Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn và tạo chế phẩm ứng dụng cho phân hủy nhanh rơm rạ làm phân bón hữu cơ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI --- NGUYỄN VĂN SƠN NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN VÀ TẠO CHẾ PHẨM ỨNG DỤNG CHO PHÂN HỦY NHANH RƠM RẠ LÀM PHÂN BÓN H

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

NGUYỄN VĂN SƠN

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN VÀ TẠO CHẾ PHẨM ỨNG DỤNG CHO PHÂN HỦY NHANH RƠM RẠ LÀM

PHÂN BÓN HỮU CƠ

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :

TS LÊ VĂN TRI

TS NGUYỄN LIÊU BA

LỜI CAM ĐOAN Tôi là Nguyễn Văn Sơn xin cam đoan rằng, đây là công trình nghiên cứu của

tôi Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là kết quả do tôi thực hiện

dưới sự hướng dẫn của TS Lê Văn Tri và TS Nguyễn Liêu Ba, số liệu đảm bảo

trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả

Nguyễn Văn Sơn

LỜI CÁM ƠN

Trong suốt quá trình ho ̣c tâ ̣p và hoàn thành luâ ̣n văn này , tôi đã nhâ ̣n được sự hướng dẫn, giúp đỡ quý báu của các thầy cô , các anh chị, em đồng nghiệp Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin đươ ̣c bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới:

Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn Viê ̣n Công nghê ̣ sinh ho ̣c – Công nghê ̣ thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội và Công ty cổ phần công nghê ̣ sinh ho ̣c đã tạo mọi điều kiện th uâ ̣n lợi giúp đỡ tôi trong quá trình ho ̣c tâ ̣p và hoàn thành luâ ̣n văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc t ới TS Lê Văn Tri – Công ty cổ phần công nghê ̣ sinh ho ̣c , TS Nguyễn Liêu Ba – Viê ̣n Công nghê ̣ sinh ho ̣c và Công

nghê ̣ thực phẩm – Đại học Bách Khoa Hà Nội đã hết lòng giúp đỡ , hướng dẫn chỉ bảo cho tôi rất nhiều để tôi có thể hoàn thành được luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong hô ̣i đồng chấm luâ ̣n văn đã cho tôi những đóng góp quý báu để hoàn chỉnh luâ ̣n văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình , bạn bè, các anh chị em đ ồng nghiệp giúp đỡ tôi và chia sẻ kinh nghiệm trong công việc

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Học viên

Nguyễn Văn Sơn

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Sơ lươ ̣c về Xa ̣ khuẩn 3

1.1.1 Phân bố của xạ khuẩn 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái, kích thước va ̀ cấu tạo của xạ khuẩn 4

1.1.3 Đặc điểm sinh lý của xạ khuẩn 6

1.1.4 Đặc điểm phân loại xạ khuẩn 8

1.1.5 Mô ̣t số ứng dụng của xạ khuẩn trong sản xuất 8

1.2 Tổng quan về rơm rạ 10

1.2.1 Khái quát chung về rơm rạ 10

1.2.2 Tình hình quản lý và các cách sử dụng rơm rạ 13

1.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật trong xử lý rơm rạ 18

1.3.1 Tình hình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật trong xử lý rơm rạ trên thế giới 18

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật trong xử lý rơm rạ tại Việt Nam 19

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Vật liệu 24

2.1.1 Nguyên vật liệu 24

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 24

2.1.3 Hóa chất 24

2.1.4 Môi trường dinh dưỡng 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu 28

2.2.2 Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 28

2.2.3 Phương pháp phân loại xạ khuẩn 29

2.2.4 Phương pháp xác định tính đối kháng của xạ khuẩn 32

2.2.5 Phương pháp xác định sinh khối của tế bào 32

2.2.6 Phương pháp đánh giá khả năng tổng hợp enzym ngoại bào của xạ khuẩn tuyển chọn bằng cách xác định đường kính phân giải 33

2.2.7 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sinh trưởng và phát triển của các chủng xạ khuẩn 33

2.2.8 Định lượng xenluloza 35

2.2.10 Phương pháp kiểm tra số lượng vi sinh vật trong chế phẩm 36

2.2.11 Đánh giá khả năng phân hủy rơm ở quy mô phòng thí nghiệm 36

2.3.12 Xác định một số chỉ tiêu phân ủ 36

2.2.13 Phân tích thống kê 38

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân bón hữu cơ 39

3.2 Đặc điểm sinh học và phân loại các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 40

3.2.1 Đặc điểm sinh học 40

3.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 42

3.2.3 Kết quả phân loại 44

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự sinh trưởng, phát triển và tổng hợp enzym ngoại bào của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 47

3.3.1 Nhiệt độ 47

3.3.2 pH ban đầu 50

3.3.3 Nguồn cacbon 51

3.3.4 Nguồn Nitơ 52

3.3.5 Động thái sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 54

3.3.6 Đánh giá khả năng sinh các enzym ngoại bào khác 54

3.3.7 Kiểm tra tính đối kháng của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 55

3.4 Sản xuất chế phẩm vi sinh vật phân giải rơm rạ sản xuất tại phòng thí nghiệm 56

3.5 Biến động xạ khuẩn trong chế phẩm theo thời gian 57

3.6 Thử nghiệm hiệu quả xử lý rơm rạ của chế phẩm được tạo ở quy mô phòng thí nghiệm 58

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62

1 Kết luận 62

2 Kiến nghị 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

PHỤ LỤC TRÌNH TỰ GENE MÃ HÓA 16S-rRNA 70

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

lạc

FAO Food and Agriculture Organization

of the United Nations

Tổ chức Nông nghiệp và lương thực Liên Hiệp Quốc

SEM Scanning Electron Microscopy Kính hiển vi điện tử quét

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Diện tích, năng suất, sản lượng lúa gạo, lượng rơm rạ tại Việt Nam [42] 11

Bảng 1.2 Thành phần của rơm rạ [27] 12

Bảng 3.1 Khả năng tổng hợp enzym ngoại bào của các chủng xạ khuẩn 39

Bảng 3.2 Màu sắc của các chủng xạ khuẩn trên các môi trường ISP khác nhau 40

Bảng 3.3 Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon khác nhau của 2 chủng XK17 và XK37 42

Bảng 3.4 Khả năng sinh trưởng của chủng xạ khuẩn XK17 và XK37 ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau 43

Bảng 3.5 So sánh đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn XK17 với chủng chuẩn S tendae ISP 5101 [68] 44

Bảng 3.6 So sánh đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn XK17 với chủng chuẩn S thermocoprophilus [55] 45

Bảng 3.7 Kết quả so sánh trình tự gene mã hóa 16S rRNA của chủng XK17 với gene tương ứng của các chủng xạ khuẩn được đăng ký trên GenBank 46

Bảng 3.8 Kết quả so sánh trình tự gene mã hóa 16S rRNA của chủng XK37 với gene tương ứng của các chủng xạ khuẩn được đăng ký trên GenBank 47

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của chủng xạ khuẩn tuyển chọn 48

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp enzym của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 48

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của pH ban đầu lên khả năng sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 50

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp enzym của chủng 50

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 51

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của các nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp enzym 52

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ lên khả năng sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 53

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ lên khả năng sinh tổng hợp enzyme của các

chủng xạ khuẩn tuyển chọn 53

Bảng 3.17 Động thái sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 54

Bảng 3.18 Khả năng sinh các enzym khác 55

Bảng 3.19 Biến động xạ khuẩn trong chế phẩm 57

Bảng 3.20 Kết quả phân tích rơm rạ trước khi xử lý 58

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Một số chi xa ̣ khuẩn Microtetraspora; Streptomyces [6] 3

Hình 1.2 Các dạng cuống sinh bào tử ở xạ khuẩn [6] 7

Hình 1.3 Các loại khuẩn ty của xạ khuẩn [6] 8

Hình 1.4 Tỷ trọng tổng giá trị sản lượng nông nghiệp [29] 11

Hình 1.5 Rơm rạ sau thu hoạch 11

Hình 1.6 Hình ảnh sợi xenluloza phân lập từ rơm rạ [59] 13

Hình 1.7 Đốt rơm rạ ……… 16

Hình 3.1 Khả năng sinh tổng hợp enzym enzym CMCaza và Xylanaza của XK17 và XK37……… 40

Hình 3.2 Khả năng hình thành sắc tố melanin của 2 chủng 41

Hình 3.3 Hình dạng bề mặt bào tử, và khuẩn ty của chủng xạ khuẩn 42

Hình 3.4 Khả năng phân hủy cơ chất CMC và Xylan của chủng XK17 (A) và XK37 (B) ở nhiệt độ 400C, 450C, 500C 49

Hình 3.5 Kết quả kiểm tra tính đối kháng của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu 56

Hình 3.6 Bố trí các thí nghiệm 59

Hình 3.7 Mẫu rơm sau 15 ngày (A) và 45 ngày (B) xử lý bằng chế phẩm 60

MỞ ĐẦU

Các loại cây trồng nói chung và cây lúa nói riêng, sau khi thu hoạch đã lấy đi của đất nguồn dinh dưỡng rất lớn Một phần dinh dưỡng đó nằm trong sản phẩm thu hoạch phục vụ con người, phần không nhỏ còn lại nằm trong rơm rạ Hiện nay trong sản xuất lúa gạo lượng rơm rạ thường được đốt ngay tại ruộng, gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng sức khỏe con người, làm mất đi vĩnh viễn nhiều nguyên tố quan trọng mà cây trồng đã lấy đi từ đất, đặc biệt là cacbon Tình trạng này tiếp diễn cùng với sự lạm dụng phân hoá học sẽ làm cho đất ngày càng cằn cỗi và chai cứng

Việt Nam là nước xuất khẩu gạo lớn thứ hai thế giới với diện tích gieo trồng lúa cả năm ước đạt hơn 7,8 triệu ha, đạt sản lượng 44,84 triệu tấn lúa gạo [39] Tương ứng với diện tích gieo trồng đó, lượng rơm rạ sản xuất ra hàng năm ít nhất là 45,6 triệu tấn [7] Với lượng rơm rạ lớn cần thiết phải có hướng xử lý thích hợp để vừa tránh gây ô nhiễm môi trường, vừa đem lại lợi ích kinh tế Trong nhiều biện pháp xử lý đã được áp dụng thì xử lý rơm rạ làm phân bón hữu cơ bằng các chế phẩm sinh học

là một biện pháp có nhiều ưu điểm hơn cả [41, 42]

Việc xử lý rơm rạ làm phân bón bằng chế phẩm sinh học ngoài tác dụng giảm ô nhiễm môi trường còn tạo ra được lượng lớn phân bón hữu cơ để bón cho cây trồng, góp phần hạn chế việc lạm dụng phân hoá học trên đồng ruộng, đảm bảo năng suất, nâng cao chất lượng nông sản, lấy lại độ phì nhiêu cho đất, tăng độ tơi xốp đất, tăng hàm lượng vi sinh vật trong đất Đây là một giải pháp quan trọng trong việc tạo nên một nền nông nghiệp bền vững Bản chất của phương pháp này là

sử dụng các vi sinh vật có khả năng phân hủy lignoxenluloza để phân hủy rơm rạ

Đã có nhiều công trình nghiên cứu đã phân lập được nhiều chủng vi sinh vật để phân hủy nhanh rơm rạ làm phân bón hữu cơ Trong các loại vi sinh vật thì xạ khuẩn có những ưu điểm như: ít độc, có thể sản sinh ra chất ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh khác, dễ tiến hành theo kiểu lên men rắn theo kiểu ủ đống Tuy nhiên xạ khuẩn ít được nghiên cứu và cần phải có những nghiên cứu tiếp theo để có kết quả toàn diện hơn

Chính vì những lý do trên, tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu tuyển

chọn một số chủng xạ khuẩn và tạo chế phẩm ứng dụng cho phân hủy nhanh rơm rạ làm phân bón hữu cơ”, với các mục tiêu và nội dung chính sau đây:

Mục tiêu cơ bản của đề tài luận văn:

- Nghiên cứu, tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính xenlulaza, CMC-aza, xylan-aza, từ đó tạo ra loại chế phẩm sinh học có tác dụng phân hủy rơm

rạ làm phân bón, quy trình xử lý đơn giản

Nội dung nghiên cứu:

- Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính xenlulaza, CMC-aza, aza từ bộ sưu tập xạ khuẩn của Công ty cổ phần Công nghệ sinh học

xylan Nghiên cứu một số đặc điểm sinh hóa của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng lên sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme CMCaza và xylanaza của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn

- Tạo và thử nghiệm khả năng phân hủy rơm rạ của chế phẩm từ các chủng xạ khuẩn tuyển chọn ở quy mô phòng thí nghiệm

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 Sơ lươ ̣c về Xa ̣ khuẩn

1.1.1 Phân bố của xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuô ̣c ngành Tenericutes, thuô ̣c giới vi khuẩn thâ ̣t

(Eubacteria) và siêu giới nhân sơ (Prokaryota) Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria,

dưới lớp Actinobacteridae, bô ̣ Actinomycetales, bao gồm 10 dưới bô ̣, 35 họ, 110 chi

và hơn 1000 loài trong đó có 478 loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc

các chi còn lại được xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm [16, 49]

Hình 1.1 Một số chi xa ̣ khuẩn Microtetraspora; Streptomyces [6]

Xạ khuẩn có một số đặc điểm như sau: tế bào xa ̣ khuẩn c ó cấu tạo dạng sợi , phân nhánh (giống như nấm), kích thước rất nhỏ, không có màng nhân và tiểu hạch, vách tế bào không chứa xenluloza hoặc kitin, phân chia tế bào giống với vi khuẩn (kiểu Amitoz) Xạ khuẩn không có giới tính (không có tế bào đực cái), hoại sinh và

ký sinh [16, 49]

Xạ khuẩn phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, nước, không khí, một phần trong bùn và trong các chất hữu cơ khác, xạ khuẩn cũng thường sống hoại sinh trên xác các sinh vật (cây chết, rơm rạ) nhưng cũng có thể kí sinh trên thân, củ hoặc

rễ cây Số lượng xạ khuẩn trong đất không chỉ phụ thuộc vào loại đất mà còn phụ thuộc vào mức độ canh tác của đất và khả năng bao phủ của thực vật Đất giàu dinh dưỡng thì lớp đất bề mặt thường có số lượng lớn xạ khuẩn Mật độ xạ khuẩn trong đất chiếm từ 20-40% tổng số các VSV có trong đất và trong 1g đất có khoảng 29.000-24.000.000 CFU (Colony Forming Unit) Số lượng xạ khuẩn trong đất phụ thuô ̣c vào nhiệt độ, độ ẩm, độ pH của môi trường và cũng thay đổi theo thời gian trong năm Đa

số xạ khuẩn là các vi sinh vật hiếu khí, ưa ấm, nhiệt độ tối thích cho sự sinh trưởng và phát triển là 20-450C, và nhiệt độ sinh trưởng thấp nhất là 15-200C, nhiệt độ sinh trưởng cao nhất là khoảng 45-500

C Một số khác có thể phát triển ở những nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn Độ ẩm thích hợp từ 40-60%, giới hạn pH nằm trong khoảng 6,8-7,5 Một số xạ khuẩn có thể sống trong đất có nồng độ muối NaCl (0,5-1 g/l),

nhiều loài thuộc chi Streptomyces và Nocardia sinh trưởng tốt khi ở nồng độ NaCl 10%, Micromonospora sp và Salinospora sp cũng có khả năng chịu mặn cao [6, 16,

23, 42, 47, 55, 56, 60]

1.1.2 Đặc điểm hình thái, kích thước va ̀ cấu tạo của xạ khuẩn

1.1.2.1 Hình thái và kích thước

Đa số xạ khuẩn có cấu tạo dạng sợi phân nhánh gọi là khuẩn ty (hypha), mỗi một khuẩn ty do 1 tế bào tạo thành, các khuẩn ty kết với nhau tạo thành khuẩn lạc

có nhiều màu sắc khác nhau: trắng, vàng, nâu, tím, xám Đường kính khuẩn ty của

xạ khuẩn khoảng từ 0,1 - 0,5μm Có thể phân biệt được hai loại khuẩn ty khác nhau: Khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất Khuẩn ty khí sinh là hệ sợi mọc trên bề mặt môi trường tạo thành bề mặt của khuẩn lạc xạ khuẩn Từ đây phát sinh ra bào tử Khuẩn ty cơ chất là sợi cắm sâu vào môi trường làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng Khuẩn ty cơ chất sinh ra sắc tố thấm vào môi trường, sắc tố này thường có màu khác với màu của khuẩn ty khí sinh

Khuẩn lạc xạ khuẩn thường rắn chắc, xù xì, có thể có dạng da, dạng phấn, dạng nhung, dạng vôi phụ thuộc vào kích thước bào tử Trường hợp không có khuẩn

ty khí sinh khuẩn lạc có dạng màng dẻo Kích thước khuẩn lạc thay đổi tuỳ loài xạ khuẩn và tuỳ điều kiện nuôi cấy Khuẩn lạc thường có dạng phóng xạ, một số có dạng những vòng tròn đồng tâm cách nhau một khoảng nhất định [6, 23]

1.1.2.2.Đặc điểm cấu tạo của xạ khuẩn

Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự vi khuẩn Gram dương , toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm : thành tế bào , màng sinh chất , nguyên sinh chất , chất nhân và các thể ẩn nhâ ̣p

Thành tế bào xạ khuẩn (CW-Cell Wall) có dạng kết cấu lưới dày khoảng 10 – 20 nm, có tác dụng duy trì hình dáng và bảo vệ tế bào Căn cứ vào kết cấu hóa học người ta chia thành tế bào thành 4 nhóm:

- Nhóm CW I: có chứa L, L-DAP (axit L – 2,6 diaminopimelic) và glyxin

Thuộc nhóm này có Streptomyces, Streptoverticillium, Sporichthya, Nocardioides

- Nhóm CW II: có chứa m-DAP (axit meso – 2,6 – diaminopimelic) và

glyxin Thuộc nhóm này có Micromonospora, Actinoplanes, Ampullariella

- Nhóm CW III: có chứa m-DAP (axit meso – 2,6 – diaminopimelic) Gồm

các chi Dermatophilus, Geodermatophilus, Frankia, Actinomadura, Nocardiopsis,

Microbispora, Thermoactinomyces, Thermomonospora, Planomonospora, Planobispora, Streptosporangium, Actinosynnema

- Nhóm CW IV: có chứa m-DAP (axit meso – 2,6 – diaminopimelic),

arabionose và galactose Gồm các chi Nocaridia, Oerskovia, Promicromonospora,

Pseudonocardia, Rhodococcus, Mycobacterium, Saccharomonospora, Saccharopopyspora, Actinopolyspora [6]

Màng sinh chất của xạ khuẩn dày khoảng 7,5 – 10 nm gồm thành phần chủ yếu là photpholipit và protein, chúng có cấu trúc và chức năng tương tự như màng sinh chất của vi khuẩn Trên màng có nhiều enzym có vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển các chất qua màng [6]

Thể trung gian hay mesosome nằm ở phía trong của màng sinh chất và có hình phiến, hình bọng hay hình ống Tác dụng của thể trung gian là làm tăng diện tích tiếp xúc của màng tế bào từ đó làm tăng cường hoạt tính của enzyme, tăng chuyển điện tử…[6]

Một trong những đặc điểm đáng lưu ý của xạ khuẩn là chúng không bền vững về di truyền và thường xảy ra sự đột biến trong phân tử DNA Điều này tạo ra tính đa dạng về hình thái, tính kháng thuốc do sự xuất hiện các dị vòng [17]

1.1.3 Đặc điểm sinh lý của xạ khuẩn

1.1.3.1 Đặc điểm nhu cầu dinh dươ ̃ng của xạ khuẩn

Nhu cầu dinh dưỡng ở các loài vi sinh vâ ̣t là rất khác nhau Ngay trong cùng

mô ̣t loài vi sinh vâ ̣t nhu cầu này cũng không có sự thống nhất Giống như các loài vi sinh vâ ̣t khác, nhu cầu dinh dưỡng ở các loài xạ khuẩn cũng khác nhau Trong công nghiê ̣p, tùy thuộc vào mục đích mà người ta sử dụng các nguồn dinh dưỡng thích

hơ ̣p nhằm thu được năng suất cao nhất

a Nhu cầu cacbon

Cacbon chiếm 50% vâ ̣t chất khô của vi sinh vâ ̣t, là yếu tố quan trọng trong các

hơ ̣p chất hữu cơ có mă ̣t trong tế bào Các hợp chất cacbon là nguồn nguyên l iê ̣u cho mọi hoạt động sống Trong tự nhiên có 2 dạng hợp chất cacbon cơ bản là cacbon vô

cơ và cacbon hữu cơ , mỗi s inh vâ ̣t khác nhau sử du ̣ng nguồn cacbon khác nhau Dựa vào nguồn dinh dưỡng cacbon mà người ta chia vi sinh vâ ̣t thành 2 nhóm chính: Dị dưỡng và tự dưỡng cacbon [18]

Xạ khuẩn là vi sinh vật dị dưỡng cacbon , xạ khuẩn có khả năng phân giải các

hơ ̣p chất hydratcacbon khác nhau từ da ̣ng đơn giản (acetat, lactat, các loại đường đơn), đến các dạng phức tạp (oligosaccharid, polysaccharide)

Frankraceae có khả năng cố định nitơ nhờ cộng sinh với rễ cây họ đậu [8]

c Nhu cầu vitamin và khoáng chất

Trong tế bào xạ khuẩn ngoài nư ớc, các chất hữu cơ còn có các vitamin và chất khoáng Lượng chất này trong tế bào thay đổi theo tùy loài Tùy giai đoạn, điều

kiện sinh trưởng mỗi yếu tố đều có tác động nhất định đối với sự phát triển của tế bào mà các nhân tố khác không thể thay thế được.

Nguyên tố khoáng được chia làm hai loại:

- Nguyên tố đa lượng: P, K, Ca, Mg, Fe, Na, Cl

- Nguyên tố vi lượng: Mn, Cu, Co, B …

1.1.3.2 Đặc điểm sinh sản ở xạ khuẩn

Xạ khuẩn sinh sản sinh dưỡng bằng bào tử Bào tử được hình thành trên các nhánh phân hoá từ khuẩn ty khí sinh gọi là cuống sinh bào tử Cuống sinh bào tử ở các loài xạ khuẩn có kích thước và hình dạng khác nhau Có loài dài tới 100 - 200 nm, có loài chỉ khoảng 20 - 30 nm Có loài cấu trúc theo hình lượn sóng, có loài lò xo hay xoắn ốc

Hình 1.2 Các dạng cuống sinh bào tử ở xạ khuẩn [6]

Ngoài hình thức sinh sản bằng bào tử, xạ khuẩn còn có thể sinh sản bằng khuẩn ty Các đoạn khuẩn ty gãy ra môi trường phát triển thành hệ khuẩn ty [6, 9, 67]

Hình 1.3 Các loại khuẩn ty của xạ khuẩn [6]

1.1.4 Đặc điểm phân loại xạ khuẩn

Hiện nay, số lượng các loài xạ khuẩn mới được mô tả ngày càng nhiều, để việc phân loại nhanh và chính xác các xạ khuẩn đến loài, người ta đã sử dụng phương pháp phân loại số nghiên cứu phát sinh chủng loại Dưới đây là mô ̣t số đă ̣c điểm phân loa ̣i xa ̣ khuẩn theo phương pháp đặc điểm hình thái, tính chất nuôi cấy:

- Tính chất nuôi cấy: bao gồm khả năng sinh trưởng phát triển trên các môi trường phân loại, màu sắc khuẩn ty khí sinh (phân vào 7 nhóm màu), màu sắc khuẩn

ty cơ chất, sắc tố hòa tan

- Đặc điểm hình thái: hình dạng cuống sinh bào tử (thẳng, lượn, sóng, móc, xoắn, chùm), hình dạng bào tử (tròn, ovan, que, nhẵn, xù xì, gai và tóc), hình thành bào tử (cắt khúc, kết đoạn) và khả năng sinh melanin

- Đặc điểm sinh lý hóa: khả năng đông kết và pepton hóa sữa (có proteaza); khả năng phân giải tinh bột (có amylaza); khả năng phân giải xenluloza (có xenlulaza); khả năng sử dụng đường: glucose, arabinose, galactose, xylose, fructose, mannose, và khả năng đối kháng các chủng sinh vật [6, 9, 17, 63, 66, 67, 68]

1.1.5 Mô ̣t số ứng dụng của xạ khuẩn trong sản xuất

1.1.5.1 Y ho ̣c, khống chế sinh học và bảo vê ̣ thực vật

Đặc trưng của xạ khuẩn là có khả năng hình thành kháng sinh (antibiotic)

Trong số 8000 kháng sinh hiện nay thì trên thế giới có trên 80% là có nguồn gốc từ xạ

khuẩn Các kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn có tính phổ kháng khá rộng Ứng dụng của các chất kháng sinh được sản xuất từ xạ khuẩn trong bảo vệ thực vật trên thế giới cũng đã được nghiên cứu, tuy còn ở mức thấp nhưng đã thu được những thành tựu nhất định trong nền công nghiệp hiện đại Sự có mặt của xạ khuẩn đối kháng trong đất làm giảm rõ rệt tỉ lệ mắc bệnh của cây Thông thường một loại xạ khuẩn đối kháng có thể ức chế một vài loại nấm gây bệnh nhưng có những loài hoạt động rộng có thể ức chế nhiều tác nhân gây bệnh có trong đất [23,41,42]

1.1.5.2 Thực phẩm

Trong quá trình trao đổi chất, xạ khuẩn còn có thể sinh ra các chất hữu cơ

như các loại vitamin nhóm B (B1, B2, B6, B12) như Actinomyces olivaaceus,

Actinomyces oriceus…; caroten - tiền vitamin A (các chủng xạ khuẩn được quan

tâm như Microbacterium smegmatis, Blakeslea trispora, Streptomyces

chrestomyceticus…); một số axit hữu cơ như axit lactic, axit acetic; và nhiều axit

amin như axit glutamic, axit methionin, tryptophan, lysin Do đó, trong tương lai có thể dùng xạ khuẩn trong công nghiệp chế biến thực phẩm [18]

1.1.5.3 Đất và sinh thái

Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật phân bố rộng rãi trong đất nên chúng tham gia vào các quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ trong đất như xenluloza, tinh bột

…v.v góp phần khép kín vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên Xạ khuẩn có vai trò quan trọng trong quá trình tạo ra độ phì nhiêu của đất, chúng đảm nhiệm nhiều chức năng khác nhau trong việc làm màu mỡ thêm cho đất [23,41,42]

1.1.5.4 Kích thích sinh trưởng cây trồng

Một số khác còn có khả năng tạo thành những chất kích thích sinh trưởng Có rất nhiều xạ khuẩn trong đất cũng có khả năng sinh tổng hợp auxin – mô ̣t da ̣ng phytohoocmon rất có ý nghĩa đối với cây trồng Trong các auxin , β – indole acetic acid (IAA) là một kích thích tố sinh trưởng thực vật được người ta quan tâm nhiều Đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng ta ̣o IAA của xa ̣ khuẩn , các chủng xạ

khuẩn có khả năng sinh tổng hợp IAA như : Streptomyces olivochromoferus 1/247

có khả năng tạo thành 33 µgIAA/ml canh trường , Streptomyces olivochromoferus

1/294 có khả năng tạo thành 9 µgIAA/ml canh trườ ng [12,15]

1.1.5.5 Tạo chế phẩm sinh học phân hủy rác hữu cơ, phụ phẩm nông nghiệp

Xạ khuẩn tham gia tích cực vào việc chuyển hoá và phân giải nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp và bền vững như xenluloza Xạ khuẩn có khả năng phân giải

xenluloza khá cao, đáng chú ý là Streptomyces, Actinomyces, Nocardia,

Mycromonospora Người ta thường sử dụng xạ khuẩn đặc biệt là Streptomyces

trong việc phân hủy rác sinh hoạt Những xạ khuẩn này thường thuộc nhóm ưa nhiệt, sinh trưởng, phát triển tốt ở nhiệt độ 45 – 500C do vậy chúng có thể sinh trưởng và hoạt động mạnh mẽ trong đống ủ ngoài thực tế.Do đó, hiê ̣n nay xa ̣ khuẩn

là một trong những nhóm vi sinh vật được đă ̣c biê ̣t sử du ̣ng rô ̣ng rãi trong lĩnh v ực tạo các chế phẩm sinh ho ̣c dùng để xử lý phu ̣ phẩm trong quá trình sản xu ất nông nghiệp như rơm rạ, tàn dư thực vật, phân thải chăn nuôi …mang la ̣i hiê ̣u quả to lớn [6, 28, 41, 42, 45, 54]

1.2 Tổng quan về rơm rạ

1.2.1 Khái quát chung về rơm rạ

Theo thống kê của FAO (2015) sản lượng lúa gạo thế giới đạt 749,1 triệu tấn tăng 1% so với năm 2014 (741,8 triệu tấn) và có xu thế tăng trong những năm tiếp theo Sản lượng lúa gạo tại châu Á chiếm tới 90,4% toàn thế giới, tức là 677,7 triệu tấn, trong đó tập trung tại Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Pakistan và Việt Nam [51]

Việt Nam là một quốc gia nông nghiệp, do vậy cây lúa luôn giữ vị trí trung tâm trong nông nghiệp và kinh tế nước ta Hiện nay, vẫn có khoảng 80% trong tổng

số 11 triệu hộ nông dân Việt Nam tham gia sản xuất lúa gạo, với diện tích gieo cấy lúa cả nước đạt 7.651,4 nghìn ha chiếm tới 94,7% tổng diện tích gieo trồng cây lương thực có hạt [38] Tổng sản lượng lúa cả năm cả nước đạt 45,2 triệu tấn năm

2015, tăng 240,9 nghìn tấn so với năm 2014 [39] Việt Nam hiện đang đứng thứ 3 thế giới về xuất khẩu gạo, sau Ấn Độ (10,2 triệu tấn), và Thái Lan (gần 9,6 triệu tấn) [46]

Hình 1.4 Tỷ trọng tổng giá trị sản lượng nông nghiệp [29]

Tuy nhiên, ngoài sản phẩm chính là lúa gạo, việc trồng lúa đã và đang tạo ra một lượng lớn phế phẩm sau khi thu hoạch đó là rơm rạ Rơm rạ là thành phần dư thừa của cây lúa sau khi thu hoạch, gồm có thân, bẹ và lá Tùy vào từng giống lúa

và điều kiện canh tác cũng như thổ nhưỡng, rơm rạ có thể chiếm từ 50 ÷ 70 % tổng sản lượng sinh khối sản xuất của cây lúa Theo tính toán, sau khi thu hoạch, bình quân mỗi hecta lúa thu được 6 – 8 tấn rơm [41] Như vậy, nếu toàn bộ diện tích trồng lúa của Việt Nam được thu hoạch thì lượng rơm rạ dư thừa hàng năm rất lớn dao động từ 43,16 – 45,99 triệu tấn/năm [42]

Hình 1.5 Rơm rạ sau thu hoạch

Bảng 1.1 Diện tích, năng suất, sản lượng lúa gạo, lượng rơm rạ tại Việt Nam [42] Năm

Chi tiết

Năng suất (tạ/ha) 42.9 45.9 46.4 48.6 48.9 Sản lượng lúa (1.000 tấn) 32108.4 34447.2 34568.8 36148.9 35832.9 Lượng rơm rạ

sau thu hoạch (1.000tấn) 44,956 45,026 44,713 43,672 43,975

sau thu hoạch (1.000tấn)

43,949 43,155 44,536 43,623 44,082

Thành phần chính của rơm rạ gồm chủ yếu là xenluloza (42,41%), hemixenlluloza (12,65%), lignin (18,62%) Thành phần nguyên tố (tính theo % khối lượng) như sau C chiếm 44%, H chiếm 5%, N chiếm 0,92% và Oxy chiếm

49%, cùng một lượng rất nhỏ P (photpho), S (lưu huỳnh), K (kali) [50]

Bảng 1.2 Thành phần của rơm rạ [27]

Hình 1.6 Hình ảnh sợi xenluloza phân lập từ rơm rạ [59]

A Kính hiển vi điện tử quét (SEM); B Kính hiển vi quang học

1.2.2 Tình hình quản lý và các cách sử dụng rơm rạ

1.2.2.1 Tình hình quản lý rơm rạ

 Thế giới

- Mỹ: Bang California là nơi sản xuất lúa gạo lớn của Mỹ, trong đó 95% lúa

được trồng ở Thung lũng Sacramento Với khoảng 500.000 mẫu (tương đương với hơn 186 nghìn ha) đất trồng lúa, hàng năm khu vực này sinh ra trên 1 triệu tấn rơm Sau khi thu hoạch, rơm rạ thường được đốt ngoài đồng sau đó được cày trộn với đất trồng Năm 1989, khi 95% diện tích 162.000 ha lúa ở bang California đều được tiến hành đốt đã gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Năm 1991, Chính quyền bang California vừa thông qua đạo luật hạn chế đốt đồng, trong đó từ năm 1991-1996 giảm 10% diện tích đốt ngoài đồng [20, 43]

- Ấn Độ: Chính phủ khuyến cáo nông dân không nên đốt rơm rạ vì mục đích chống ô nhiễm môi trường Họ khuyến cáo nông dân vùi rơm rạ vào đất để tăng cường dinh dưỡng cho đất, hoặc dùng làm thức ăn cho gia súc… [32]

- Trung Quốc: Hiện nay, đốt cháy rơm được sử dụng chủ yếu trong sản xuất năng lượng ở Trung Quốc, chiếm tới 72,2% Tuy nhiên, việc đốt cháy rơm rạ gây nên tổn thất nặng nề cho môi trường sinh thái địa phương Mặc dù đã có một số phương pháp để tái sử dụng rơm rạ, ví dụ như làm thức ăn cho động vật, nhiên liệu đun nấu, sưởi, làm giấy, một lượng lớn rơm rạ vẫn chưa được sử dụng và đốt trên đồng, gây ra nhiều vấn đề về môi trường và an toàn [5]

- Nhật Bản: Rơm hiện được sử dụng và tiêu hủy theo các cách sau: cày xới lại vào đất trên đồng 61,5%, thức ăn cho động vật 11,6%, làm phân xanh 10,1%, lợp mái cho chuồng nuôi gia súc 6,5%, vật liệu che phủ trên ruộng 4%, đồ thủ công 1,3%, các loại khác 0,3%, đốt cháy 4,6% Hiện tại, 60% rơm rạ được sản xuất ra theo cách cắt khúc tự động bằng các máy gặt liên hợp, được trải lên ruộng và sau đó được cày lẫn vào với đất [5]

- Thái Lan: Hàng năm có từ 8-14 triệu tấn rơm rạ được đốt ngoài đồng sau khi thu hoạch, gây ô nhiễm môi trường Việc đốt rơm rạ lộ thiên phổ biến nhất ở các vùng thuộc miền Trung nước này Một số nghiên cứu tại đây cho thấy, rơm rạ có thể được sử dụng để đốt nóng và sản xuất điện Chi phí để sản xuất điện từ rơm rạ là

từ 1,36 Baht/kWh (với giá rơm rạ từ 930-1500 Baht/tấn) không cạnh tranh so với than (1,07 Baht/kWh), nhưng lại cạnh tranh so với biomass khác (1,27-1,92 Baht/kWh) Tuy nhiên, việc sử dụng rơm rạ cho các nồi hơi công nghiệp lại là lựa chọn linh hoạt và cạnh tranh, với hai phương án: (1) lắp đặt các nồi hơi mới được đốt nóng bằng rơm rạ thay vì bằng dầu hoặc khí gas tự nhiên; (2) chuyển từ dùng than sang dùng rơm rạ đối với các lò hơi hiện có [5]

 Việt Nam

Bộ NN&PTNN ra quyết định số 3119/QĐ-BNN-KHCN ngày 16/12/2011, phê duyệt đề án giảm phát thải khí nhà kính trong nông nghiệp nông thôn đến năm 2020 Một trong các nội dung chính của đề án là thu gom, tái sử dụng và xử lý triệt để rơm

rạ nhằm hạn chế tối đa đốt, vùi gây phát thải khí nhà kính và ô nhiễm môi trường Với quy mô xử lý là 100 % diện tích gieo trồng, tương ứng với 7 triệu ha gieo trồng lúa, việc thực hiện đề án ước tính sẽ giảm phát thải 1,54 triệu tấn CO2 [1]

Ngày 13 tháng 7 năm 2011, Văn phòng Chính Phủ đã ra công văn số 4753/VPCP-KTN về việc thực hiện chỉ đạo của Phó Thủ tướng Hoàng Trung Hải giao Bộ Tài nguyên và Môi trường nghiên cứu, đề xuất biện pháp xử lý vấn đề

“Nhiều khu phố Hà Nội tràn ngập khói do nông dân vùng lân cận đốt rơm rạ Đốt rơm rạ là cách làm tổn hại đến tài nguyên quốc gia, gây ra nhiều hậu quả nghiêm

trọng Môi trường bị hủy hoại, lãng phí tài nguyên, góp phần làm tăng tình trạng biến đổi khí hậu, ảnh hưởng đến sức khỏe nhân dân” [4]

1.2.2.2 Một số biện pháp sử dụng rơm rạ

- Đun nấu: Theo truyền thống tại nhiều vùng nông thôn ở Việt Nam, Trung Quốc, Banglades, Nepal, v.v., rơm rạ vẫn được dùng làm chất đốt, để đun nấu [32,42]

- Làm thức ăn gia súc: Đa số nông dân ở các nước châu Á bổ sung rơm và cỏ vào trong khẩu phần thức ăn để nuôi trâu bò Nông dân thường gom rơm rạ khô chất thành đống ở quanh nhà để dành cho trâu bò ăn dần Ở nhiều nơi, rơm còn được ủ với urê để trở thành thức ăn chăn nuôi có chất lượng hơn, tăng mức tiêu hóa cho trâu bò từ 5 ÷ 7 % [69]

- Làm nguyên liệu giấy: Việc sử dụng rơm rạ làm nguyên liệu trong công nghiệp giấy đã được áp dụng ở nhiều nước như Ấn Độ, Banglades, Indonesia, Pakistan, Philippin, Trung Quốc Đây là biện pháp xử lý mang lại nhiều lợi ích, tuy nhiên các dây chuyền công nghệ vẫn chưa được phổ biến rộng rãi để áp dụng [32,42, 43]

- Sản xuất nhiên liệu sinh học: Tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học từ các nguồn cơ chất xenluloza mà chủ yếu là rơm rạ Gần đây nhất là nghiên cứu của Đặng Tuyết Phương, sản xuất dầu sinh học từ rơm rạ sử dụng phương pháp nhiệt phân không sử dụng xúc tác (ở nhiệt độ 550oC) hiệu suất tạo nhiên liệu lỏng đạt 25 ÷ 30 % Theo phương pháp này, từ 1 tấn rơm rạ, có thể cho ra 250 kg nhiên liệu lỏng, loại nhiên liệu có thể sử dụng vào nhiều lĩnh vực như sản xuất hóa chất, y dược, công nghiệp, thực phẩm hoặc làm nhiên liệu [27] Một phương pháp chuyển rơm rạ thành nhiên liệu nữa là áp dụng phân giải kị khí nhờ vi sinh vật Với biện pháp này, người ta chuyển rơm rạ xuống hầm khí sinh học (biogas)[40]

- Sản xuất protein: Các nguồn xenluloza thực vật (gỗ, rơm rạ, bã mía, lõi ngô, ) được chú ý nhiều trong sản xuất protein đơn bào Với biện pháp thủy phân xenluloza bằng axit hoặc bằng enzym tạo dịch thủy phân để nuôi cấy vi sinh vật thu sinh khối [11]

- Sản xuất nấm: Trồng nấm được coi là một trong những biện pháp sinh học tận dụng nguồn rơm rạ có hiệu quả Việc trồng nấm từ rơm rạ đã được thế giới khuyến cáo như một trong những phương pháp thay thế để giảm nhẹ các vấn đề ô nhiễm môi trường liên quan đến các phương pháp xử lý hiện nay như đốt ngoài trời [27,29,40,42]

- Đốt rơm rạ: Trong những năm gần đây, tình trạng đốt rơm rạ ngoài đồng ruộng đã gia tăng nhanh chóng, trở thành tình trạng phổ biến gây ảnh hưởng tiêu cực tới môi trường và sức khỏe con người Hằng năm, lượng khí thải do đốt rơm rạ

và các phế thải từ cây ngắn ngày khác ngoài đồng ruộng ở châu Á ước tính đạt 100 ngàn tấn SO2, 960 ngàn tấn NOx, 379 triệu tấn CO2, 23 triệu tấn CO và 680 ngàn tấn

CH4 Rất nhiều các khí thải từ đốt rơm rạ là những khí gây hiệu ứng nhà kính như

CO2, CH4, N2O Ngoài ra các loại khí thải khác như SOx, NOx có thể tích tụ trong khí quyển gây ra tình trạng mưa axít cũng như gây ra các bệnh liên quan đến đường

hô hấp như khó thở, hen suyễn, viêm phế quản Đốt rơm rạ gây ra sự mất mát gần như hoàn toàn N Lượng P mất đi khoảng 25 %, K mất đi khoảng 20 % và S mất từ

5 ÷ 60 % Lượng dinh dưỡng mất mát tuỳ thuộc vào cách thức đốt rơm rạ [7, 27, 29,

41, 42, 69]

Hình 1.7 Đốt rơm rạ [42]

- Vùi rơm rạ vào đất: Đây là việc làm trả lại cho đất hầu hết các nguyên tố dinh dưỡng mà cây lúa đã lấy đi từ đất, nên nó có tác dụng bảo toàn nguồn dự trữ dinh dưỡng của đất về lâu dài Nếu kết hợp song song việc bón phân cho lúa cùng

với việc vùi rơm rạ vào đất sẽ bảo toàn được dinh dưỡng N, P, K và S cho lúa, và nhiều khi còn làm tăng được dự trữ dinh dưỡng cho đồng ruộng Tuy nhiên, việc vùi rơm rạ vào đất ướt, gây ra tình trạng tích lũy CH4, H2S, axit hữu cơ gây độc cho bộ

rễ lúa Khi vùi một lượng lớn rơm rạ tươi sẽ rất tốn lao động và cần có những máy móc thích hợp cho việc làm đất cũng như có thể gây ra những vấn đề về bệnh cây Việc trồng trọt chỉ nên bắt đầu sau 2 ÷ 3 tuần vùi rơm rạ [42, 62] Theo tính toán của các nhà khoa học, cứ vùi 4 ÷ 5 tấn rơm vào ruộng lúa theo cách hợp lý có thể làm tăng năng suất thêm 0,4 tấn/ha [14, 62]

- Làm phân ủ compost: Trong quá trình phân hóa rơm rạ, hàm lượng cacbon giảm dần trong khi hàm lượng nitơ tăng lên, tỉ lệ C/N giảm xuống dưới 20 %, hàm lượng nitơ có thể đạt tới 2 % và giảm tỉ lệ cacbonhydrat xuống dưới 35 % Tỉ lệ C/N như vậy phù hợp để bón vào đất, thúc đẩy hệ vi sinh vật đất phát triển, góp phần cải tạo

và tăng độ phì nhiêu cho đất [29, 50] Tuy nhiên ở nước ta, hướng sử dụng này thường chỉ áp dụng tại các hộ gia đình chăn nuôi nhỏ lẻ kết hợp với sử dụng rơm rạ để lót chuồng nên lượng rơm rạ được sử dụng theo cách này không nhiều [29,42] Mặc dù đây lại là một trong những biện pháp mang lại tính bền vững trong phát triển nông nghiệp hiện nay

Ủ rơm làm phân compost trước đây chủ yếu dựa vào kinh nghiê ̣m truyền thống của người nông dân (thưởng ủ chay hoă ̣c kết hợp với phân chuồng ) nên thời gian phân hủy rơm ra ̣ lâu, thường kéo dài từ 3-5 tháng, hiê ̣u quả không cao Hiê ̣n nay với sự tiến bô ̣ của KHCN , các nhà khoa học nghiên cứu và đưa ra nhiều loại chế phẩm sinh ho ̣c được ta ̣o ra từ nhiều chủng vi sinh vâ ̣t có khả năng phân hủy rơm rạ nhanh (thờ i gian phân hủy còn từ 20 – 30 ngày) hiê ̣u quả phân hủy tốt [41, 42] Các nhóm vi sinh vật được sử dụng phổ biến trong việc tạo chế phẩm phân hủy rơm rạ thường là: nấm, vi khuẩn và xa ̣ khuẩn… Trong đó , xạ khuẩn là một trong những nhóm vi sinh vật được đánh giá cao về tiềm năng phát triển bởi sự phổ biến, khả năng cung cấp một lượng lớn các sản phẩm trao đổi chất sơ cấp và thứ cấp [61]

1.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật trong xử lý rơm rạ

1.3.1 Tình hình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật trong xử lý rơm rạ trên thế giới

Gotaas (1956) đã nghiên cứu quá trình ủ nguyên liệu hữu cơ và đưa ra kết luận: nguyên liệu đầu vào dùng làm phân ủ cần phải có pH từ 5 ÷ 7; trong quá trình

ủ giai đoạn đầu, pH đạt khoảng 6, sau 2 ÷ 4 ngày, pH giảm xuống chỉ còn 4,5 ÷ 5

do các axit hữu cơ được sinh ra với lượng lớn; nhưng khi nhiệt độ đống ủ tăng cao thì pH tăng lên theo xu hướng hơi kiềm (7,5 ÷ 8,5) Tác giả cũng cho rằng không nên bổ sung thêm tro, cacbonat hoặc vôi vào đống ủ vì sẽ gây mất đạm dưới dạng

NH3 trong điều kiện pH cao [52]

Lamot và Voets (1979) đã dùng 7 vi sinh vật phân giải xenluloza (Aspergillus sp., Penicillium sp., 2 loài Chaetomium, 1 loài Slerotium rolfsii và 2 loài xạ khuẩn

Streptomyces) để phân giải xenlophan Vì xenlophan có khá nhiều thành phần các

chất bọc ngoài: 10 % nitroxenluloza và clorua polyvinyliden, 90 % xenlophan (trong đó có 76 % xenluloza) nên cơ chất này không tan trong tất cả các dung môi hữu cơ Tác giả nhận thấy nếu để từng vi sinh vật tác dụng thì sự phân giải hầu như không diễn ra, do đó phải dùng hỗn hợp vi sinh vật nói trên Tuy nhiên, xenlophan cũng bị phân giải rất chậm dưới tác dụng của hỗn hợp VSV nêu trên, phải sau gần 100 ngày lên men thì chúng mới phân hủy được 85 % cellophan Sản phẩm cuối cùng là 30 % protein, 60 % đường hòa tan được dùng làm phân bón [57]

Harper và Lynch (1984) đã nuôi hỗn hợp 2 chủng là Trichoderma harzianum (phân giải xenluloza) và Clostridium butyricum (cố định nitơ) nhằm làm tăng khả

năng phân giải xenluloza, thành phần chính trong phế thải hữu cơ [53]

- Chế phẩm enzym Cellusin thu được từ việc nuôi cấy chủng Aspergillus

niger có hoạt tính xenlulaza khoảng 450.000 đơn vị/g

- Chế phẩm “Biosin” ở Mỹ được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt

A oryzae chứa 26 enzym khác nhau trong đó có xenlulaza, amylaza, proteaza, pectinaza

- Chế phẩm “Cellolignorin” sản xuất được nuôi cấy từ Trichoderma

lignorum đã sấy khô đến độ ẩm 13 %, chứa 1 ÷ 50 đơn vị xenlulaza/g Ngoài ra còn

có các hemixenlulaza, pectinaza

B.C Behera et al (2014) đã phân lập, tuyển chọn được 15 chủng vi sinh vật

có khả năng phân hủy xenluloza từ khu vực đất ngập mặn của đồng bằng sông Mahanadi (Ấn Độ), các chủng vi sinh vật này được xác định thuộc các loài:

Micrococcus spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp., Xanthomonas spp và Brucella

spp Các thí nghiệm trong nghiên cứu này cũng cho thấy hoạt tính của các chủng được phân lập dao động từ 2,471 – 98,253 U/ml/phút [48]

Mohamed Ali Abdel-Rahman et al (2015) sử dụng 2 chủng vi khuẩn Bacillus

licheniformis 1-1v và Bacillus sonorensis 7-1v thử nghiệm cho quá trình phân hủy

rơm rạ Qua thử nghiệm cho thấy ở đống ủ có bổ sung 2 chủng vi khuẩn trên thời gian phân hủy rút ngắn từ 89 – 96 ngày xuống còn 51 – 58 ngày, đống ủ duy trì ở nhiệt độ cao (550C) trong 15 ngày liên tục, phân tích các chỉ tiêu của rơm rạ ủ bằng

2 chủng vi khuẩn trên cho thấy: hàm lượng cacbon tổng số giảm, hàm lượng Nitơ, photpho và kali cao hơn so với đống ủ không bổ sung 2 chủng vi khuẩn [58]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật trong xử lý rơm rạ tại Việt Nam

Phạm Văn Ty và cộng sự đã phân lập được hàng trăm chủng VSV có khả năng phân giải xenluloza, lignin, hemixenluloza Tác giả đã xây dựng được quy trình sản xuất chế phẩm phân giải các chất hữu cơ Kết quả thử nghiệm xử lý phế thải hữu cơ bằng chế phẩm VSV này đã rút ngắn thời gian ủ xuống còn 45 ÷ 60 ngày, so với phương pháp ủ tự nhiên phải ủ từ 6 ÷ 12 tháng [44]

Đề tài cấp nhà nước KHCN 02 - 06 A, giai đoạn 1998 đã nghiên cứu và áp dụng công nghệ sinh học trong sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh từ nguồn phế thải hữu cơ rắn Đề tài đã phân lập từ mẫu đất và mẫu rác ở một số tỉnh phía bắc, tuyển chọn được hai chủng xạ khuẩn X50 thuộc loài Streptomyces gougero và chủng xạ khuẩn Streptomyces macrosporrus X20; 2 chủng vi khuẩn là V40 thuộc loài

Cellulona sp và V31 thuộc loài Corynebacoerium sp.; 2 chủng nấm là N11 thuộc loài

A Japonicus và N3 thuộc loài A Unilateralis Các chủng giống này là các chủng

giống có khả năng phân hủy chuyển hóa các hợp chất hữu cơ khó phân giải như xenluloza, hemixenluloza cao Khi nghiên cứu tác động của VSV vào quá trình phân hủy rác, các tác giả nhận thấy khi chúng tác động đồng thời theo tỷ lệ phối trộn 1:1:1 giữa xạ khuẩn, vi khuẩn và nấm sợi sẽ cho hiệu quả cao hơn khi chúng có tác động riêng rẽ [44]

Đề tài cấp nhà nước KC 02 – 04 giai đoạn 1996 - 2000, Lê Văn Nhương và

cô ̣ng sự đã phân lập và tuyển chọn được hai chủng xạ khuẩn là S59 và S16 có hoạt tính phân giải tinh bột, xenluloza cao Khi thử nghiệm mức độ chuyển hóa xenluloza của các xạ khuẩn trên môi trường có bổ sung 5g rơm rạ hoặc vỏ lạc đã xử lý kiềm và nhận thấy chúng làm giảm cơ chất rơm 37,78 % so với đối chứng Khi nuôi trên môi trường rơm, vỏ lạc đã qua xử lý kiềm thì chủng S59 đã làm giảm hàm lượng xenluloza là 43,03 % (rơm) và 39,37 % (vỏ lạc); chủng S116 giảm 40,7 % (rơm) và giảm 37,34 % (vỏ lạc) so với đối chứng [25]

Tăng Thi ̣ Chính và cô ̣ng sự , đã nghiên cứu hiệu quả sử dụng chế phẩm Micromix 3 trong xử lý rác thải bằng phương pháp ủ hiều khí tại nhà máy chế biến phế thải Việt Trì, Phú Thọ Thí nghiệm được các tác giả bố trí như sau: Rác được cho vào các bể lên men có dung tích 150 m3, bể đối chứng và bể thí nghiệm được

bổ sung 8 kg đạm ure, 16 kg rỉ đường, riêng bể thí nghiệm có bố sung 30 kg chế phẩm micromix 3 đã thúc đẩy nhanh quá trình phân hủy triệt để hơn, thời gian ủ rút ngắn từ 50 ngày xuống còn 40 ngày, hàm lượng mùn thu được tăng hơn 22 %, đặc biệt hàm lượng mùn tinh tăng hơn 50% so với đối chứng [2]

Phan Bá Học đã kết luận: Cứ 1 tấn rơm rạ ủ thì cho ra 0,2 ÷ 0,25 tấn phân hữu cơ; 1 tấn thân là ngô sau khi ủ cho ra 0,3 ÷ 0,33 tấn phân hữu cơ; 1 tấn thân và lá khoai tây thu được 0,2 tấn phân ủ, 1 tấn các loại rau màu khác cho 1,15 ÷ 0,3 tấn phân ủ [13]

Lưu Hồng Mẫn và cs ở Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long đã khai thác

nấm Tricoderma, là nguồn vi sinh vật có khả năng phân hủy rơm rạ nhanh, hạn

chế được sự phát triển của nấm bệnh khô vằn lưu tồn trong rơm rạ, để điều chế thành công chế phấm sinh học phân hủy rơm ra, tạo nguồn phân hữu cơ cho đất Nếu sử dụng 10kg chế phẩm cho 1ha rơm rạ sau thu hoạch thì trong khoảng thời

gian 4 tuần sẽ tạo được khoảng 6 tấn phân hữu cơ tại chỗ Chế phẩm vi sinh vật phân hủy rơm được nghiên cứu và sản xuất thành 2 dạng: dạng xử lý trực tiếp vào rơm và dạng hòa tan trong nước tưới hoặc phun trực tiếp vào rơm Thời gian để chế phẩm sinh học phân hủy rơm rạ là 5 ÷ 6 tuần sau khi xử lý Rơm rạ xử lý ở các thời điểm khác nhau khi được bón trả lại cho vụ mùa không ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của cây lúa [21, 22, 31]

- Viện Thổ nhưỡng Nông hóa cũng đã nghiên cứu và chế tạo thành công chế phẩm Compost Maker Chế phẩm vi sinh vật Compost Maker được sử dụng để xử

lý nguyên liệu giàu hợp chất các bon: than bùn, phế thải sinh hoạt hữu cơ, phế phụ phẩm nông nghiệp (rơm, thân lá cây, lõi ngô, .), phế phụ phẩm công nghiệp chế biến (vỏ cà phê, vỏ quả, ), phế thải chăn nuôi, v.v thành nguyên liệu sản xuất các loại phân bón hữu cơ Chế phẩm chứa vi sinh vật phân giải xenluloza, phân giải protein và khử mùi Mật độ vi sinh vật hữu ích đạt 108 CFU/g Compost Maker

thích hợp nhất cho xử lý trong điều kiện không ngập nước Trichoderma sp thích

hợp với xử lý trong điều kiện ngập nước Chế phẩm đã được triển khai và thực hiện

ở 12 tỉnh Vĩnh Phúc, Hải Dương, Hưng Yên, Bắc Ninh, Thái Bình, Hà Nam, Nam Định, Kiên Giang, Cần Thơ với 18 mô hình, quy mô 360 ha Qua kết quả tổng kết đánh giá mô hình xử lý rơm rạ tại các điểm trình diễn ở các địa phương, các cán bộ khuyến nông và các hộ tham gia đều đánh giá mô hình có hiệu quả rất tốt Năng suất thu hoạch lúa ở vùng đồng bằng sông Hồng tăng trung bình 10,17% (trong đó năng suất lúa ở Hải Dương và Bắc Ninh tăng cao nhất đạt trên 25%); ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long tăng trung bình 12,64% Năng suất đậu tương đông tăng 15,1% (trong đó Hà Nội là cao nhất 23,2%) Năng suất mô hình lạc tăng 16,3%, năng suất khoai tây đông tăng 14,8% [42]

- Đại học Y Thái Bình cũng đã phát triển chế phẩm sinh học AT-YTB bao

gồm có các chủng vi sinh vật Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis,

Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus có mật độ 109 CFU/ml vi sinh vật, có khả

năng phân giải nhanh các nguồn nguyên liệu hữu cơ như rơm rạ, rác thải hữu cơ làm phân bón trong thời gian từ 45 – 60 ngày [42]

- Võ Văn Phước Quệ và Cao Ngọc Điệp (2011) Viện Nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ đã từ 96 dòng vi khuẩn phân lập từ đất trồng lúa trên môi trường CMC, có 59 dòng vi khuẩn có khả năng thủy phân CMC nhưng không có dòng vi khuẩn nào có khả năng phân giải giấy photocopy Bốn dòng vi khuẩn Q4, Q5, Q8 và Q9 được phân lập từ dịch dạ cỏ bò đều có khả năng sản sinh hiệu quả enzyme xenlulaza ngoại bào (endoglucanases, exoglucanases và β-glucosidases) ở điều kiện kỵ khí Khi được nuôi trong môi trường với nguồn carbon là giấy photocopy hoặc rơm rạ, cho thấy các dòng vi khuẩn này có khả năng phân giải giấy photocopy 53- 61% sau 7 ngày và phân giải rơm rạ 53-55% sau 10 ngày Phân tích di truyền phân tử dựa trên trình tự 16S rRNA cho thấy 3 dòng vi

khuẩn Q5, Q8 và Q9 đồng hình 99-100% tương ứng với các dòng Bacillus

megaterium M530013, TF10 và LAMA262; Dòng vi khuẩn Q4 đồng hình 99% với

dòng Cellulomonas flavigena [30]

- Trần Thị Lệ và cs (2012) Trường Đại học Nông Lâm Huế đã tuyển chọn được

chủng nấm PC6 có khả năng phân giải xenluloza từ 43 chủng nấm Trichoderma sp đã

được phân lập của Viện Tài nguyên môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế [19]

- Nguyễn Hoài Phương (2012) Học viện Nông nghiệp Việt Nam trong đề tài

Phát triển chế phẩm vi sinh vật xử lý rơm rạ làm phân bón hữu cơ cũng đã phân lập và

tuyển chọn được 4 chủng vi sinh vật: B circulans TD02; B subtilis TD04;

Streptomyces sp XK07 và Streptomyces sp XK26, từ đó tạo ra chế phẩm có khả

năng phân hủy rơm rạ trong thời gian 30 ngày [26]

- Công ty Cổ phần Bảo vệ thực vật Thái Bình sản xuất ra loại chế phẩm sinh

học Sumitri có chứa Trichoderma sp (T Hazianum T22, T viride, T

parceramosum…) 109CFU/g có khả năng phân hủy nhanh rơm rạ, vỏ cà phê ngay tại mặt ruộng…

- Lê Văn Tri và cộng sự (2012) đã tạo ra chế phẩm sinh học Fito-Biomix RR

có khả năng xử lý rơm rạ sau thu hoạch làm phân bón hữu cơ, chế phẩm này có

thành phần gồm 3 chủng vi sinh vật là: Bacillus polyfermenticus,

S.thermocoprophilus, Trichoderma virens có mật độ 108 CFU/g mỗi loại Chế phẩm

có khả năng phân hủy rơm rạ trong thời gian tương đối nhanh 25 – 30 ngày, ngoài

ra cũng thể hiện hiệu quả với một số nguồn tàn dư thực vật khác như: bèo tây, cỏ, thân cây ngô [42]

Các kết quả thu được đều cho thấy tác dụng của các chế phẩm vi sinh vật trong quá trình ủ xử lý chất thải hữu cơ nói chung và rơm rạ nói riêng, góp phần tăng cường khả năng phân huỷ, nâng cao chất lượng của phân bón thu được, bổ sung và tạo được nguồn phân bón an toàn chất lượng cao cho nông nghiệp

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Nguyên vật liệu

- Các chủng xạ trong tuyển tập bộ giống xạ khuẩn của Công ty cổ phần công nghệ sinh học Các chủng được sử dụng trong luận văn này được ký hiệu giữ nguyên theo mẫu ký hiệu của phòng thí nghiệm vi sinh – Công ty Cổ phần công nghệ sinh học như sau: XK1, XK5, XK12, XK14, XK17, XK18, XK25, XK27, XK29, XK34, XK37, XK46

- Mẫu rơm được thu gom tại Hà Nội

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm

- Nồi khử trùng (Trung Quốc)

- Lò vi sóng (Dimension4, Nhật Bản)

- Tủ ấm (Trung Quốc)

- Máy đo pH (Bồ Đào Nha)

- Cân phân tích (KD-TBED-1200, Trung Quốc)

- Tủ cấy vô trùng (Box Laminar, Việt Nam)

- Tủ sấy khô (Trung Quốc)

- Máy lắc (GFL 3017, Đức)

- Máy lắc ổn nhiệt (KS4000i control, Đức)

- Kính hiển vi (Olympus, Nhật)

- Máy li tâm (EBA20, Zentrifugen, Đức)

- Máy so màu (Jenway, Anh)

- Các dụng cụ thí nghiệm khác như: que cấy, ống nghiệm, hộp petri, ống facol, đèn cồn, cốc đong, túi nilong chứa mẫu rơm…

2.1.3 Hóa chất

Pepton, cao nấm men, agar, cám gạo, glucose, NaNO3, KH2PO4, (NH4)2SO4,

NH4Cl, NaCl, ure, MgSO4, giấy lọc, xylan… của Trung Quốc, Anh, Việt Nam

CMC (CarboxyMethyl Cellulose) của hãng Sigma (Mỹ)

Môi trường dinh dưỡng được sử dụng để nuôi cấy, tuyển chọn, thử hoạt tính…của các chủng xạ khuẩn trong luận văn: Gause 1, xenluloza, ISP1, ISP2, ISP3, ISP4, ISP5, ISP6, ISP 9, dung dịch Lugol, môi trường thử hoạt tính sinh tổng hợp enzyme

+ Môi trường Gause 1

+ Hệ thống môi trường ISP

- Môi trường ISP1

Cao nấm men Nước cất

3 1000ml

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu

Trong luận văn này, cần lấy mẫu chế phẩm vi sinh sau khi sản xuất để kiểm tra mật độ các chủng vi sinh vật có trong sản phẩm Lấy mẫu chế phẩm vi sinh theo phương pháp đường chéo ở các vị trí, độ sâu khác nhau, sau đó trộn đều và đem đi phân tích các chỉ tiêu mong muốn Mẫu được bảo quản ở 0 – 40C và thực hiện phân tích trong 24h sau nhận mẫu [10, 34]

2.2.2 Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật

Trong luận văn này, chúng tôi sử dụng phương pháp cấy truyền vi sinh vật vào các ống thạch nghiêng chứa môi trường Gause1 để giữ giống và tiếp tục nghiên cứu

Cách tiến hành: Đổ môi trường giữ giống vào ống nghiệm, đem khử trùng ướt

ở chế độ 1 atm/30 phút, sau đó để nghiêng ống nghiệm chờ thạch đông Tiếp theo, dùng que cấy vô trùng lấy sinh khối xạ khuẩn cấy zích zắc trên bề mặt thạch nghiêng Đem nuôi trong tủ ấm 400C sau 5-7 ngày các chủng xạ khuẩn phát triển mạnh thì đem bảo quản ống giống trong tủ lạnh 40C để giữ giống Giống được cấy chuyển hàng tháng và được hoạt hóa trước khi nhân giống [6, 10]

2.2.3 Phương pháp phân loại xạ khuẩn

a Quan sát đặc điểm hình thái

Để quan sát đặc điểm hình thái của xạ khuẩn, chúng tôi tiến hành nuôi cấy các chủng xạ khuẩn trên môi trường ISP2 có gắn lam kính nghiêng trên mặt môi trường trong thời gian 7-14 ngày/400C Sau khi xạ khuẩn phát triển tốt lam kính được lấy ra quan sát dưới kính hiển vi điện tử: RF: thẳng hay hơi lượn sóng; RA: hình móc câu hay xoăn không hoàn toàn; S: dạng xoăn lò xo hay xoăn hoàn toàn; SRF: dạng xoắn lượn sóng; SRA: dạng xoắn có móc câu

Bề mặt bào tử: Bề mặt của khuẩn ti khí sinh có bào tử được phủ platin trong

30 giây sau đó quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi (Phòng Kính hiển vi điện tử – Viện vệ sinh dịch tễ Trung Ương) để xác định đặc điểm bề mặt bào tử:

+ Bào tử hình tròn, ovan, hình que

+ Bề mặt bào tử được ký hiệu: sm (trơn nhẵn), sp (gai), wa (xù xì), ha (tóc)

b Đặc điểm nuôi cấy

Màu sắc khuẩn lạc (khuẩn ti khí sinh): Màu sắc của khuẩn ti khí sinh được

so với 7 nhóm màu của Tresner và Backus (1963): xanh da trời, sẫm, xám, xanh lá,

đỏ, tím, trắng, vàng

Màu sắc của khuẩn ti cơ chất: chia vào 5 nhóm vàng- nâu (gồm cả các loại

không tiết sắc tố); xanh da trời, xanh lá, đỏ-da cam, tím

Khả năng hình thành melanin: xạ khuẩn được nuôi trên môi trường ISP6 ở

nhiệt độ thích hợp Quan sát sự thay đổi màu của môi trường từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 14 Nếu sinh melanin thì màu của môi trường sẽ chuyển từ màu vàng sang màu nâu đậm và màu đen

Khả năng sinh sắc tố tan: khả năng sinh sắc tố tan được xác định trên môi

trường ISP2-6 Sắc tố tan được xếp vào 5 nhóm giống màu của khuẩn ti khí sinh và khuẩn ti cơ chất: vàng nâu, xanh da trời, xanh lá, đỏ-da cam, tím

c Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

+ Khả năng sử dụng nguồn đường: Quan sát sự sinh trưởng của xạ khuẩn trên môi trường ISP9 có bổ sung 1% các nguồn đường khác nhau (Glucoza, Arabinoza, fructoza, xyloza, mannitol, mannoza, raffinoza)

Cách làm: Cân 1g đường, thanh trùng bằng đèn UV rồi bổ sung vào 100ml môi trường ISP9 còn nóng Lắc cho tan đường rồi đổ vào đĩa petri và nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp, sau 3-5 ngày quan sát sự sinh trưởng của các chủng và so sánh với đối chứng Trong đó môi trường có Glucoza là đối chứng dương (+) và môi trường không có đường được coi là đối chứng âm (-)

- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng bằng hoặc kém hơn đối chứng dương một ít: có khả năng sử dụng loại đường đó, ký hiệu (+)

- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh hơn đối chứng dương, ký hiệu là (++)

- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng bằng đối chứng âm hoặc không mọc: không có khả năng sử dụng loại đường đó, ký hiệu (-)

- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng tốt hơn đối chứng âm 1 ít nhưng kém hơn đối chứng dương nhiều, ký hiệu là (±)

+ Khả năng chịu nhiệt: Cấy xạ khuẩn trên môi trường ISP2 rồi nuôi ở các thang nhiệt độ khác nhau (300

C, 350C, 400C, 450C, 500C, 550C) Sau 5-7 ngày quan sát [63, 65, 68]

d Phương pháp sinh học phân tử phân loại xạ khuẩn [64]

 Phương pháp tách DNA tổng số từ xạ khuẩn bằng đệm CTAB

Nguyên tắc:

Phá vỡ thành tế bào của xạ khuẩn bằng lysozym sau đó loại bỏ protein khỏi DNA nhờ protease K Phân tách các thành phần của tế bào sau khi phá vỡ bằng phức hợp phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25 : 24 : 1) Sau đó dịch có chứa DNA được tủa bằng Isopropanol và rửa bằng etanol Cặn DNA được hòa tan trong đệm TE Bảo quản ở -20o

C Quy trình:

Lấy 2 ml dịch nuôi cấy đem li tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút trong 10 phút để thu cặn tế bào Hòa tan cặn trong 510 µl TE, pH = 8 Đảo đều bằng voltex Bổ

sung thêm 60 µl EDTA (nồng độ cuối 45mM) Sau đó thêm 60 µl lysozym (50 mg/ml), ủ trong 2 giờ ở 65OC Bổ sung thêm 5 µl protease K, 30 µl SDS 10% Đảo nhẹ, ủ 1 giờ ở 37OC Thêm 110 µl NaCl 5M, 90 µl CTAB, đảo nhẹ Bổ sung thêm

700 µl Chloroform : Isoamin alcohol (24:1), đảo đều sau đó li tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút

Chuyển dịch pha trên sang ống eppendorf mới Bổ sung thêm 700 µl hỗn hợp phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1), đảo nhẹ sau đó li tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi chuyển sang ống eppendorf mới (lặp lại 3 lần)

Kết tủa DNA với propanol, để qua đêm ở -20oC

Li tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút, loại dịch

Rửa tủa 2 lần với 500 µl cồn tuyệt đối

Làm khô ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

Thêm 1 µl TE/RNase, sau đó ủ ở 37o

C trong 2 giờ Hòa tan lại tủa với 40 µl TE, pH 8

Điện di kiểm tra trên gel agarose 1% Bảo quản ở 4oC

* Tinh sạch DNA bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 260 và 280 nm

Tính hệ số A = 260/280 Nếu hệ số chỉ từ 1,8 – 2,0 là đạt yêu cầu

 Phản ứng PCR và giải trình tự gene

DNA tổng số sau khi được tinh sạch sẽ được chạy PCR để tách đoạn gene 16S-rRNA với thành phần phản ứng như sau: