Thử nghiệm hoạt tính enzyme

Giới thiệu Enzyme protein hoạt động chất xúc tác Liên kết với chất thành lập phức hệ enzyme chất  Làm giảm lượng hoạt hóa  Sản phẩm thường tạo cuối phản ứng  Giới thiệu   Chương Thử nghiệm enzyme Enzyme thường xúc tác phản ứng chuyên biệt quan trọng như: o o o o  dẫn truyền thần kinh, co cơ, dị hóa chất dinh dường, tạo lượng, Enzyme tìm thấy tất mô, huyết thanh, tế bào bị tổn thương, tế bào bị phân hủy Tính chất chung enzymeac Enzyme có cấu trúc bậc 1, 2, giống protein  Trung tâm hoạt động→ nơi tương tác với chất  Trung tâm dị lập thể o Vị trí gắn cofactor phân tử điều hòa  Cofactor  Phần khơng phải protein enzyme • Các chất hoạt hóa vơ – Các ion Cl-, Mg2+,… • Coenzyme hữu – Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD),… M Zaharna Clin Chem 2009 Phân loại enzyme thể Enzyme chuyên biệt huyết tương/ huyết tương a Phân loại enzyme thể b  Sự 1) Một số tiết vào huyết tương 2) Enzyme tham gia trình biến dưỡng tế bào, nồng độ thấp huyết tương Enzyme huyết tương: có chức chun biệt huyết tương phóng thích enzyme vào máu o Sự phóng thích enzyme từ tế bào o Sản phẩm enzyme • Ví dụ: tăng hoạt động tế bào osteoblast tăng hoạt động enzyme bệnh liên quan đến xương – Sự tăng nồng độ enzyme tế bào nguyên nhân phá hủy chết tế bào 1) Huyết tương nơi hoạt động bình thường enzyme 2) Nồng độ enzyme huyết tương cao nơi khác 3) Thường tổng hợp gan Ví dụ: cholinesterase, plasmin, thrombin  Vòng đời enzyme o Chu kỳ bán rã enzyme từ vài đến nhiều ngày Đo nồng độ enzyme Các yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ enzyme máu o Nồng độ chất o Nồng độ enzyme o pH o Nhiệt độ o Cofactor o Chất ức chế Enzyme khơng có huyết tương Các yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ enzyme máu Đo nồng độ enzyme        Enzyme thường có nồng độ thấp dịch sinh học (dịch bào, dịch mô, dịch thể,…) nên thường khó phân lập enzyme Nên enzyme thường không đo cách trực tiếp Enzyme thường đo hoạt tính xúc tác Đo tỷ lệ xúc tác enzyme để biến đổi chất thành sản phẩm Hoạt tính enzyme phản ánh nồng độ enzyme Hoạt tính enzyme tỷ lệ với nồng độ enzyme Hoạt tính enzyme khảo sát cách đo: o Sự tăng sản phẩm o Sự giảm chất o Sự giảm coenzyme o Sự tăng chất biến đổi coenzyme Đo nồng độ enzyme (coenzyme phổ biến ) (dạng khử) hấp thu ánh sáng 340 nm  NAD (dạng oxy hóa) KHƠNG hấp thu 340 nm  NADH o Sự tăng (hoặc giảm) nồng độ NADH nguyên nhân làm thay đổi độ hấp thu (Absorbance, A ) 340 nm Các phương pháp đo enzyme  Phương pháp khảo sát theo thời gian o Đo thay đổi độ hấp thu quang phổ suốt thời gian phản ứng o Đo nhiều mức thời gian (thường 30 giây 60 giây) o Hoặc đo thay đổi liên tục độ hấp thu quang phổ o Khảo sát theo thời gian thuận lợi so với cố định thời gian khảo sát tiến trình phản ứng Điều kiện khảo sát o Sự tăng mức chất cofactors coenzymes • Lượng enzyme tăng cách bất thường o Nhiệt độ pH thích hợp o Chất ức chế thiếu o Nhiệt độ phải ổn định (±0.1°C) suốt trình thử nghiệm nhiệt độ enzyme hoạt động tối thích Các phương pháp đo enzyme  Phương pháp khảo sát theo thời gian o Độ hấp thu quang phổ đo nhiều mức thời gian, nên có nhiều số liệu nhiều thời điểm khảo sát → tăng tính xác thử nghiệm o Khảo sát liên tục thường lựa chọn nhiều độ lệch chuẩn kiểm sốt Các phương pháp đo enzyme  Phương pháp cố định thời gian o Thời gian phản ứng xác định tối ưu o Phản ứng phải “dừng” (thường acid yếu) o Thời gian thử nghiệm thường dài thời gian phản ứng, thể tích phản ứng lớn, nhiều enzyme diện Đo hoạt tính enzyme (Unit)  Đo hoạt tính enzyme (không phải nồng độ) o IU = lượng enzyme để biến đổi μmol chất phút điều kiện tối ưu o Thường biểu diễn IU / L  Đơn vị SI = Katal = mol/giây o moles chất biến đổi giây o Thường biểu diễn katal/ liter (kat / L) o IU = 17nkat Một số ví dụ thử nghiệm enzyme Sự hấp thu quang phổ chất sản phẩm Phương pháp quang phổ o Nhiều chất sản phẩm enzyme hấp thu ánh sáng trắng (visible) U.V o Đa số chất sản phẩm phản ứng có hấp thu quang phổ bước sóng khác o Khi phản ứng có xúc tác enzyme chất giảm, sản phẩm tăng kèm theo thay đổi độ hấp thu tương ứng với chất sản phẩm M Zaharna Clin Chem 2009 Sự thay đổi độ hấp thu quang phổ coenzyme dạng khử dạng oxy hóa Giảm hấp thu 450 nm Hấp thu mạnh 450 nm Sự thay đổi độ hấp thu quang phổ coenzyme dạng khử dạng oxy hóa NADH: hấp thu 340 nm NAD+: không hấp thu 340 nm Sự giảm độ hấp thu quang phổ NADH/ phút xem hoạt tính enzyme Sự thay đổi độ hấp thu quang phổ coenzyme dạng khử dạng oxy hóa NADPH: hấp thu 340 nm NAPD+: không hấp thu 340 nm Sự tăng độ hấp thu quang phổ NADH/ phút xem hoạt tính enzyme Đo gián tiếp thay đổi độ hấp thu quang phổ phản ứng kết hợp Đo gián tiếp thay đổi độ hấp thu quang phổ phản ứng kết hợp Khi phản ứng khảo sát khơng có thay đổi độ hấp thu quang phổ  Phương pháp quang phổ sử dụng cách thêm vào enzyme tinh khiết để biến đổi sản phẩm phản ứng mà có thay đổi độ hấp thu quang phổ đo  Hoạt tính enzyme phản ứng thứ xác định gián tiếp thông qua phản ứng thứ hai NADH: hấp thu 340 nm NAD+: không hấp thu 340 nm Một số ví dụ thử nghiệm enzyme Một số ví dụ thử nghiệm enzyme Đo gián tiếp thay đổi độ hấp thu quang phổ phản ứng kết hợp  Phương pháp fluorescence o Fluorescence phát sáng chất sau hấp thu ánh sáng o Sử dụng máy đo fluorescence ATP ADP hấp thu 260 nm Sự tăng độ hấp thu quang phổ NADH/ phút phản ứng thứ hai xem hoạt tính enzyme phản ứng thứ Phương pháp fluorescence ATP Fluorescence peptide substrate Phương pháp fluorescence ATP ADP Kinase Một số ví dụ thử nghiệm enzyme OPO3 Trạng thái FP thấp Fluorescence peptide substrate Phosphopeptide product OPO3 ADP Kinase OPO3 Trạng thái FP thấp Phosphopeptide product OPO3 NAD(P)H, FADH2: dạng khử, không fluorescense NAD(P), FAD: dạng oxy hóa, fluorescence xanh dương OPO3 Ligand MIII Trạng thái FP cao Trạng thái FP cao OPO3 Ligand MIII OPO3 Linker Sensitizer Một số ví dụ thử nghiệm enzyme Một số ví dụ thử nghiệm enzyme Phương pháp fluorescence o Thường sử dụng fluorescence phản ứng enzyme oxy hóa khử o Phản ứng oxy hóa làm giảm fluorescence o Phản ứng khử: tăng fluorescence Một số ví dụ thử nghiệm enzyme Thử nghiệm độ nhạy protease Kinase OPO  Thuận lợi phương pháp fluorescence o Nhạy phương pháp quang phổ o Phát enzyme với lượng nhỏ o Ít độc so với phương pháp khác (đồng vị) Một số ví dụ thử nghiệm enzyme ATP ADP [33P]ATP ADP Phosphopeptide product O2 Luciferin Ánh sáng  620 OPO3 Một số ví dụ thử nghiệm enzyme Phương pháp Manometric OPO ADP ATP OPO3 Kinase Phát ATP Phosphopeptide product Protease Phương pháp đồng vị phóng xạ Phương pháp fluorescence Kinase Một số ví dụ thử nghiệm enzyme Oxyluciferin + CO2 + AMP + PPi   Sử dụng manometer Thuận lợi xác phản ứng có thành phần khí o Oxidase: O2 o Decarboxylase: CO2 Acid amin Một số ví dụ thử nghiệm enzyme Một số ví dụ thử nghiệm enzyme Phương pháp điện cực (Electrode)   Sử dụng cho phản ứng có tạo acid Sử dụng pH kế để đo thay đổi nồng độ H+ (trong phản ứng enzyme, thay đổi pH tiến trình phản ứng) Phương pháp điện cực (Electrode) Pyruvate + NAD+ Lactate + NADH + H+ • Enzyme lactate dehydrogenase • Đo pH: – Phản ứng theo chiều thuận: pH 7,1 – 7,4 – Phản ứng theo chiều nghịch: pH 8,3 – 8,9 Phát triển thử nghiệm Xác định cấu thử nghiệm Cơ chế chuẩn hoạt động thuốc o Cơ chế hoạt động chất ức chế o Các khái niệm chế ức chế ứng dụng để khám phá thuốc • Sự ức chế với chất ligand điều kiện cân bằng/ ổn định • Sự ức chế vị trí khác với vị trí gắn chất • Sự ức chế trạng thái cân hoạt động Sự hiểu biết chế, động học, quan sát thử nghiệm  Tiến hành thử nghiệm (matrix): xác định pH, dung dịch đệm, tiêu liên quan đến phát tín hiệu  Chọn thể tích phản ứng phù hợp  Đánh giá quy trình sàng lọc thử nghiệm thăm dò, xác định chất lượng thử nghiệm dựa hiệu suất phản ứng, chất chuẩn tiêu khác  Phát triển thử nghiệm Xác định cấu thử nghiệm  Cơ  Phát triển thử nghiệm Các vấn đề cần xem xét phát triển thử nghiệm enzyme chế chuẩn hoạt động thuốc o Hạn chế chế ứng dụng (1) Sự tích tụ chất  Giảm hiệu suất chất ức chế cạnh tranh o Khắc phục • Sử dụng chế ức chế hoạt động: khởi đầu gắn chất ức chế  hoạt động khối lượng cân Khi chất ức chế gắn hoàn toàn hoạt động hệ thống bị ngăn cản cân đạt • Cải biến hóa trị thuốc/ trung tâm hoạt động enzyme chất ức chế (chất ức chế dựa chế) Phát triển thử nghiệm Ứng dụng chế hoạt động thiết kế thử nghiệm Chất ức chế dị lập thể Chất ức chế cạnh tranh  Dạng bất hoạt hoạt động enzyme   Thời gian ủ, nồng độ chất, trình tự chất thêm vào phản ứng Phát triển thử nghiệm Phát triển thử nghiệm Phát triển thử nghiệm Ứng dụng chế hoạt động thiết kế thử nghiệm Ứng dụng chế hoạt động thiết kế thử nghiệm  Các bước quan trọng thiết kế thử nghiệm Ứng dụng chế hoạt động thiết kế thử nghiệm  Mỗi dạng có thuận lợi riêng, lựa chọn thử nghiệm phụ thuộc vào sinh học bệnh o Chất ức chế cạnh tranh vị trí gắn ATP kháng thuốc, hiệu quả, chọn lọc thấp, ảnh hưởng đến hoạt động tế bào o Chất ức chế cạnh tranh vị trí gắn chất thường khó block tương tác với phân tử nhỏ (peptideenzyme) bề mặt lớn o Chất ức chế dị lập thể thường hiệu chọn lọc cao, dễ dẫn đến tượng kháng thuốc Khó lựa chọn dạng thử nghiệm enzyme có tương thích sinh học cao Phát triển thử nghiệm Các tiêu tối ưu hóa thử nghiệm enzyme o o o o o o o o o o Enzyme pH Co-factor Cơ chất Thời gian Mg, Mn Dung dịch đệm Chất tẩy rửa Protein mang Kháng thể  o Tìm thời gian ủ thích hợp enzyme với chất  thời gian thích hợp cho quy trình sàng lọc  khó khăn chuẩn bị enzyme không ổn định o Ủ enzyme kinase với ATP để hoạt hóa enzyme  “stock” enzyme  pha loãng thực phản ứng  Phân biệt chất ức chế cạnh tranh không với ATP thay đổi nồng độ ATP  IC50 % ức chế Phát triển thử nghiệm Giảm khả can thiệp không tốt tới hoạt động chất ức chế cạnh tranh o Nồng độ chất (Km) o Động học enzyme o Hệ số gắn enzyme chất Phát triển thử nghiệm Dung dịch đệm dung môi Thời gian ủ Nồng độ chất tẩy rửa, dung dịch đệm, protein mang, chất khử …ảnh hưởng đến tín hiệu phát đường biểu diễn đáp ứng  Sự lựa chọn dung dịch đệm thích hợp cho phản ứng cần thiết, tham khảo khảo sát trước tiến hành thử nghiệm   Thời gian ủ bước khác phụ thuộc vào động học enzyme, thường từ 10 phút đến 15  Tỷ lệ phản ứng tăng, tăng nồng độ enzyme nhiệt độ thời gian ủ giảm Phát triển thử nghiệm Nồng độ dimethylsulfoside (DMSO) Phần lớn chất cần kiểm tra tan tốt DMSO, ảnh hưởng DMSO đến phản ứng cần kiểm tra  Các phản ứng enzyme, phản ứng gắn phân tử sinh học nồng độ DMSO sử dụng từ 5% đến 10%  Các thử nghiệm dựa tế bào nồng độ 0,5%  ... Phát triển thử nghiệm Phát triển thử nghiệm Phát triển thử nghiệm Ứng dụng chế hoạt động thiết kế thử nghiệm Ứng dụng chế hoạt động thiết kế thử nghiệm  Các bước quan trọng thiết kế thử nghiệm Ứng... thường đo hoạt tính xúc tác Đo tỷ lệ xúc tác enzyme để biến đổi chất thành sản phẩm Hoạt tính enzyme phản ánh nồng độ enzyme Hoạt tính enzyme tỷ lệ với nồng độ enzyme Hoạt tính enzyme khảo sát... trình sàng lọc thử nghiệm thăm dò, xác định chất lượng thử nghiệm dựa hiệu suất phản ứng, chất chuẩn tiêu khác  Phát triển thử nghiệm Xác định cấu thử nghiệm  Cơ  Phát triển thử nghiệm Các vấn