Nghiên cứu tách chiết chất màu tự nhiên từ thực vật và ứng dụng trong thực phẩm

Lê Hoàng Lâm, các thầy, cô, bạn bè đồng nghiệp tại Trung tâm Phân tích và Chứng nhận chất lượng sản phẩm nông nghiệp Hà Nội, Chi cục Quản lý Chất lượng Nông lâm sản và Thủy sản Hà Nội và

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS LÊ HOÀNG LÂM

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là kết quả công trình nghiên cứu của bản thân, được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết, kiến thức và các thí nghiệm thực tế dưới

sự hướng dẫn khoa học của TS Lê Hoàng Lâm, không sao chép của người khác Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn này là trung thực Tất cả những tài liệu tham khảo đều có xuất xứ rõ ràng và được trích dẫn hợp pháp

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm cho lời cam đoan của mình./

Học viên

Tạ Văn Duẩn

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn của TS Lê Hoàng Lâm; Sự giúp đỡ của các thầy, các cô thuộc Bộ môn Quản Lý Chất Lượng, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm (Trường Đại học Bách Khoa

Hà Nội); Sự giúp đỡ tạo điều kiện của lãnh đạo, cán bộ, nhân viên Trung tâm Phân tích và Chứng nhận chất lượng sản phẩm nông nghiệp Hà Nội, Chi cục Quản lý Chất lượng Nông lâm sản và Thủy sản Hà Nội

Nhân dịp này Tôi xin được bày tỏ sự biết ơn chân thành tới: TS Lê Hoàng Lâm, các thầy, cô, bạn bè đồng nghiệp tại Trung tâm Phân tích và Chứng nhận chất lượng sản phẩm nông nghiệp Hà Nội, Chi cục Quản lý Chất lượng Nông lâm sản và Thủy sản Hà Nội và người thân trong gia đình đã tạo mọi điều kiện tốt nhất và kịp thời động viên, hỗ trợ tôi trong những lúc khó khăn để tôi hoàn thành các nội dung nghiên cứu của luận văn./

Hà Nội, ngày 15 tháng 02 năm 2017

Học viên

Tạ Văn Duẩn

MỤC LỤC

Trang LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH M ỤC KÝ TỰ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

LỜI MỞ ĐẦU 1

1.Tính cấp thiết của luận văn 1

2 Lý do lựa chọn luận văn 2

3 Mục tiêu của luận văn 2

4 N ội dung nghiên cứu luận văn 2

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về chất màu tự nhiên 3

1.2 Giới thiệu về cây Dong 3

1.2.1 Đặc điểm hình thái 3

1.2.2 Phân bố 4

1.2.3 Mục đích sử dụng 4

1.3 Chlorophyll 5

1.3.1 Định nghĩa 5

1.3.2 Cấu trúc của Chlorophyll 6

1.3.3 Các tính chất của Chlorophyll 7

1.3.3.1 Tính chất vật lý 7

1.3.3.2 Tính quang hóa 7

1.3.3.3 Tính chất hóa học 8

1.3.3.4 Sự mất màu của Chlorophyll 8

1.3.4 Sự biến đổi của Chlorophyll 9

1.3.5 Định lượng Chlorophyll 9

1.3.6 Phẩm màu Chlorophyll và các phức chất của nó 10

1.3.6.1 Phẩm màu Chlorophyll 10

1.3.6.2 Phẩm màu Chlorophyll phức đồng 10

1.3.6.3 Phẩm màu muối Natri, Kali của Chlorophyll phức đồng 11

1.3.7 Ứng dụng của Cholorophyll 12

1.4 Tình trạng nghiên cứu và sản xuất Cholorophyll 13

1.4.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất Cholorophyll trên thế giới 13

1.4.1.1 Tổng quát 13

1.4.1.2 Một số chế phẩm thương mại 15

1.4.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất Chlorophyll ở Việt Nam 16

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng và nguyên vật liệu 18

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.2 Chuẩn bị nghiên cứu 18

2.1.3 Hóa chất và thiết bị 18

2.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết chlorophyll 18

2.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng Chlorophyll 18

2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ Dung môi/nguyên liệu (DM/NL) đến hàm lượng Chlorophyll thu được 18

2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới hàm lượng Chlorophyll thu được 19 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian tách chiết tới hàm lượng Chlorophyll thu được 19

2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết tới hàm lượng Chlorophyll thu được 20

2.3 Phương pháp xác định hàm lượng muối natri của đồng Chlorophyllin 21

2.4 Phương pháp xác định đặc tính của các chế phẩm Chlorophyllin 21

2.4.1 Phương pháp xác định độ ẩm của lá dong 21

2.4.2 Tỷ lệ thu nhận chế phẩm Chlorophyllin 21

2.4.4 Độ ẩm của chế phẩm 22

2.5 Nghiên cứu điều kiện ứng dụng của chế phẩm muối natri của đồng Chlorophyllin và chế phẩm Chlorophyllin 22

2.5.1 Xác định bước sóng hấp thụ cực đại của chế phẩm 22

2.5.2 Ảnh hưởng của pH môi trường trong ứng dụng nhuộm màu chế phẩm 23 2.5.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự biến đổi màu của các chế phẩm 23

2.5.4 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến chất lượng chế phẩm 24

2.6 Phương pháp xác định các chỉ tiêu tồn dư kim loại của chế phẩm Chlorophyllin và chế phẩm muối natri của đồng Chlorophyllin 24

2.6.1 Xác định tồn dư Cu tổng số của chế phẩm muối natri của đồng Chlorophyllin 24

2.6.2 Xác định tồn dư Pb của chế phẩm Chlorophyllin và muối natri của đồng Chlorophyllin 26

2.6.3 Xác định tồn dư As của chế phẩm Chlorophyllin và muối natri của đồng Chlorophyllin 27

2.7 Phương pháp ứng dụng nhuộm màu 28

2.7.1 Khảo sát tỷ lệ phối trộn chế phẩm màu vào sản phẩm bánh dẻo 28

2.7.2 Đánh giá cảm quan bằng phương pháp cho điểm thị hiếu 29

2.7.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến sự thay đổi màu của chế phẩm Chlorophyllin sau khi bổ sung vào sản phẩm bánh dẻo 29

2.8 Ứng dụng chế phẩm muối natri của đồng Chlorophyllin vào một số sản phẩm thực phẩm 30

2.8.1 Ứng dụng chế phẩm muối natri của đồng Chlorophyllin tạo màu xanh cho thạch 30

2.8.2 Ứng dụng chế phẩm muối natri của đồng Chlorophyllin tạo màu xanh cho bánh bao 30

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết Chlorophyll 31

3.1.1 Khảo sát ảnh hường của tỷ lệ DM/NL đến hàm lượng Chlorophyll thu được

31

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới hàm lượng Chlorophyll thu được 32 3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng Chlorophyll thu được 35

3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng Chlorophyll thu được 36 3.2 Đề xuất các quy trình thu nhận chế phẩm màu 38

3.2.1 Phương pháp thu nhận chế phẩm Chlorophyllin 38

3.2.2 Quy trình thu nhận chế phẩm muối natri của đồng Chlorophyllin 40

3.3 Xác định hàm lượng muối natri của đồng Chlorophyllin 41

3.4 Khảo sát chế độ ứng dụng và bảo quản chế phẩm muối natri của đồng Chlorophyllin 42

3.4.1 Ảnh hưởng của pH môi trường 42

3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 42

3.4.3 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản 44

3.5 Xác định đặc tính của chế phẩm Chlorophyllin 44

3.6 Khảo sát điều kiện sử dụng và bảo quản của chế phẩm Chlorophyllin 45

3.6.1 Ảnh hưởng của pH môi trường 45

3.6.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 46

3.6.3 Ảnh hưởng của thời gian đến chất lượng chế phẩm chlorophyllin 48

3.6.4 So sánh đặc tính chế phẩm Chlorophyllin và muối natri của đồng Chlorophyllin 49

3.7 Xác định các chỉ tiêu tồn dư kim loại của chế phẩm Chlorophyllin và muối natri của đồng chlorophyllin 50

3.7.1 Xác định tồn dư Cu tổng số của chế phẩm muối natri của đồng Chlorophyllin 50

3.7.2 Xác định tồn dư Pb của chế phẩm Chlorophyllin và muối natri của đồng Chlorophyllin 51

3.7.3 Xác định tồn dư As của chế phẩm Chlorophyllin và muối natri của đồng

Chlorophyllin 53

3.8 Ứng dụng nhuộm màu 55

3.8.1 Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ phối trộn chế phẩm màu đến màu sắc của bánh dẻo 55

3.8.2 Khảo sát màu sắc sản phẩm bánh dẻo theo thời gian bảo quản 57

3.9 Ứng dụng chế phẩm muối natri của đồng Chlorophyllin vào một số sản phẩm thực phẩm 58

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

4.1 Kết luận 59

4.2 Kiến nghị 59

T ÀI LIỆU THAM KHẢO 60

CÔNG TRÌNH KHOA H ỌC ĐÃ CÔNG BỐ 62

DANH M ỤC KÝ TỰ VIẾT TẮT

1 INS (International Numbering System): Hệ thống chỉ số đánh số phụ gia

2 ADI (Acceptable daily intake): Lượng ăn vào hàng ngày chấp nhận được

3 CXĐ: Chưa xác định

4 VNĐ: Việt Nam Đồng

5 TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam

6 QCVN: Quy chuẩn Việt Nam

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Lá dong 4

Hình 1.2 Chlorophyll dưới kính hiển vi 5

Hình 1.3 Cấu tạo phân tử Chlorophyll 6

Hình 1.4 Phổ hấp thụ của Chlorophyll a và b 7

Hình 1.5 Sự biến đổi của Chlorophyll 9

Hình 1.6 Chế phẩm natri đồng Chlorophyllin 15

Hình 1.7 Sản phẩm Liquid Chlorophull 32oz 15

Hình 1.8 Chế phẩm Super Chlorophyll Powder 16

Hình 3.1 Bã lá dong sau chiết 31

Hình 3.2 Dịch Chlorophyll sau lọc 31

Hình 3.3 Ảnh hưởng tỉ lệ DM/NL đến hàm lượng Chlorophyll 32

Hình 3.4 Bã lá dong sau chiết 33

Hình 3.5 Dịch Chlorophyll sau lọc 33

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng Chlorophyll 34

Hình 3.7 Bã lá dong sau chiết 35

Hình 3.8 Dịch Chlorophyll sau lọc 35

Hình 3.9 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng Chlorophyll 36

Hình 3.10 Bã lá dong ở 2 lần chiết 36

Hình 3.11 Dịch Chlorophyll sau lọc ở 2 lần chiết 37

Hình 3.12 Quy trình thu nhận chế phẩm Chlorophyllin từ lá dong 38

Hình 3.13 Quy trình thu nhận chế phẩm muối natri của đồng Chlorophyllin 40

Hình 3.14 Bột chế phẩm muối natri của đồng Chlorophyllin 41

Hình 3.15 Dung dịch màu chế phẩm muối natri của đồng Chlorophyllin ở pH khác nhau 42

Hình 3.16 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến chất lượng chế phẩm 43

muối natri của đồng Chlorophyllin 43

Hình 3.17 Biến đổi màu dung dịch chế phẩm muối natri của đồng 43

Chlorophyllin theo nhiệt độ 43

Hình 3.18 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến chất lượng chế phẩm muối natri

của đồng Chlorophyllin 44

Hình 3.19 Bột chế phẩm Chlorophyllin 45

Hình 3.20.Phổ hấp thụ của chế phẩm Chlorophyllin 45

Hình 3.21 Dung dịch màu của chế phẩm Chlorophyllin ở các pH khác nhau 46

Kết quả thu được cho thấy: 46

Hình 3.22 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến chất lượng chế phẩm Chlorophyllin 47

Hình 3.23 Biến đổi màu của chế phẩm Chlorophyllin theo nhiệt độ 47

Hình 3.24 Biến đổi màu của chế phẩm Chlorophyllin theo thời gian bảo quản 48

Hình 3.25 Xây dựng đường chuẩn phân tích tồn dư Cu tổng số 50

Hình 3.26 Xây dựng đường chuẩn phân tích tồn dư Pb 52

Hình 3.27 Xây dựng đường chuẩn xác định tồn dư As 54

Hình 3.28 Sản phẩm bánh thạch 58

Hình 3.29 Sản phẩm bánh dẻo 58

Hình 3.30 Sản phẩm bánh báo 58

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của số lấn chiết đến hàm lượng Chlorophyll 37 Bảng 3.2 Điều kiện tách chiết Chlorophyll 38 Bảng 3.3: Độ hấp thụ quang phổ của dung dịch chế phẩm muối natri của đồng Chlorophyllin ở các pH khác nhau 42 Bảng 3.4 Độ hấp thụ của chế phẩm Chlorophyllin ở các pH khác nhau 45 Bảng 3.5 Đặc tính chế phẩm Chlorophyllin và muối natri của đồng chlorophyllin 49 Bảng 3.6 Kết quả hàm lượng Cu tổng số của chế phẩm muối natri của đồng chlorophyllin 51 Bảng 3.7 Kết quả hàm lượng Pb của chế phẩm muối natri của đồng chlorophyllin 52 Bảng 3.8 Kết quả phân tích hàm lượng Pb của chế phẩm chlorophyllin 53 Bảng 3.9 Kết quả hàm lượng As của chế phẩm muối natri của đồng chlorophyllin 54 Bảng 3.10 Kết quả phân tích hàm lượng As của chế phẩm chlorophyllin 55 Bảng 3.11 Cảm quan bánh dẻo ở các tỉ lệ bổ sung màu khác nhau……….56 Bảng 3.12 Khảo sát các giá trị màu sắc của bánh dẻo theo thời gian……… 57

LỜI MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận văn

Chất lượng của các sản phẩm thực phẩm không chỉ bao gồm giá trị về mặt dinh dưỡng mà còn cả giá trị về mặt cảm quan cũng như vệ sinh an toàn thực phẩm Trong đó, màu sắc là chỉ tiêu bắt buộc và rất quan trọng khi đánh giá chất lượng của bất kỳ một sản phẩm thực phẩm nào Một sản phẩm có màu sắc đẹp sẽ góp phần lôi kéo sự chú ý của khách hàng

Do đó, trong kỹ thuật sản xuất thực phẩm người ta không chỉ quan tâm đến việc bảo vệ màu sắc tự nhiên mà còn tạo ra và bổ sung vào thực phẩm những chất màu mới thích hợp với tính chất và trạng thái sử dụng của chúng

Tuy nhiên, vấn đề sử dụng chất màu thực phẩm hiện nay đang tồn tại rất nhiều bất cập Việc vô ý hay cố ý bổ sung vào thực phẩm những chất màu không được phép hoặc sử dụng vượt quá liều lượng quy định đã và đang gây ảnh hưởng không nhỏ đến vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm, làm ảnh hưởng đến sức khoẻ và gây hoang mang tâm lý người tiêu dùng

Chính vì điều đó mà hiện nay trên thế giới, người ta đang tập trung nhiều nghiên cứu để tìm cách hạn chế tối đa những tổn thất của sắc tố trong quá trình bảo quản, chế biến đồng thời tách chiết các nhóm sắc tố từ những loại nguyên liệu tự nhiên rẻ tiền hay tận dụng các phế phụ phẩm để thu nhận các nhóm sắc tố làm chất màu tổng hợp và ứng dụng vào ngành công nghệ thực phẩm Đó là do sắc tố tự nhiên có ưu điểm vượt trội hơn, chúng không gây độc tính cho con người, đảm bảo

vệ sinh an toàn thực phẩm hơn so với các sắc tố tổng hợp nhân tạo (phẩm màu), mặc dù các nhóm sắc tố tự nhiên lại có nhược điểm là rất dễ bị biến đổi và tổn thất trong các điều kiện môi trường…

Từ những vấn đề nêu trên tôi đã chọn đề tài: “ Nghiên cứu tách chiết chất màu tự nhiên từ thực vật và ứng dụng trong thực phẩm” để làm luận văn nghiên

cứu tốt nghiệp thạc sỹ của mình với mục đích khai thác tối đa tiềm năng của một số

thực vâ ̣t ta ̣i Viê ̣t Nam trong lı̃nh vực chất màu thực phẩm

2 Lý do lựa chọn luận văn

Hiện nay ở nước ta thực trạng ngộ độc thực phẩm trong đó có ngộ độc do phẩm màu ngày càng tăng Gần đây, việc sử dụng phẩm màu không có trong danh

mu ̣c cho phép đang là vấn đề nhức nhối trong xã hội, gây ảnh tới sức khoẻ người tiêu dùng Do đó việc lựa chọn phẩm màu thiên nhiên không có độc tính để tạo màu cho thực phẩm đang là xu hướng được ưa chuộng Một trong những loại phẩm màu

tự nhiên được sử dụng phổ biến là chất màu Chlorophyll được lấy từ thực vật có màu xanh Tuy nhiên, dạng Chlorophyll kém bền nên thường được đưa về dạng Chlorophyllin Chlorophyllin có màu xanh lục đậm hơn so với màu xanh lục của Chlorophyll và tan tốt trong nước nên dễ dàng bổ sung vào thực phẩm Ngoài ra, loại phẩm màu này còn có hoạt tính sinh học cao, do đó giá trị sử dụng của nó càng được nâng lên Các nguồn Chlorophyll từ thực vật tương đối dồi dào và giá thành

rẻ Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu thu nhận chlorophyll từ lá dong và đưa

ra hai quy trình khác nhau để tạo ra các chế phẩm Chlorophyllin có đặc tính, ưu nhược điểm riêng nhằm ứng dụng nhuộm màu cho phù hợp trong thực tế

3 Mục tiêu của luận văn

Nghiên cứu quy trình thu nhận và đặc tính chế phẩm màu xanh từ lá dong và

ứng dụng trong thực phẩm

4 Nội dung nghiên cứu luận văn

 Nghiên cứu xây dựng điều kiện tách chiết chlorophyll từ lá dong

 Nghiên cứu quy trình thu nhận hai chế phẩm chlorophyllin và muối natri

của đồng chlorophyllin từ lá dong

 Nghiên cứu điều kiện ứng dụng và khảo sát sự thay đổi chế phẩm màu thu

được trong thời gian bảo quản

 Xác định đặc tính và tồn dư kim loại các chế phẩm

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về chất màu tự nhiên [7]

Chất màu tự nhiên là chất màu có sẵn trong động vật hoặc thực vật, có màu sắc phù hợp, được khai thác bằng các biện pháp kỹ thuật thích hợp để tạo ra chế phẩm dùng để nhuộm màu cho các sản phẩm thực phẩm Chất màu tự nhiên được chia làm 3 nhóm chính: anthocyanin có màu đỏ, vàng và xanh lam; chlorophyll có màu xanh lá cây và carotenoid có màu vàng

Ngoài ra để tạo màu nâu hoặc đen người ta dùng caramen và polyphenol Tất

cả các sắc tố này là những hợp chất hóa học phức tạp, mức độ bền của chúng rất khác nhau trong và trong quá trình bảo quản, chế biến nhiệt và các gia công khác thường sẽ bị thay đổi theo những cách khác nhau

Khác với chất màu tổng hợp, chất màu tự nhiên thường không gây độc, dễ kiếm, cách sử dụng không phức tạp và không gây ra những mùi lạ cho sản phẩm, bên cạnh đó các chất màu tự nhiên còn chứa các thành phần hoạt tính sinh học khác như: các vitamin, các axit hữu cơ, glycozit, các nguyên tố vi lượng Do vậy, khi sử dụng chất màu tự nhiên để nhuộm màu không chỉ cải thiện được giá trị cảm quan

mà còn làm tăng giá trị dinh dưỡng của thực phẩm Nhờ những ưu điểm của các chất màu nhuộm màu tự nhiên, hiện nay có nhiều nước trên thế giới đã chiết tách và

sử dụng các chế phẩm tự nhiên trong nhuộm màu thực phẩm Tuy nhiên khả năng ứng dụng của các chất này trong công nghiệp vẫn còn một số hạn chế như các chât màu tự nhiên không bền dưới tác động của ánh sáng, oxy không khí…, việc khai thác từ tự nhiên thường không đủ nhiều để có thể thỏa mãn cho nhu cầu ngày càng lớn về sản lượng thực phẩm và về tính đa dạng màu sắc của sản phẩm

1.2 Giới thiệu về cây Dong

1.2.1 Đặc điểm hình thái

Hình 1.1 Lá dong

Cây thân thảo cao 1-2 m, phiến lá hình từ trứng tới elip, lá mỏng, không lông,

gốc lá thuôn tròn với tâm nhọn, đỉnh lá nhọn Tên khoa học là Phrynium,

1.2.2 Phân b ố

Cây lá dong sinh sống trong các khu vực ẩm ướt có bóng râm che phủ như trong rừng, thường trong các thung lũng dọc suối, cao từ 0-1500m Phân bố tại Việt Nam, Ấn Độ, Myanma, Philipines, Thái Lan, Trung Quốc, Indonesia

Ở nước ta, cây lá dong mọc tự nhiên nhiều ở các tỉnh miền núi phía Bắc Ở vùng đồng bằng Bắc Bộ, cây lá dong sinh trưởng cũng tốt nhưng diện tích canh tác

ít do bà con ít trồng Lá dong trồng nhiều mỗi khi Tết đến để phục vụ nhu cầu gói bánh trưng của người dân

1.2.3 Mục đích sử dụng

+ Lá dong được sử dụng chủ yếu để gói bánh trưng, bánh tét, bánh nếp, bánh

tẻ Bánh gói lá dong, sau khi luộc bánh có màu xanh của lá dong, có mùi thơm đặc biệt và dễ chịu

+ Lá dong còn được dùng để cất dấm bằng cách ngâm lá dong với rượu hay dung dịch 30% đường

+ Theo kinh nghiệm dân gian, lá dong non được dùng làm thuốc giải độc, chữa say rượu, rắn cắn

lá già thì màu xanh này bị thay đổi do Chlorophyll bị mất đi, thay thế bằng màu của chất khác

Chlorophyll có vai trò chuyển đổi năng lượng mặt trời thành năng lượng hóa học Không có dạng năng lượng này, cây sẽ không thực hiện được các phản ứng phức tạp trong quá trình quang hợp

Hình 1.2 Chlorophyll dưới kính hiển vi

Trong các phần xanh của cây, Chlorophyll phân tán trong nguyên sinh chất

1.3.2 Cấu trúc của Chlorophyll

Chlorophyll là một dẫn xuất của porphyrin có khung cơ bản là porphin và các dẫn xuất: dihydroporphin và tetrahydroporphin Porphin gồm 4 vòng pyrol nối với nhau bởi cầu nối methy –CH=

Phần tử diệp lục không cân xứng, nó còn thêm một vòng phụ pentanol gồm các nhóm carbonyl và carboxyl liên kết với methanol

Trong phân tử Chlorophyll, các nhóm thế được gắn vào các vòng pyrol và một nguyên tử Mg ở vị trí trung tâm liên kết với 4 nguyên tử nitrogen Do đó, Chlorophyll là một hợp chất Mg – porphyrin Cấu trúc của Chlorophyll rất phức tạp, trải qua nhiều năm nghiên cứu của các nhà khoa học mới khám phá rõ rệt, đến 1960 Strell và Woodward đã tổng hợp được Chlorophyll a

Trong tự nhiên Chlorophyll tồn tại 2 dạng:

+ Chlorophyll a: C55H71O5N4Mg

+ Chlorophyll b: C55H70O6N4Mg

Tỷ lệ của chúng trong thực vật là chlorophyll a : chlorophyll b = 3:1 Trong cấu tạo Chlorophyll a khác Chloropyll b ở gốc R Chlorophyll a gốc R là CH3, Chlorophyll b gốc R là CHO Ngoài hai dạng là Chlorophyll a,b còn có dạng khác:

c, d, e được tìm thấy ở táo

Hình 1.3 Cấu tạo phân tử Chlorophyll

1.3.3 Các tính chất của Chlorophyll

1.3.3.1 Tính chất vật lý

 Chlorophyll a: C55H71O5N4Mg

+ Phân tử lượng M = 893,48

+ Có màu lam tinh thể lá dầy

+ Không tan trong nước, tan ít trong ether dầu hỏa, tan trong ethanol, acetone, benzene…

+ Nhiệt độ nóng chảy: Tch = 112-120oC

 Chlorophyll b: C55H70O6N4Mg

+ Phân tử lượng M = 907,46

+ Bột vi tinh thể xanh lá cây

+ Không tan trong nước, tan ít trong ether dầu hỏa, tan trong ethanol, acetone, benzene…

Trong mỗi sắc tố là khác nhau có một phổ hấp thụ duy nhất Chlorophyll a và

b có phổ hấp thụ mạnh nhất ở bước sóng 600 – 475 nm Phổ hấp thụ mạnh nhất của các peak phụ thuộc vào tính phân cực mạnh của dung môi

1.3.3.3 Tính chất hóa học [5]

 Tác dụng với axit: dưới tác dụng của nhiệt độ và axit dịch bào, màu xanh của chlorophyll bị mất đi tạo màu sẫm, một mặt là do protein bị đông tụ làm vỏ tế bào bị phá hủy, mặt khác do liên kết giữa chlorophyll và protein bị đứt làm cho chlorophyll dễ dàng tham gia phản ứng tạo feofitin có màu xanh oliu

 Tác dụng với bazơ

Khi cho tác dụng với kiềm nhẹ như cabonat kiềm, kiềm thổ thì chúng sẽ trung hòa axit và muối của dịch bào và tạo nên môi trường kiềm làm cho chlorophyll bị

xà phòng hóa cho rượu phytol, methanol và axit chlorophilic

Chlorophyll a + 2NaOH (C32H30ON4Mg)(COONa)2 + CH3OH + rượu phytol Chlorophyll b + 2NaOH (C32H28ON4Mg)(COONa)2 + CH3OH + rượu phytol

Khi xà phòng hóa ta có sản phẩm có màu xanh đậm hơn, bền hơn

 Quá trình oxy hóa: Chlorophyll bị oxy hóa do oxy và sánh sáng (quang oxy

hóa), do xúc tác với các lipid bị oxy hóa hoặc do tác dụng của enzyme lipoxydase

 Tác dụng với kim loại: sự tiếp xúc với kim loại như Fe, Cu, Al, Sn thì Chlorophyll sẽ bị sẫm màu do các kim loại này sẽ thay thế Mg trong Chlorophyll và

sẽ cho ra các màu khác nhau như:

Với Fe: cho màu nâu

Với Sn và Al cho màu xám

Với Cu cho màu xanh xám

1.3 3.4 Sự mất màu của Chlorophyll

Chlorophyll tồn tại trong cây bền vững với không khí và ánh sáng Khi ánh sáng mạnh, lục lạp có khả năng xoay bề mặt tiếp xúc nhỏ nhất về phía ánh sáng Tuy nhiên, khi cường độ ánh sáng quá mạnh hoặc thiếu CO2 thì quá trình quang hợp của cây bị kìm hãm trước tiên và sau đó thì cây bị vàng và bị mất màu dần Sự bền vững của Chlorophyll trong tế bào là do chúng nằm trong hệ phức protein lipid bảo

vệ Nhưng dung dịch Chlorophyll ngoài ánh sáng và môi trường có oxy thì mất màu xảy ra do sự oxy hóa dưới tác dụng của ánh sáng:

Chl + hv Chl* (trạng thái kích thích)

Chl* + O2 ChlO2 (trạng thái oxy hóa không màu)

1.3 4 Sự biến đổi của Chlorophyll

Hình 1.5 Sự biến đổi của Chlorophyll

α, β, γ, δ: những hệ số phụ thuộc vào dung môi

Ca, Cb: nồng độ tương ứng của Chlorophyll a và b

Dλ: hệ số hấp phụ ở các bước sóng cho biết

Giá trị của các hệ số hấp phụ phụ thuộc vào dung môi, do đó mỗi dung môi

Nguồn khai thác: sử dụng các dung môi hữu cơ như: acetone, methanol, ethanol, hexan để trích ly Chlorophyll từ thực vật như: cỏ, cây tầm ma, có linh lăng

và các thực vật khác, sau đó loại bỏ dung môi và tiến hành loại bỏ hoàn toàn hoặc một phần Magie khỏi Chlorophyll để thu được phaeophytin tương ứng Phần mang màu chủ yếu là phaeophytin và magnesium chlorophyll Chế phẩm Chlorophyll sau khi đã loại bỏ dung môi có thể chứa một vài chất khác như carotenoid, một ít chất béo có từ nguyên liệu ban đầu

Phương pháp sử dụng: Vì Chlorophyll không tan trong nước nên sử khi sử dụng người ta thường hòa tan Chlorophyll trong cồn etylic sau đó mới đưa vào thực phẩm, vì thế Chlorophyll thường được sử dụng cho các sản phẩm có thể chấp nhận mùi và vị của cồn etylic hoặc cho những loại thực phẩm dễ dàng làm bay hơi cồn ra khỏi thực phẩm

1.3.6.2 Phẩm màu Chlorophyll phức đồng

INS: 141i, ADI: 0-15

Chlorophyll phức đồng là chất màu xanh lá cây Thực chất nó là sản phẩm thu được bằng cách chuyển hóa Chlorophyll có chứa nhân Magie Chlorophyll có chứa nhân đồng Quá trình chuyển hóa này không làm mất màu xanh tự nhiên của Chlorophyll mà lại tạo ra một chế phẩm bền màu hơn Các dạng chuyển hóa của

Chlorophyll dạng phức đồng là Copper phaeophytin a có công thức: C55H72CuN4O5

và Copper phaeophytin b: C55H70CuN4O5

Đặc tính: Chlorophyll phức đồng là chế phẩm ở dạng sáp rắn có màu biến đổi từ xanh lục xanh đến xanh lục thẫm tùy thuộc vào nguyên liệu ban đầu, không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ như ethanol, dietylen, cloroankan, hydrocacbon và một số dầu

Nguồn khai thác: Sử dụng các dung môi acetone, diclorometan, methanol…

để chiết nguyên liệu từ thực vật như cỏ, cây tầm ma, coe linh lăng…Cho thêm muối hữu cơ của đồng vào dịch sau khi chiết, thu được dung dịch Loại bỏ dung môi Sản phẩm là chế phẩm Cholorophyll phức đồng có chứa một ít chất màu như caroten, chất béo, sáp có sẵn trong vật liệu ban đầu Chế phẩm có màu xanh mà thành phần

cơ bàn là Đồng Phaeophytin

Phương pháp sử dụng: Cách sử dụng Chlorophyll phức đồng cũng tương tự như sử dụng Chlorophyll, nhưng độ bền màu của chế phẩm này cao hơn và vì thế

nó được sử dụng cho nhiều sản phẩm thực phẩm hơn

1.3.6.3 Phẩm màu muối Natri, Kali của Chlorophyll phức đồng

INS: 141i; ADI: 0-15

Chlorophyll phức đồng muối natri, kali cũng là chất màu xanh lá cây thuộc nhóm chất màu Chlorophyll Đây là chế phẩm thu được bằng cách xà phòng hóa Chlorophyll có bổ sung muối đồng Quá trình chuyển hóa này không làm mất màu xanh tự nhiên của Chlorophyll mà lại tạo ra một chế phẩm bền màu hơn Các dạng chuyển hóa của Chlorophyll dạng phức đồng muối natri, kali là Copper Chlorophyllin a, công thức: C34H32CuN4O5 và Copper Chlorophyllin b:

Nguồn khai thác: Sử dụng các dung môi như acetone, diclorometan, methanol, ethanol…để chiết nguyên liệu thực vật cơ, cỏ linh lăng, cây tầm ma… Muối kim loại kiềm của Chlorophyll phức đồng thu được bằng cách thêm đồng vào sản phẩm phản ứng xà phòng hóa dịch chiết, phản ứng xà phòng hóa đã loại bỏ nhóm metyl và este eyelophytol và có thể cắt mạch một phần vòng petenyl, sau khi thêm đồng vào Chlorophyll tinh khiết, nhóm axit được trung hòa về dạng muối natri hay kali, sản phẩm thương mại có thể ở dạng dung dich hay dạng bột

Phương pháp sử dụng: cách sử dụng Chlorophyll phức đồng muối natri, kali cũng tương tự như sử dụng Chlorophyll Đặc tính của chế phẩm này rất dễ tan trong nước nên rất dễ sử dụng cho nhiều loại thực phẩm Người ta pha chế phẩm bằng nước với nồng độ nhất định đã tính trước và cho vào thực phẩm Độ bền màu của chế phẩm này cao hơn của Chlorophyll

Trong lĩnh vực y tế, người ta đã phát hiện ra khả năng phòng bệnh và chữa bệnh của Chlorophyll Giáo sư Hans Fischer ( giải nobel về y năm 1930) đã xác định: “Chlorophyll có khả năng đào thải chất độc hại ra khỏi cơ thế” Bằng nhiều công trình nghiên cứu, nhiều nhà y học đã khẳng định: chất diệp lục có tác dụng thải độc ra khỏi cơ thể và tránh các tác nhân gây ung thư Khi đưa vào cơ thể, chất diệp lục sẽ đi theo 2 đường: một là đường tiêu hóa, tốt cho cơ qua bào tiết, tiêu hóa; hai là có thể thẩm thấu vào trong mạch máu và tế bào, kết hợp được với các độc tố

và đào thải ra khỏi cơ thể qua đường bài tiết

Chlorophyll kích hoạt các enzym và tế bào bạch cầu, tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể

Diệp lục trong môi trường giàu oxy, có mặt trong đại tràng giúp đường ruột khỏe mạnh, bằng việc thúc đẩy phát triển của vi khuẩn ưa axit, làm sạch đường ruột

va tạo ra một hệ tiêu hóa khỏe mạnh

Chlorophyll kích thích nhu động ruột, chống táo bón Đối với một số người,

nó còn được dùng trị chứng đầy hơi Chlorophyll giúp cân bằng mùi trong cơ thể và thường được dùng làm chất khử mùi Trong y học nó thường được dùng để hỗ trợ giảm mùi trong quá trình phẫu thuật làm hậu môn giả hoặc thủ thuật thông ruột hồi, đồng thời giúp giảm hôi của phân và nước tiểu do tiểu tiện hoặc đại tiện không kiểm soát được

Cholorophyll giúp bảo vệ tế bào bằng nhiều cơ chế khác nhau: thông qua khả năng chống oxy hóa, ngăn chặn các chất độc hại, ngăn chặn sự trao đổi các chất hóa học gây nguy hiểm để các chất đó không trở thành các chất gây ung thư Khả năng ngăn chặn và loại trừ các chất độc tố hại là một lý do khiến Cholorophyll từ lâu đã được sử dụng làm chất làm sạch hoặc lọc máu Cholorophyll được chứng minh là có khả năng làm tăng khẳ năng bài tiết các chất độc qua đường đại tiện Cholorophyll cũng có thể giúp bảo vệ tế bào khỏi sự phá hoại của các chất độc hại

Ngoài ra, Cholorophyll còn được sử dụng như là chất cảm thụ ánh sáng để diệt các tế bào ung thư, kịch thích sự phục hổi các mô đã bị hư hại và bảo vệ con người khỏi các chất ung thư Nước Cholorophyll chống lại các độc tố, giải rượu và chống say rượu, cải thiện tình trạng đái tháo đường

1.4 Tình trạng nghiên cứu và sản xuất Cholorophyll

1.4.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất Cholorophyll trên thế giới

1.4.1.1 Tổng quát

Đã hơn thế kỷ nay, các nhà khoa học trên thế giới rất quan tâm tới việc chiết tách các sắc tố từ lá xanh của thực vật bậc cao để ứng dụng trong y học và công nghiệp thực phẩm Cách đây hơn 100 năm các nhà hóa học đã tách được chất màu

xanh từ lá và gọi chúng là Chlorophyll Chlorophyll lần đầu tiên được tách ra bởi Joseph Bienaimé Caventou và Pierre Joseph Pelletier năm 1817

Vào những năm 80 của thế kỷ trước các nhà khoa học Nga và Grudia đã nghiên cứu chất màu thực phẩm từ chè Để nhận được chất màu xanh, người ta chiết xuất từ nguyên liệu chè tươi bằng rượu etylic 96% Sau đó đuổi rượu, chiết tách làm sạch, cố định màu, cô đặc, sấy phun ta sẽ có màu xanh lá cây

Một trong các phương pháp tránh thất thoát chlorophyll trong quá trình chế biến được áp dụng rộng rãi do Blei và Airet đề ra Thực chất của phương pháp đó dẫn đến việc nâng cao pH của môi trường, tức là làm giảm hàm lượng acid tự do, tức là ngăn cản khả năng oxy hoá chlorophyll Đầu tiên đậu xanh được nhúng trong dung dịch natri cacbonat 2% ở nhiệt độ thường trong thời gian 1 giờ Sau đó cần phải chần trong dung dịch Ca(OH)2 nồng độ 0,037% Còn có một số nhà nghiên cứu khác cũng tiến hành theo chiều hướng đó như DZ.Malêki đã đề nghị, để nâng cao

pH trong đậu xanh, cho thêm vào trong hộp một ít dinatri glutamat là chất đệm kiềm Blei còn tiến hành theo phương pháp khác để bảo vệ màu xanh của các loại rau quả bằng cách cho thêm vào nước chần Ca(OH)2 và canxi glutamat nâng pH bằng 6,1-6,3

Đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về chiết suất và thu hồi Chlorophyll từ nhiều loại thực vật khác nhau bằng các dung môi khác nhau hay bổ sung các chất làm tăng hiệu quả chiết và điều chế để tạo ra các chất màu ứng dụng trong thực phẩm Kết quả nghiên cứu của Catalina Cubas và cộng sự cho thấy hàm lượng chlorophyll thu được từ đậu biếc cao nhất khi chiết bằng dung môi N,N-dimethylformamide trong thời gian 90 phút, thời gian đồng hóa là 1 phút và chiết tới 5 lần Nghiên cứu của Krystian Miazek khi sử dụng ba loại dung môi methanol, ethanol 95%, acetone 80% để tách chiết một số loại nguyên liệu cho kết quả khá tương đồng Trong đó, hàm lượng chlorophyll thu được cao nhất ở lá bạch dương (0,32%), ở lá cây nguyệt thấp hơn (0,28%) và thấp nhất ở lá thông (0,23%) Một nghiên cứu khác của Zhenhua Mab và các công sự cũng đưa ra việc sử dụng aceton 90% cho hiệu suất tốt hơn so với sử dụng aceton 80% và ethanol 95% khi thực hiện

tách chiết chlorophyll từ một số loài thủy sinh đồng thời dung dịch chiết khi sử dụng aceton 90% cũng cho tính ổn định hơn [11,15]

Một số hãng dược phẩm (Synergy Worldwwide, K-Link…) đã sản xuất loại thực phẩm chức năng là chất diệp lục có nguồn gốc hoàn toàn từ thảo dược như từ cây linh lăng, cây dâu tằm, cây bạc hà, cây lúa mạch…Sản phẩm chất diệp lục do các hãng này sản xuất chính là Chlorophyllin

1.4.1.2 Một số chế phẩm thương mại

Hình 1.6 Chế phẩm natri đồng Chlorophyllin

- Tên công ty: Sichuan Tongshida Bio-Technology Co., Ltđ Trung Quốc

- Nguồn gốc: chiết từ lá dâu tằm

- Giá sản phẩm: 150 USD/kg

- Đặc tính: chế phẩm dạng bột, tan trong nước, ít tan trong rượu và chlorofom

- Ứng dụng: như một sắc tố thực phẩm, sử dụng trong bánh, đồ uống, kẹo…

- Tên công ty: Synergy Worldwide – Mỹ

- Nguồn gốc: chiết từ cỏ linh lăng

- Đặc tính: dạng bột, tan trong nước

- Ứng dụng: dùng uống thay nước trong ngày, tốt cho hệ tiêu hóa, giảm mùi trong vẫn đề răng miệng, tăng khả năng sinh sản máu, ngoài ra bột có thể rắc đắp lên vết thương để cầm máu

- Cách dùng: pha từ ½ đến 1 muỗng diệp lục cho vào 500-1000ml nước, nếu uống lạnh thì cho vài cục đá vào rồi uống, màu sắc rất bắt mắt, uống rất thích

1.4.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất Chlorophyll ở Việt Nam

Vào những năm 70 của thế kỷ trước, một sô công ty rượu đã sản xuất rượu chanh Màu của rượu chanh là màu xanh lá cây nên các nhà máy đã chiết xuất trực tiếp Chlorophyll từ vỏ quả chanh bằng rượu etylic và sau đó dùng dung dịch này để

bổ xung vào rượu khi pha chế Dịch chiết vỏ quả chanh vừa có mùi thơm của chanh

vừa có màu xanh của chất diệp lục Tuy nhiên sau một thời gian nhất định màu xanh của rượu mất dần và gần như rượu không còn màu

Hiện nay, ở Việt Nam gần như chưa có cơ sở nào sản xuất Chlorophyll kể cả quy mô thủ công lẫn công nghiệp và các công trình nghiên cứu về tách chiết và ứng dụng chlorophyll trong thực phẩm vẫn ở bước ban đầu Các nghiên cứu này chủ yếu vẫn ở dạng tối ưu hóa các điều kiện tách chiết, điều chế ra các chất màu và ứng dụng vào thực phẩm tại phòng thí nghiệm Năm 2010, TS Ngô Xuân Cường tiến hành nghiên cứu công nghệ sản xuất chất màu thực vật từ chè và ứng dụng trong một số sản phẩm bánh, kẹo, rượu Năm 2012, Kỹ sư Nguyễn Minh Trang tiến hành nghiên quá trình chiết rút chlorophyll từ lá bắp và đưa ra các thông số tối ưu khi tách chiết bằng ethanol 96%: nhiệt độ chiết thích hợp là 57,23oC, thời gian chiết thích hợp là 15,69 giờ và tỉ lệ ethanol/ lá bắp là 39,99/1 (v/w) với hiệu suất thu nhận chlorophyll là 97,3% Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Vân Anh và các cộng sự năm 2014, hàm lượng chlorophyll thu được từ rau ngót là 3,23567 mg/g khi được tách chiết trong 40 giờ, xúc tác MgCO3: 0,008g với nồng độ dung môi là ethanol 92% Nguyễn Thùy Linh và Lê Phạm Công Hoang đã thu được lượng chlorophyll tổng số là khoảng 35 µg/l với tỷ lệ chlorophyll a là khoảng 60% với dung môi sử dụng là acetone 80% có bổ sung 500 mg MgCO3 và thời gian ủ dịch rong mứt là trong dung môi là 24 giờ Cùng với đó là các nghiên cứu về tách chiết và chuyển hóa chlorophyll từ vi khuẩn cũng được các nhà khoa học quan tâm

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và nguyên vật liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là lá dong, lá dong mua tại xã Kim An, huyện Thanh Oai, thành phố Hà Nội Chọn những lá còn tươi, không bị héo úa, dập nát Lá dong mua về được bảo quản trong ngăn mát của tủ lạnh

2.1.2 Chuẩn bị nghiên cứu

Lá dong được rửa sạch bằng nước để loại bỏ bụi bẩn và tạp chất, một phần vi sinh vật, nấm mốc tồn tại trên bề mặt lá Lá được để ráo nước, sau đó cắt nhỏ rồi xay khô

2.1.3 Hóa chất và thiết bị

Các thí nghiệm có sử dụng các hóa chất, dụng cụ và thiết bị tại phòng thử nghiệm hóa học – Trung tâm phân tích và chứng nhận chất lượng sản phẩm nông nghiệp Hà Nội

2.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết chlorophyll

2.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng Chlorophyll [11]

Đối với dung môi ethanol, mẫu được đo ở bước sóng 664 và 647 nm Mẫu trắng là mẫu chỉ chứa dung môi ở nồng độ tương ứng Hàm lượng Chlorophyll a và hàm lượng Chlorophyll b được tính theo công thức:

[Chl-a] = 8,9×A664 – 1,9×A647 – 0,11

• Khảo sát tỷ lệ DM/NL (g/ml) lần lượt: 10, 20, 30, 40, 50

• Khối lượng mẫu là 1g

• Dung môi trích ly lựa chọn là ethanol 96% vì cồn thường dùng trong sản xuất thực phẩm, giá thành rẻ, dễ kiếm, ít độc hại

• Thời gian 2 giờ

• Nhiệt độ 50oC, bóng tối

• Dịch thu được đem đo độ hấp thu để xác định hàm lượng Chlorophyll ở các

tỷ lệ tách chiết khác nhau

2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới hàm lượng Chlorophyll thu được

Nhiệt độ tách chiết là yếu tố ảnh hưởng lớn đến quá trình tách chiết Thông thường nhiệt độ tách chiết càng cao Chlorophyll sẽ linh động hơn, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tách chiết Nhưng khi nhiệt độ tăng quá cao gây tiêu tốn năng lượng, mặt khác có thể gây ra các biến đổi hóa học của các thành phần nguyên liệu Do vậy, tùy thuộc vào loại nguyên liệu cần lựa chọn nhiệt độ thích hợp nhất Tiến hành thí nghiệm: cách mẫu được tiến hành trong cùng điều kiện:

• Khảo sát nhiệt độ tách chiết lần lượt là: nhiệt độ thường, 40 oC, 50 oC, 60 oC,

70 oC

• Khối lượng mẫu là 1g

• Dung môi là ethanol 96%

• Tỷ lệ DM/NL được xác định ở thí nghiệm 2.2.2

• Thời gian 2h và trong bóng tối

• Dịch thu được đem đo độ hấp thu để xác định hàm lượng Chlorophyll ở các nhiệt độ khác nhau

2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian tách chiết tới hàm lượng Chlorophyll thu được

Thời gian tách chiết càng dài thì lượng Chlorophyll thu được càng nhiều nhưng nếu thời gian tách chiết quá dài thì chi phí cho quá trình tách chiết cao và

xác định thời gian thích hợp cho quá trình tách chiết Chlorophyll đạt hiệu quả tốt nhất

Tiến hành thí nghiệm: các mẫu được tiến hành trong cùng điều kiện:

• Khảo sát thời gian tách chiết lần lượt là 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ và 4 giờ

• Khối lượng mẫu là 1g

• Dung môi là ethanol 96%

• Tỷ lệ DM/NL được xác định ở thí nghiệm 2.2.2

• Nhiệt độ được xác định ở thí nghiêm 2.2.3

• Dịch thu được đem đo độ hấp thu để xác định hàm lượng Chlorophyll ở các thời gian tách chiết khác nhau

2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết tới hàm lượng Chlorophyll thu được

Với cùng một lượng dung môi, số lần tách chiết càng nhiều thì hiệu suất thu nhận Chlorophyll sẽ càng cao Tuy nhiên, khi tách chiết tới một lúc nào đó thì lượng Chlorophyll thu được tăng lên không đáng kể, trong khi đó lại tiêu tốn thời gian và chi phí cao Do đó, cần xác định số lần tách chiết thích hợp sao cho đạt hiệu quả kinh tế cao nhất

Tiến hành thí nghiêm: các mẫu được tiến hành trong cùng điều kiện:

• Khảo sát số lần tách chiết lần lượt là 1 lần và 2 lần

• Khối lượng mẫu thí nghiệm là 1g

• Dung môi là ethanol 96%

• Tỷ lệ DM/NL, nhiệt độ, thời gian chiết được xác định ở thí nghiệm 2.2.2; 2.2.3; 2.2.4

• Dịch thu được đem đo độ hấp thu để xác định hàm lượng Chlorophyll ở số lần chiết khác nhau

2.3 Phương pháp xác định hàm lượng muối natri của đồng Chlorophyllin [5]

ở 403-406 nm, ghi cực đại trong khoảng đó

Hàm lượng (%) natri đồng chlorophyllin được tính theo công thức sau:

𝑴𝑴ậ𝒕𝒕 độ 𝒒𝒒𝒒𝒒𝒒𝒒𝒒𝒒𝒒𝒒 𝒙𝒙 𝟏𝟏𝟏𝟏𝟒𝟒

𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓 𝒙𝒙 𝒌𝒌𝒌𝒌ố𝒊𝒊 𝒍𝒍ượ𝒒𝒒𝒒𝒒 𝒎𝒎ẫ𝒒𝒒 𝒕𝒕𝒌𝒌ử (𝒒𝒒)Quy ước: natri đồng chlorophyllin tinh khiết 100% có độ hấp thụ riêng là 565

2.4 Phương pháp xác định đặc tính của các chế phẩm Chlorophyllin

2.4 1 Phương pháp xác định độ ẩm của lá dong

Độ ẩm của nguyên liệu được xác định bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi theo TCVN 5613-1991

Cách tiến hành: Cân chính xác 2g lá dong tươi sau đó sấy ở 105oC đến khối lượng không đổi Độ ẩm được xác định theo công thức:

𝐖𝐖 =𝒎𝒎𝟏𝟏𝒎𝒎− 𝒎𝒎𝟐𝟐

𝟏𝟏 × 𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏 Trong đó:

W: Độ ẩm của nguyên liệu (%)

m1: Khối lượng nguyên liệu ban đầu(g)

m2: Khối lượng nguyên liệu sau khi sấy đến khối lượng không đổi(g)

2.4 2 Tỷ lệ thu nhận chế phẩm Chlorophyllin

𝐇𝐇 = (𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏 − 𝑾𝑾) × 𝒎𝒎𝒎𝒎𝟐𝟐 𝟏𝟏 × 𝟏𝟏𝟏𝟏 𝟒𝟒Trong đó:

H: tỷ lệ thu nhận chế phẩm Chlorophyll (%)

m2: Khối lượng bột chế phẩm thu được (g)

m1: Khối lượng nguyên liệu (g)

W: Độ ẩm của nguyên liệu (%)

2.4 3 Khả năng hòa tan

Lấy 1 g bột màu cho vào lần lượt 100 ml nước Quan sát độ tan

W: Độ ẩm của chế phẩm Chlorophyllin (%)

m1 : Khối lượng chế phẩm Chlorophyllin ban đầu (g)

m2: Khối lượng chế phẩm Chlorophyllin sau khi sấy đến khối lượng không đổi (g)

2.5 Nghiên cứu điều kiện ứng dụng của chế phẩm muối natri của đồng Chlorophyllin và chế phẩm Chlorophyllin

Các chế phẩm màu tự nhiên có ưu điểm là không độc nhưng lại kém bền màu Một trong các chỉ tiêu quan trọng của chất màu là khả năng bền màu dưới tác dụng của ánh sáng và môi trường với nhiệt độ và pH khác nhau Do đó, cần phải khảo sát ảnh hưởng các yếu tố này nhằm xác định sự biến đổi của chế phẩm, từ đó đưa ra chế độ bảo quản và ứng dụng trong sản xuất một cách phù hợp

2.5 1 Xác định bước sóng hấp thụ cực đại của chế phẩm

Cân 1 mg chế phẩm màu sau khi thu nhận, hòa tan trong 100 ml nước cất Hút 5 ml dung dịch thêm vào đó 40 ml nước cất để tiến hành pha loãng Xác định bước sóng hấp thụ cực đại và độ hấp thụ tại bước sóng đó của dung dịch chế phẩm Sử dụng bước sóng này trong các thí nghiệm xác định điều kiện ứng dụng

2.5.2 Ảnh hưởng của pH môi trường trong ứng dụng nhuộm màu chế phẩm

Chế phẩm màu dùng để tạo màu cho thực phẩm, môi trường pH của thực phẩm thường dao động trong khoảng 3 đến 11 (rất axit đến kiềm) Vì vậy, cần tiến hành khảo sát chất lượng của chế phẩm trong khoảng pH trên

 Mục tiêu:

Khảo sát độ bền màu của các chế phẩm ở các điều kiện ph khác nhau: pH =3,

pH = 5, pH = 7, pH = 9, pH = 11 nhằm theo dõi sự biến đổi màu trong quá trình ứng dụng trên thực phẩm

 Tiến hành:

Cho vào 5 bình tam giác khác nhau mỗi bình 1 mg chế phẩm màu Thêm vào mỗi bình 100 ml dung dịch có pH khảo sát tương ứng, hòa tan hoàn toàn Quan sát

về sự thay đổi màu sắc trong mỗi trường hợp Tiến hành pha loãng (mục 2.5.1) để

đo độ hấp thụ tại bước sóng (xác định ở mục 2.5.1)

2.5.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự biến đổi màu của các chế phẩm

 Mục tiêu:

Khảo sát độ bền nhiệt của chế phẩm ở các nhiệt độ khác nhau: 8oC, 35oC,

70oC, 100oC nhằm xác định sự biến đổi màu của chế phẩm trong ứng dụng chế biến thực phẩm

 Tiến hành:

Cân 1 mg chế phẩm pha trong nước thành 100 ml, cho vào 5 ống nghiệm bằng nhau mỗi ống 5 ml Thêm vào mỗi ống 40 ml nước, lắc đều và tiến hành đo độ hấp thụ tại bước sóng đã xác định ở thí nghiệm mục 2.5.1

chế phẩm chlorophyll trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau

2.5 4 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến chất lượng chế phẩm

Cân 1 mg các chế phẩm pha loãng thành 100 ml, đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng xác định ở mục 2.6.1 Tiến hành thí nghiệm này với chế phẩm sau khi sản xuất sau 10 ngày, 20 ngày, một tháng kể từ sau ngày sản xuất

So sánh các giá trị thu được theo thời gian của chế phẩm và rút ra kết luận về

độ bền màu theo thời gian bảo quản

2.6 Phương pháp xác định các chỉ tiêu tồn dư kim loại của chế phẩm

Ch lorophyllin và chế phẩm muối natri của đồng Chlorophyllin

Chế phẩm màu dùng để ứng dụng tạo màu cho thực phẩm Nên việc đảm bảo

an toàn thực phẩm cho người sử dụng và đáp ứng các quy định của nhà nước là rất quan trọng Vì vậy, cần tiến hành phân tích các chỉ tiêu về tồn dư kim loại của các chế phẩm màu nhằm xác định độ an toàn của chế phẩm

2 6.1 Xác định tồn dư Cu tổng số của chế phẩm muối natri của đồng Chlorophyllin [1]

 Mục tiêu:

Xác định tồn dư Cu tổng số của chế phẩm nhằm kiểm soát việc sử dụng Cu(CH3COO)2 trong quá trình sản xuất chế phẩm

 Tiến hành:

Cân chính xác trong khoảng 0,2 - 2g mẫu, thêm 10 ml HNO3 65% , 1 ml H2O2

, 1 ml H2O, đun trên bếp gia nhiệt ở nhiệt độ 40oC đến khi không thấy khí NO2 bay

ra (khoảng 30 phút) Sau đó đặt chương trình vô cơ hóa trong lò vi sóng phá mẫu Quá trính phá mẫu kết thúc, lấy mẫu ra cốc có mỏ dung tích 100ml, đuổi hơi axit trên bếp cách thủy đến muối ẩm, định mức vào bình 25 ml, thêm 2,5ml dung dịch LaCl3 10% định mức tới vạch bằng bằng HNO3 3% , sau đó đem đo mẫu trên

hệ thống quang phổ hấp thụ nguyên tử F-AAS

Xây dựng đường chuẩn:

+ Hút 5ml dung dịch gốc chuẩn Đồng (Cu) 1000 ppm vào bình định mức 100

ml, định mức tới vạch bằng HNO3 3% thu được dung dịch chuẩn Đồng (Cu)

50ppm Bảo quản ở nhiệt độ phòng, sử dụng trong 2 tuần

+ Từ dung dịch chuẩn trung gian Đồng (Cu) 50 ppm pha bằng HNO3 3% với

10 % dung dịch LaCl3 10% để thu được dung dịch chuẩn Đồng (Cu) làm việc ở các nồng độ từ 0 ppm đến 10 ppm dung dịch chuẩn làm việc bảo quản ở nhiệt độ phòng, sử dụng trong ngày

CM: Nồng độ Đồng (Cu) trong dung dịch mẫu khi đo máy (mg/l);

Cblank: Nồng độ của Đồng (Cu) trong mẫu Blank (mg/l);

m: Khối lượng của mẫu thực (g);

K: Hệ số pha loãng;

X: Hàm lượng Đồng (Cu) trong mẫu thực (mg/kg)

2.6.2 Xác định tồn dư Pb của chế phẩm Chlorophyllin và muối natri của đồng Chlorophyllin [2]

 Mục tiêu:

Xác định tồn dư Pb của chế phẩm nhằm kiểm tra chỉ tiêu đảm bảo an toàn thực phẩm của các chế phẩm

 Tiến hành:

Cân chính xác trong khoảng 0,2 - 2g mẫu, thêm 10 ml HNO3 65%, 1 ml H2O2,

1 ml H2O, đun trên bếp gia nhiệt ở nhiệt độ 40 oC đến khi không thấy khí NO2 bay

ra (khoảng 30 phút) Sau đó đặt chương trình vô cơ hóa trong lò vi sóng phá mẫu

Quá trính phá mẫu kết thúc, lấy mẫu ra cốc có mỏ dung tích 100ml, đuổi hơi axit trên bếp cách thủy đến muối ẩm, định mức vào bình 25 ml, thêm 2,5ml dung dịch NH4H2PO4 10% định mức tới vạch bằng bằng HNO3 3% , sau đó đem đo mẫu trên hệ thống quang phổ hấp thụ nguyên tử GF-AAS

Xây dựng đường chuẩn:

+ Hút 1ml dung dịch gốc chuẩn Pb 1000 ppm vào bình định mức 100ml, định mức tới vạch bằng HNO3 3% thu được dung dịch chuẩn Pb 10ppm Bảo quản ở nhiệt độ phòng, sử dụng trong 2 tuần

+ Hút 1 ml dung dịch chuẩn Pb 10ppm vào bình định mức 100ml, định mức tới vạch bằng HNO3 3% thu được dung dịch chuẩn Pb 100ppb Bảo quản ở nhiệt độ phòng, sử dụng trong 1 tuần

+ Hút 5 ml dung dịch chuẩn Pb 100ppb vào bình định mức 25 ml, định mức tới vạch bằng HNO3 3% thu được dung dịch chuẩn Pb 20ppb Bảo quản ở nhiệt độ phòng, sử dụng trong ngày

+ Từ dung dịch chuẩn trung gian Pb 100ppb pha bằng HNO3 3% với 10 % dung dịch NH4H2PO4 10% để thu được dung dịch chuẩn Pb làm việc ở các nồng độ lần lượt là 1 ppb; 5 ppb; 10 ppb; 20 ppb Dung dịch chuẩn làm việc bảo quản ở nhiệt độ phòng, sử dụng trong ngày

- Kết quả hàm lượng Chı̀ (Pb) trong mẫu được máy tự động tính toán dựa vào

độ hấp thụ (Abs) và được lưu trong dữ liệu của máy

- Hàm lượng Chı̀ (Pb) trong mẫu theo công thức:

X(µg/kg) = (CM - Cblank) V K

m

Trong đó:

V: Thể tı́ch định mức (ml);

CM: Nồng độ Chı̀ (Pb) trong dung dịch mẫu khi đo máy (µg/l);

Cblank: Nồng độ của Chì (Pb) trong mẫu Blank (µg/l);

m: Khối lượng của mẫu thực (g);

K: Hệ số pha loãng;

X: Hàm lượng Chı̀ (Pb) trong mẫu thực (µg/kg)

2.6.3 Xác định tồn dư As của chế phẩm Chlorophyllin và muối natri của đồng Chlorophyllin [3]

 Mục tiêu:

Xác định tồn dư As của chế phẩm nhằm kiểm tra chỉ tiêu đảm bảo an toàn thực phẩm của các chế phẩm

 Tiến hành:

Cân chính xác trong khoảng 0,2 - 2g mẫu, thêm 10 ml HNO3 65%, 1 ml H2O2,

1 ml H2O, đun trên bếp gia nhiệt ở nhiệt độ 40 oC đến khi không thấy khí NO2 bay

ra (khoảng 30 phút) Sau đó đặt chương trình vô cơ hóa trong lò vi sóng phá mẫu

Quá trính phá mẫu kết thúc, lấy mẫu ra cốc có mỏ dung tích 100ml, đuổi hơi axit trên bếp cách thủy đến muối ẩm, định mức vào bình 25 ml, thêm 2,5ml dung dịch KI 10%, 2,5 ml axit Ascobic 1% và định mức tới vạch bằng bằng HCl 5% sau

đó đem đo mẫu trên hệ thống quang phổ hấp thụ nguyên tử VGA-AAS

Xây dựng đường chuẩn:

+ Hút 1ml dung dịch gốc chuẩn As 1000 ppm vào bình định mức 100 ml, định mức tới vạch bằng HCl 5% thu được dung dịch chuẩn As 10ppm Bảo quản ở nhiệt độ phòng, sử dụng trong 1 tháng

+ Hút 1 ml dung dịch chuẩn As 10ppm vào bình định mức 100ml, định mức