnh hưởng tùy thuộc theo nghiệm thức Tôm nghiệm thức ĐCD, ĐCD+CNP, VPLAB1+CNP, VPLAB2+CNP, VPLAB5+CNP sau cảm nhiễm V parahaemolyticus ngày xác định có 7/9, 8/9, 3/9, 5/9, 4/9 mẫu gan tụy tơm có dấu hiệu bệnh tích điển hình AHPND tương tự mơ tả Lightner et al, (2012) tôm bệnh hoại tử gan tụy cấp tính như: cấu trúc mơ gan tụy bị biến đổi, ống gan tụy khơng có tế bào B, F R tế bào gan thoái hóa rơi vào lòng ống, xuất hiện tượng melamin hóa vùng gan hoại tử xuất tế bào máu quanh cụm vi khuẩn vùng bị 21 hoại tử (Hình 7B) Sau lần thu mẫu thứ nhất, phát tơm có dấu hiệu lờ đờ, bỏ ăn màu sắc nhạt màu, tiến hành thu mẫu phân tích mơ bệnh học Kết cho thấy 60% mẫu tôm thu nghiệm thức ĐCD ĐCD+CNP có dấu hiệu bệnh hoại tử gan tụy cấp ống gan tụy teo, giảm số lượng tế bào B, R, F, tế bào gan thối hóa rơi vào lòng ống Tương tự, nghiệm thức VPLAB1+CNP; VPLAB2+CNP, VPLAB5+CNP cho thấy có 20, 40, 40% mẫu gan tụy tơm có dấu hiệu tương tự Tuy nhiên, đến kết thúc thí nghiệm hầu hết mẫu gan tụy tơm phân tích mơ bệnh học có dấu hiệu bình thường ngoại trừ mẫu gan tụy nghiệm thức ĐCD+CNP có biểu giảm số lượng tế bào B, R, F, tế bào gan bị thối hóa rơi vào lòng ống Tóm lại, nghiệm thức cho ăn LAB cảm nhiễm V Parahaemolyticus gan tụy tơm bị ảnh hưởng cảm nhiễm AHPND từ làm giảm tỉ lệ tơm chết Hình 7: Hình Kết mô học gan tụy tôm 22 4.5 Kết định danh LAB có khả kháng mạnh với vi khuẩn V parahaemolyticus Chủng vi khuẩn định danh phòng xét nghiệm Nam Khoa - Biotek Kết định danh chủng LAB1 phương pháp giải trình tự gen 16s thể sau: Hình 8: Giải trình tự đoạn gen 16S-rRNA chủng vi khuẩn LAB1 Đoạn gen so sánh với trình tự gen 16 rRNA ngân hàng gen thông qua phần mềm BLASTN Kết cho thấy trình tự gen 16S - rRNA chủng vi khuẩn LAB1 L plantarum với mức độ định danh đến 100% Điều kết luận chủng vi khuẩn LAB1 L plantarum Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Kết phân lập sàng lọc 94 chủng LAB xác định chủng có khả kháng với V parahaemolyticus mạnh với vòng kháng khuẩn xác định từ 17-18,5 mm phương pháp khuếch tán giếng thạch Khi bổ chủng LAB1; LAB2, LAB5 vào thức ăn làm tăng tỷ lệ sống khả kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm Khi bổ sung acid glutamic, đường Trehalose, KH2PO4 K2HPO4 với tỷ lệ C, N, P 15, 1, 0,1 vào môi 23 trường nước thí nghiệm làm tăng tỷ lệ chết tơm đồng thời làm gia tăng khả bùng phát bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm thẻ Việc bổ sung chủng LAB vào thức ăn đặc biệt chủng LAB1 có khả làm giảm thấp tỉ lệ chết tôm đồng thời làm hạn chế bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm thẻ bổ sung C, N, P cảm nhiễm V parahaemolyticus Chủng LAB1 sử dụng để sản xuất chế phẩm sinh học việc phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm Kết định danh chủng LAB1 phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S-rRNA xác định chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum 5.2 Đề xuất Thử nghiệm xác định khả kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính chủng LAB1 ao nuôi tôm thẻ thâm canh 24 ... với vòng kháng khuẩn lớn 17 mm Điều khẳng định chủng vi khuẩn xác định có tiềm phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính chủng RP6.5 T3.1 Tóm lại, hầu hết vi khuẩn lactic có khả đối kháng với vi khuẩn. .. cụ thể Sưu tập chọn lọc chủng vi khuẩn lactic từ ruột tôm thẻ, ruột cá rô phi bùn đáy ao nuôi tôm đối kháng mạnh với chủng vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) tơm... phát bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm thẻ Vi c bổ sung chủng LAB vào thức ăn đặc biệt chủng LAB1 có khả làm giảm thấp tỉ lệ chết tôm đồng thời làm hạn chế bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm thẻ