TỔNG QUAN
Terazosin
1.1.1 Một số thông tin chung về terazosin
- Công thức cấu tạo: hình 1.1
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của terazosin
- Công thức phân tử: C19H25N5O4.HCl
- Tên khoa học: 1-(4-amino-6,7-dimethoxy-2-quinazolinyl)-4-(tetrahydro-2- furoyl)piperazin monohydroclorid
- Ngoài dạng khan, terazosin hydroclorid còn có dạng ngậm hai phân tử nước với công thức phân tử: C19H25N5O4.HCl.2H2O, phân tử lƣợng: 459,92 [42]
Chất này có hình dạng tinh thể màu trắng hoặc hơi vàng, với tính tan hạn chế trong nước và rất khó tan trong methanol cũng như ethanol 96% Nó gần như không tan trong aceton và n-hexan, đồng thời có khả năng hấp thụ tia hồng ngoại (IR) và tia cực tím (UV).
1.1.2 Tác dụng và chỉ định của terazosin
Terazosin là một thuốc ức chế chọn lọc thụ thể α1-adrenergic, giúp giãn mạch và giảm sức cản ngoại biên, từ đó hạ huyết áp Thuốc được chỉ định đường uống để điều trị tăng huyết áp vừa và nhẹ ở người lớn, và có thể được phối hợp với các thuốc hạ huyết áp khác trong trường hợp tăng huyết áp kháng trị.
Terazosin là một loại thuốc có tác dụng giãn cơ trơn, giúp tăng cường lưu lượng nước tiểu và cải thiện triệu chứng tắc nghẽn Thuốc được chỉ định sử dụng đường uống để giảm triệu chứng trong trường hợp phì đại lành tính tiền liệt tuyến Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng hiệu quả lâm sàng của terazosin không khác biệt so với các phương pháp điều trị khác.
3 các thuốc cùng nhóm nhƣ alfuzosin, doxazosin, tamsulosin Đây là một trong các lựa chọn đầu tay khi các triệu chứng tắc nghẽn chiếm ƣu thế [36], [39]
Terazosin ức chế sự phát triển của tế bào ung thư tuyến tiền liệt bằng cách tăng cường quá trình chết theo chu trình của các tế bào này mà không ảnh hưởng đến chu trình tế bào bình thường Ngoài ra, thuốc còn có tác dụng tích cực đối với lượng cholesterol trong máu của người bệnh.
1.1.3 Một số chế phẩm chứa terazosin trên thị trường Ở các nước ASEAN và trên thế giới, terazosin được biết đến với nhiều biệt dƣợc khác nhau, phổ biến là viên nén với hàm lƣợng 1, 2, 5 và 10 mg (bảng 3.1 và hình 1.2) [46]
Bảng 1.1 Một số chế phẩm chứa terazosin trên thị trường
STT Tên biệt dược Hàm lượng
(mg) Hãng sản xuất Nước lưu hành
1 Apo-terazosin 2, 5 Apotex Canada, New Zealand,
Mỹ, Australia, Trung Quốc, Philipin, Indonesia, Nam Phi…
6 Terazosin HCl dihydrate 2 Sandoz Mỹ
Tạp chất A của terazosin
1.2.1 Một số thông tin chung về tạp A của terazosin
- Công thức cấu tạo: hình 1.3
- Công thức phân tử: C14H19N5O2.2HCl
Hình 1.3 Công thức cấu tạo tạp chất A của terazosin theo USP 38
1-(4-amino-6,7-dimethoxy-2-quinazolinyl)piperazin, dihydroclorid
- Tính chất: màu trắng hoặc trắng ngà, nhiệt độ nóng chảy > 208 o C, khó tan trong methanol, dimethyl sulfoxid [44]
- Độc tính: kích thích da, mắt và hệ hô hấp mức độ trung bình, có hại nếu nuốt phải, hít phải hoặc hấp thu qua da [44]
- Tạp chất A của terazosin theo USP tương ứng với tạp chất I của terazosin theo
KP X, tạp chất C của terazosin theo BP 2016 và EP 8.0 Tạp chất A của
5 terazosin cũng đồng thời là tạp chất F của doxazosin theo BP 2016 và EP 8.0
1.2.2 Nguyên nhân gây ra tạp chất A
Khi terazosin ở dạng base hoặc muối hydroclorid tiếp xúc với nước có tính acid ở nhiệt độ phòng trong thời gian dài, liên kết amid sẽ bị phân cắt, dẫn đến sự hình thành tạp chất A.
Hình 1.4 Sơ đồ phát sinh tạp chất A của terazosin
Khi muối hydrochlorid được tạo ra từ phản ứng giữa terazosin base và acid hydrochloric, sản phẩm cuối có thể chứa một lượng nhỏ acid, dẫn đến hiện tượng thủy phân theo thời gian.
1.2.3 Phương pháp xác định IAT bằng TLC
Tạp chất A của terazosin có thể được xác định bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng với các điều kiện ở bảng 1.2
Bảng 1.2 Phương pháp TLC xác định tạp chất A của terazosin Đối tượng mẫu Pha động Pha tĩnh
Soi đèn UV bước sóng ngắn
Nguyên liệu IAT n-butanol - acid acetic băng - nước
Methanol - ethyl acetat - dung dịch amoniac 25%
Methanol - aceton : dung dịch amoniac 25% (7 : 2 : 0,5)
Nguyên liệu IAT n-propanol - n-hexan
1.2.4 Phương pháp xác định IAT bằng HPLC
Tạp chất A của terazosin có thể được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với các điều kiện nhƣ sau:
1.2.4.1 Đối tượng mẫu là nguyên liệu TEZ
+ Pha tĩnh: Cột C8 (250 x 4,6 mm; 5 àm)
+ Pha động: Đệm citrat pH 3,2 - acetonitril (1685 : 315)
+ Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
+ Thể tớch tiờm mẫu: 20 àl
- Dung dịch tiêm sắc ký:
Dung dịch thử là dung dịch TEZ với nồng độ 0,5 mg/ml trong pha động
Dung dịch chuẩn được tạo thành từ hỗn hợp chất chuẩn TEZ và các tạp chuẩn A, B, C của terazosin, trong đó nồng độ IAT chuẩn là 2 àg/ml Để pha chế IAT, cần sử dụng dung môi phù hợp.
Bước 2: hỗn hợp nước, acetonitril và methanol (60 : 30 : 10)
Lượng IAT trong nguyên liệu terazosin được xác định thông qua nồng độ của IAT chuẩn và diện tích pic của IAT trong sắc ký đồ của cả dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
- Giới hạn: Tạp chất A không quá 0,3% [41], [42]
+ Pha tĩnh: Cột C8 (250 x 4,6 mm; 5 àm)
+ Pha động: Đệm citrat pH 3,2 - acetonitril - triethylamin (1650 : 350 : 2) + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
+ Thể tớch tiờm mẫu: 20 àl
- Dung dịch tiêm sắc ký:
Dung dịch thử là dung dịch TEZ với nồng độ 0,5 mg/ml trong pha động
Dung dịch chuẩn (a) đƣợc chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch thử 1000 lần với pha động
Dung dịch chuẩn (b) là dung dịch chứa TEZ, được sử dụng để kiểm tra tính thích hợp của hệ thống, bao gồm IAT và một số tạp chất khác của terazosin Dung môi để pha dung dịch chuẩn (b) là pha động.
Sử dụng sắc ký đồ kết hợp với "TEZ dùng cho phép thử tính thích hợp hệ thống" và sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (b) để phát hiện pic tương ứng với IAT Tiếp theo, xác định giới hạn IAT bằng cách so sánh diện tích pic IAT trong sắc ký đồ của dung dịch thử với pic chính trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (a).
- Giới hạn: Diện tích pic IAT trong sắc ký đồ của dung dịch thử không gấp quá
5 lần diện tích pic chính trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (a) (0,5%) [30],
+ Pha tĩnh: Cột C18 (50 x 2,1 mm, 1,7 àm)
+ Pha động: Chương trình gradient nồng độ gồm các thành phần nước, acetonitril, methanol và dung dịch amoniac 0,1% tt/tt
+ Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút
+ Detector: PDA 220 nm và QDa mass
+ Thể tớch tiờm mẫu: 0,2 àl
- Dung dịch tiêm sắc ký: là hỗn hợp gồm TEZ và các tạp chất từ A đến O theo
EP Trong đú nồng độ IAT là 7,5 àg/ml Dung mụi pha mẫu là methanol [37]
1.2.4.2 Đối tượng mẫu là nguyên liệu DOX
+ Pha động: Chương trình gradient nồng độ gồm dung dịch acid phosphoric (5g/100ml), acetonitril và nước
+ Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút
+ Thể tớch tiờm mẫu: 10 àl
- Dung dịch tiêm sắc ký:
Dung dịch thử là dung dịch DOX với nồng độ 0,5 mg/ml trong pha động
Dung dịch chuẩn được tạo thành từ hỗn hợp chất chuẩn DOX cùng với các tạp chuẩn A, B, C, D, E, F của doxazosin và tạp chuẩn A, C của terazosin, với nồng độ IAT chuẩn là 1,5 µg/ml Để pha chế dung dịch chuẩn, cần sử dụng dung mũi gồm hỗn hợp dung mũi C và D theo tỷ lệ 9:1, trong đó C là nước và D là hỗn hợp 100 ml acetonitril với 2 g acid phosphoric (84 - 86%).
Hàm lượng (%) IAT trong nguyên liệu DOX được xác định thông qua nồng độ IAT trong dung dịch chuẩn, nồng độ DOX trong dung dịch thử, và diện tích pic của IAT trong sắc ký đồ của cả hai dung dịch.
- Giới hạn: Tạp chất A của terazosin không quá 0,3%.
Tổng quan về các phương pháp hóa lý sử dụng trong nghiên cứu đề tài
Sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất bằng cách cho pha động di chuyển qua pha tĩnh, nơi đã chấm hỗn hợp cần tách Trong quá trình này, các cấu tử trong mẫu thử di chuyển trên lớp hấp phụ với tốc độ khác nhau, dẫn đến việc tạo ra sắc ký đồ trên lớp mỏng.
1.3.1.2 Đại lượng đặc trưng Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf, đƣợc tính theo công thức sau:
R f a b được xác định bằng cách đo khoảng cách từ điểm chấm mẫu đến tâm của vết sắc ký (a) và khoảng cách từ điểm chấm mẫu đến tuyến dung môi (b), cả hai đều được tính bằng centimet (cm) trên cùng một đường đi của vết.
Rf chỉ có giá trị từ 0 đến 1 [2], [4], [23]
1.4.1.3 Ứng dụng trong kiểm nghiệm
Trong kiểm nghiệm, sắc ký lớp mỏng (TLC) chủ yếu được sử dụng để định tính thông qua việc so sánh giá trị Rf và màu sắc của vết chất thử với vết chất chuẩn trên cùng một bản mỏng và trong cùng điều kiện Bên cạnh đó, TLC còn được áp dụng để kiểm tra độ tinh khiết, cũng như thực hiện các phép thử bán định lượng và định lượng.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật phân tách các hợp chất thông qua một pha tĩnh trong cột, sử dụng dòng pha động lỏng được bơm dưới áp suất cao.
Sự chia tách chủ yếu dựa vào cơ chế phân bố, sử dụng silica biến đổi hóa học làm pha tĩnh và các dung môi phân cực làm pha động.
1.3.2.2 Các đại lượng đặc trưng
Thời gian lưu tR là khoảng cách từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic của chất Đây là một đại lượng quan trọng được sử dụng để định tính các chất trong phân tích.
- Diện tích pic S: là đại lƣợng dùng để định lƣợng các chất, có độ chính xác cao hơn so với chiều cao pic [31]
- Số đĩa lý thuyết N: là đại lƣợng dùng để biểu thị khả năng tách của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định
1/2) 2 hoặc N = 16 ( t W R ) 2 Trong đó: W: Chiều rộng đo ở đáy pic
W 1/2 : Chiều rộng đo ở nửa chiều cao pic [2], [5], [23]
- Độ phân giải R s : là đại lƣợng đặc trƣng cho sự tách nhau của 2 pic liền kề
W 1/2A W 1/2B Trong đó: tRA, tRB: Thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (A và B)
W A , W B : Độ rộng đo ở đáy các pic
Độ rộng đo ở nửa chiều cao pic W1/2A và W1/2B là yếu tố quan trọng trong phân tích HPLC Khi độ phân giải lớn hơn 1,5, hai pic sẽ tách biệt rõ ràng Đối với các phép phân tích HPLC, giá trị Rs mong muốn thường đạt trên 2,0 để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả.
- Hệ số đối xứng A s (hay hệ số kéo đuôi T): là thông số thể hiện sự đối xứng của pic As = W 0,05
Trong đó: W 0,05 : Chiều rộng pic ở 1/20 chiều cao pic d: Khoảng cách từ đường thẳng đứng đi qua đỉnh pic đến cạnh phía trước của pic ở 1/20 chiều cao pic
Khi As = 1 thì pic hoàn toàn đối xứng (lý tưởng) Giá trị As càng tăng thì sự kéo đuôi của pic càng rõ [2], [23]
1.3.2.3 Ứng dụng trong kiểm nghiệm
- Định tính: Dựa trên sự giống nhau về thời gian lưu trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử
Định lượng trong HPLC dựa vào nguyên tắc rằng nồng độ của chất phân tích tỷ lệ thuận với chiều cao hoặc diện tích pic Một số phương pháp định lượng phổ biến bao gồm phương pháp chuẩn nội, phương pháp chuẩn ngoại, phương pháp thêm chuẩn và phương pháp chuẩn hóa diện tích.
Thẩm định phương pháp phân tích nguyên liệu hóa dược
Thẩm định phương pháp phân tích là quá trình quan trọng nhằm đảm bảo rằng phương pháp đạt yêu cầu đề ra Đối với phương pháp định tính, cần thẩm định tiêu chí độ đặc hiệu Trong khi đó, với phương pháp định lượng, các tiêu chí cần được thẩm định bao gồm tính thích hợp của hệ thống sắc ký, độ đặc hiệu, độ tuyến tính và khoảng xác định, độ lặp lại, độ chính xác trung gian, độ đúng và độ ổn định.
1.4.1 Tính thích hợp của hệ thống sắc ký Đánh giá tính thích hợp hệ thống sắc ký nhằm để đảm bảo hệ thống sắc ký có hiệu năng phù hợp [2]
Để xác định chính xác, cần thực hiện tiêm lặp lại nhiều lần một dung dịch chuẩn sử dụng trong định lượng hoặc dung dịch chuẩn khác Sau đó, tiến hành đánh giá dựa trên các đại lượng đặc trưng.
12 trưng như: thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết, hệ số đối xứng của pic, độ phân giải
1.4.2 Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu là khả năng xác định đƣợc chất phân tích khi có mặt các thành phần khác trong mẫu [25], [33]
Phép thử định tính yêu cầu chứng minh tính dương tính khi chất phân tích hiện diện và tính âm tính khi chất này vắng mặt Ngoài ra, kết quả cũng phải âm tính khi có mặt các chất liên quan có cấu trúc tương tự với chất phân tích.
- Với phép định lượng: Cần chứng minh kết quả không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố trong quá trình phân tích
1.4.3 Độ tuyến tính và khoảng xác định Độ tuyến tính là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đo đƣợc (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định, biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số tương quan tuyến tính R
Khoảng xác định là khoảng nồng độ đã được khảo sát, đảm bảo tính tuyến tính, độ chính xác và độ đúng của phương pháp phân tích Đối với các phép định lượng, khoảng xác định tối thiểu cần đạt từ 80% đến 120% nồng độ thử nghiệm.
Cách xác định: Chuẩn bị một dãy các mẫu có nồng độ tăng dần từ X1 đến
Tiến hành phân tích các mẫu X bằng phương pháp cần thẩm định để thu được các đáp ứng từ Y1 đến Yn Xác định phương trình hồi quy và hệ số tương quan tuyến tính, với yêu cầu thực hiện tối thiểu ở 5 mức nồng độ khác nhau.
1.4.4 Độ chính xác Độ chính xác là mức độ thống nhất của các kết quả thử lặp lại trên cùng một mẫu theo quy trình phân tích, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) Độ chính xác đƣợc thẩm định dựa trên hai tiêu chí: độ lặp lại và độ chính xác trung gian Độ lặp lại biểu thị độ chính xác của các kết quả phân tích trong cùng một điều kiện, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn Độ chính xác trung gian biểu thị độ chính xác của các kết quả phân tích đƣợc thực hiện tại cùng một
13 phòng thí nghiệm nhưng trong các ngày khác nhau, những người phân tích, dụng cụ phân tích khác nhau
Để xác định độ chính xác, cần lặp lại toàn bộ quy trình phân tích trên cùng một mẫu thử đồng nhất từ đầu đến cuối Tối thiểu, quá trình này phải được thực hiện 9 lần ở 3 nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ thực hiện 3 lần, hoặc ít nhất 6 lần ở nồng độ 100% của mẫu thử.
1.4.5 Độ đúng Độ đúng là mức độ gần sát của các giá trị đo đƣợc so với giá trị đƣợc chấp nhận Đối với mẫu là nguyên liệu, có thể xác định độ đúng bằng một trong ba phương pháp sau:
Cách 1: Sử dụng phương pháp thêm chuẩn, tính % tìm lại của chuẩn
Để xác định lại hàm lượng của một chất chuẩn, phương pháp phân tích cần được áp dụng với ít nhất ba nồng độ khác nhau trong phạm vi định lượng Mỗi nồng độ phải được lặp lại ít nhất ba lần để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả.
So sánh kết quả của phương pháp phân tích được đề xuất với các kết quả từ Dược điển hoặc phương pháp đã được thẩm định là một bước quan trọng để đánh giá tính chính xác và độ tin cậy của phương pháp mới Việc này không chỉ giúp xác định sự phù hợp của phương pháp mà còn đảm bảo rằng nó đáp ứng được các tiêu chuẩn chất lượng cần thiết trong ngành dược.
1.4.6 Độ ổn định của dung dịch phân tích Độ ổn định của dung dịch phân tích là một yếu tố quan trọng để xem xét trong quá trình thẩm định phương pháp phân tích Bất cứ dung dịch nào sử dụng để định lƣợng nên nên đƣợc đánh giá độ ổn định [31].
Tình hình thiết lập tạp chuẩn A trong nước và trên thế giới
1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Tạp chuẩn A của terazosin đã được thiết lập bởi USP và một số công ty như Shanghai Kewel Chemical (Trung Quốc), Sincopharmachem (Mỹ), Toronto Research Chemicals (Canada) và Whyte Chemicals (Anh) Tuy nhiên, chỉ có Shanghai Kewel Chemical công bố hàm lượng tạp chuẩn là 95 - 98%, trong khi các công ty khác không cung cấp thông tin về hàm lượng cũng như quy trình tổng hợp, tinh chế và thiết lập chuẩn Việc đặt mua tạp chuẩn này gặp nhiều khó khăn.
14 khăn, do thời gian đặt hàng lâu với giá rất cao (Khoảng hơn 20 triệu cho lọ 50 mg tạp chuẩn do USP thiết lập)
1.5.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Tại Việt Nam, việc kiểm tra chất lượng thuốc hiện đang tập trung vào chất chuẩn và tạp chuẩn Mặc dù đã có hàng trăm chất chuẩn được thiết lập, chủ yếu là chuẩn hoạt chất, nhưng số lượng tạp chuẩn vẫn còn rất hạn chế.
Một số đề tài đã nghiên cứu tổng hợp ra nguyên liệu để tiến tới thiết lập tạp chuẩn nhƣ:
- Tổng hợp tạp chuẩn A của terazosin [14], [20]
- Tổng hợp tạp chuẩn B của terazosin [17]
- Bước đầu tổng hợp tạp chuẩn C của terazosin [11]
- Tổng hợp tạp chuẩn A của clopidogrel [6], [21]
- Tổng hợp tạp chuẩn 4-aminophenol của paracetamol [10]
Bên cạnh đó, đã có một số đề tài nghiên cứu thiết lập tạp chuẩn đƣợc thực hiện Các tạp chuẩn đã đƣợc thiết lập nhƣ sau:
- Tạp (2-clorophenyl)diphenylmethanol của clotrimazol [9]
- Tạp captopril disulfit của captopril [18]
- Tạp 2-amino-1-(4-nitrophenyl)propan-1,3-diol của chloramphenicol [19]
Tuy nhiên, chƣa có nghiên cứu nào công bố quy trình thiết lập tạp chuẩn
A của terazosin, cũng như các phương pháp được sử dụng để định tính, định lƣợng nguyên liệu IAT trong quá trình thiết lập tạp chuẩn
NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị
- Tạp chuẩn A của Hội đồng Dƣợc điển Mỹ (USPRS): lô F0C245, hàm lƣợng 90,0% (hình 2.1)
- Chất chuẩn terazosin của Hội đồng Dƣợc điển Mỹ (USPRS): lô G0F290, hàm lƣợng 91,9% (hình 2.2)
Hình 2.1 Tạp chuẩn A của terazosin của Hội đồng Dƣợc điển Mỹ
Hình 2.2 Chất chuẩn terazosin của
Hội đồng Dƣợc điển Mỹ
- 2-cloro-6,7-dimethoxyquinazolin-4-amino (ACDQ) PA: Sigma Aldrich, lô STBC3541V, hàm lƣợng 99,7%
- Nguyên liệu tạp chất A của terazosin (IAT) đƣợc tổng hợp tại phòng thí nghiệm bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội
- Các hóa chất, dung môi tinh khiết phân tích và loại dùng cho HPLC của hãng Sigma Aldrich, Merck (Đức)
+ Ethyl acetat PA + Methanol PA & HPLC + Natri citrat PA
- Bản mỏng silica gel 60 F254 Merck (Đức)
- Cân phân tích METTLER TOLEDO XPE26 có độ chính xác 0,001 mg (Thụy Sĩ) (hình 2.3)
- Cột sắc ký Supelco C8 (250 x 4,6 mm, 5 àm)
- Đèn soi tử ngoại UV-VIS Vilber Lourmart (Pháp)
- Máy đo pH Metrohm 780 (Thụy Sĩ)
- Máy lắc siêu âm ELMASONIC S180 H (Đức)
- Máy quang phổ UV-VIS Hitachi U-3900H (Nhật)
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao SHIMADZU SPD-M20A được trang bị phần mềm Lab-solution, bơm gradient LC-20AD 4 kênh dung môi, hệ thống đuổi khí DGU-2A5, lò cột CTO-10AS VP, detector DAD SPD-M20A và bộ phận tiêm mẫu tự động SIL-20ACHT, mang lại hiệu suất phân tích cao và chính xác cho các ứng dụng nghiên cứu và kiểm tra chất lượng.
- Bình triển khai sắc ký lớp mỏng và các dụng cụ thủy tinh cần thiết
Hình 2.3 Cân phân tích METTLER TOLEDO XPE26 d = 0,001 mg
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Xây dựng phương pháp định tính IAT bằng TLC
- Khảo sát điều kiện sắc ký
- Thẩm định phương pháp về độ đặc hiệu
2.2.2 Xây dựng phương pháp định tính, định lượng IAT bằng HPLC
- Khảo sát điều kiện sắc ký
2.2.3 Ứng dụng hai phương pháp đã xây dựng để định tính, định lượng nguyên liệu IAT
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp TLC sử dụng pha tĩnh là bản mỏng silicagel 60 F254
Merck đã phát hiện vết bằng cách sử dụng đèn UV 254 nm Sau khi tham khảo nhiều tài liệu, chúng tôi đã chọn một số hệ pha động để tiến hành khảo sát.
Bảng 2.1 Các hệ dung môi khảo sát phương pháp định tính IAT bằng TLC
STT Thành phần Tỷ lệ TLTK
2 n-butanol - acid acetic băng - nước 6 : 3 : 5 [14]
3 Methanol - ethyl acetat - dung dịch amoniac 25% 8 : 2 : 0,5 [14]
4 Methanol - aceton - dung dịch amoniac 25% 7 : 2 : 0,5 [14]
5 n-propanol - n-hexan - dung dịch amoniac 25% 24 : 8 : 1 [14]
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được thực hiện với cột C8 kích thước 250 x 4,6 mm và kích thước hạt 5 µm Pha động sử dụng hỗn hợp đệm citrat pH 3,2 và acetonitril theo tỷ lệ 84:16, với tốc độ dòng 1,0 ml/phút Nhiệt độ cột được duy trì ở 30 độ C và thể tích tiêm mẫu là 20 µl.
2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích
2.3.3.1 Thẩm định phương pháp TLC
Tiến hành sắc ký với mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu, mẫu phân giải
2.3.3.2 Thẩm định phương pháp HPLC
Tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Tiêm lặp lại nhiều lần một dung dịch chuẩn dùng trong định lƣợng sau đó đánh giá các thông số tR, S, N, As, Rs Độ đặc hiệu
Chuẩn bị các loại mẫu như mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu phân giải Ghi lại sắc ký đồ cho từng thành phần riêng biệt, xác định thời gian lưu và độ tinh khiết của đỉnh pic Phân tích phổ UV của pic trong sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn, đồng thời xác định độ phân giải giữa hai thành phần gần nhau nhất Đánh giá độ tuyến tính và khoảng xác định.
Tiến hành phân tích với một dãy dung dịch chuẩn bao gồm 5 dung dịch có nồng độ từ 50% đến 150% so với nồng độ định lượng Mục tiêu là xác định phương trình hồi quy dạng y = ax + b và tính toán hệ số tương quan tuyến tính R để đánh giá độ chính xác của kết quả.
Tiến hành sắc ký phân tích với 6 dung dịch thử nồng độ 100% để đánh giá độ lặp lại Sau đó, thay đổi tay kiểm nghiệm viên và hệ thống HPLC, thực hiện tương tự với 6 dung dịch thử khác Kết quả từ 12 mẫu thử được sử dụng để đánh giá độ chính xác trung gian của phương pháp.
Tiến hành sắc ký đối với chất chuẩn sau đó tính % tìm lại Thực hiện ở mức 3 nồng độ 80%, 100% và 120% , mỗi nồng độ lặp lại 3 lần
% tìm lại = m C tìm lại m C lý thuyết x 100 Độ ổn định của dung dịch phân tích
Tiêm lặp lại dung dịch chuẩn và dung dịch thử sau những khoảng thời gian nhất định
2.3.4 Một số phương pháp thống kê sử dụng trong nghiên cứu đề tài
Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm ký hiệu là x̅, đƣợc tính bằng công thức: x̅= 1 n∑x i n i=1
Trong đó: n: số lần thí nghiệm xi: giá trị tính đƣợc của lần thử nghiệm thứ i
2.3.3.2 Độ lệch chuẩn và độ lệch chuẩn tương đối Độ lệch chuẩn ký hiệu là S, đƣợc tính bằng công thức:
S = √∑ n i=1 (x i x̅) 2 n 1 Độ lệch chuẩn tương đối ký hiệu là RSD và được tính theo công thức:
2.3.3.2 Sai số chuẩn và khoảng tin cậy
Sai số chuẩn ký hiệu là S x và đƣợc tính theo công thức:
Khoảng tin cậy đƣợc xác định bằng công thức: x̅ X = x̅ t α S x
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Thực nghiệm và kết quả
3.1.1 Xây dựng phương pháp định tính IAT bằng TLC
3.1.1.1 Khảo sát hệ pha động
Sử dụng bản mỏng silicagel 60 F254, chấm đồng lượng 10 µl lên bản mỏng với các dung dịch IAT (1 mg/ml trong methanol), TEZ (0,5 mg/ml trong methanol) và ACDQ (0,5 mg/ml trong methanol) Tiến hành chạy sắc ký theo các hệ pha động đã nêu trong phần “2.3.1 Phương pháp TLC” Phát hiện vết bằng cách soi đèn.
UV ở bước sóng 254 nm, lựa chọn hệ cho các vết sắc ký lên khỏi đường nền, tách khỏi nhau hoàn toàn và cho vết sắc ký gọn, đẹp
Kết quả khảo sát hệ pha động thể hiện trong hình 3.1 và bảng 3.1
3.1a) SKĐ hệ 1 3.1b) SKĐ hệ 2 3.1c) SKĐ hệ 3 3.1d) SKĐ hệ 4 3.1e) SKĐ hệ 5
3.1f) SKĐ hệ 6 3.1g) SKĐ hệ 7 3.1h) SKĐ hệ 8 3.1i) SKĐ hệ 9
Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát pha động của phương pháp TLC
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát hệ pha động của phương pháp TLC
STT Thành phần Tỷ lệ Kết quả
Vết ACDQ và TEZ có giá trị
2 n-butanol - acid acetic băng - nước
Ba vết IAT, ACDQ, TEZ tách khỏi nhau hoàn toàn
3 Methanol - ethyl acetat - dung dịch amoniac 25%
Ba vết IAT, ACDQ, TEZ tách khỏi nhau hoàn toàn
4 Methanol - aceton - dung dịch amoniac 25%
Ba vết IAT, ACDQ, TEZ tách khỏi nhau hoàn toàn
5 n-propanol - n-hexan - dung dịch amoniac 25%
Ba vết IAT, ACDQ, TEZ tách khỏi nhau hoàn toàn
Vết ACDQ và TEZ có giá trị
1 Vết IAT nằm tại đường nền
1 : 1 Vết IAT nằm tại đường nền
9 Dicloromethan - aceton 2 : 3 Vết IAT nằm tại đường nền
Dựa trên sắc ký đồ của các hệ đã khảo sát, nhóm nghiên cứu đã xác định có thể lựa chọn giữa bốn hệ 2, 3, 4, và 5 Tuy nhiên, hệ 3 và 4 cho hai vết ACDQ và TEZ không tách xa nhau so với hệ 2 và 5 Trong hai hệ này, hệ 5 nổi bật với thời gian chạy sắc ký ngắn hơn và giảm thiểu mùi do n-butanol gây ra, vì vậy nhóm nghiên cứu đã quyết định chọn hệ 5 để định tính IAT.
Qua quá trình khảo sát pha động, phương pháp TLC để định tính IAT đã đƣợc xây dựng nhƣ sau:
- Bản mỏng: Silica gel 60 F254 (Merck)
- Dung môi khai triển: n-propanol - n-hexan - dung dịch amoniac25%
- Dung dịch thử: Hòa tan một lượng tương đương 5 mg nguyên liệu IAT trong 5 ml methanol
- Dung dịch chuẩn: Hòa tan một lượng tương đương 5 mg tạp chuẩn A của USP trong 5 ml methanol
Dung dịch phân giải được tạo ra bằng cách hòa tan IAT, ACDQ và terazosin hydroclorid trong methanol, đạt nồng độ 1 mg/ml IAT, 0,5 mg/ml terazosin hydroclorid và 0,5 mg/ml ACDQ.
Để tiến hành sắc ký, hãy chấm riêng biệt 10 µl mỗi dung dịch lên bản mỏng Sau đó, triển khai sắc ký cho đến khi dung môi di chuyển được 3/4 chiều dài của bản mỏng Cuối cùng, để bản mỏng khô ngoài không khí và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm.
3.1.1.2 Thẩm định phương pháp TLC về độ đặc hiệu
Các dung dịch dùng để thẩm định độ đặc hiệu của phương pháp TLC bao gồm:
- Dung dịch mẫu trắng: Methanol
- Dung dịch thử: Hòa tan 5,2 mg nguyên liệu IAT trong 5 ml methanol
- Dung dịch chuẩn: Hòa tan 5,5 mg tạp chuẩn A của USP trong 5 ml methanol
- Dung dịch chuẩn TEZ: Hòa tan 2,7 mg chất chuẩn terazosin của USP trong 5 ml methanol
- Dung dịch ACDQ: Hòa tan 2,5 mg ACDQ trong 5 ml methanol
- Dung dịch phân giải: Hòa tan 5,2 mg tạp chuẩn A, 2,7 mg chất chuẩn terazosin của USP và 2,5 mg ACDQ trong 5 ml methanol
Chấm đồng thể tích 10 µl các dung dịch lên bản mỏng Sau khi thực hiện sắc ký và soi đèn UV 254 nm, kết quả cho thấy độ đặc hiệu của phương pháp như trình bày trong hình 3.2.
Hình 3.2 Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu của phương pháp định tính bằng TLC
Kết quả sắc ký cho thấy dung dịch mẫu trắng không tạo ra vết sắc ký, trong khi dung dịch thử xuất hiện vết có vị trí và màu sắc tương tự như vết tạp chuẩn A (R f).
Phương pháp TLC đã được chứng minh đạt yêu cầu về độ đặc hiệu khi phân giải thành công 3 vết tách biệt, bao gồm tạp chuẩn A với Rf khoảng 0,38, TEZ với Rf khoảng 0,65 và ACDQ với Rf khoảng 0,75 Điều này cho thấy phương pháp này phù hợp để sử dụng trong việc định tính nguyên liệu IAT.
3.2.2 Xây dựng phương pháp định tính, định lượng IAT bằng HPLC
3.2.2.1 Khảo sát bước sóng định lượng
Pha dung dịch nguyên liệu IAT trong pha động với nồng độ 5 µg/ml bằng cách hòa tan 5,000 mg nguyên liệu IAT trong 100 ml pha động Sau đó, hút 2 ml dung dịch này và pha loãng với pha động thành 20 ml Quét phổ UV của dung dịch trong dải từ 200 nm đến 400 nm, sử dụng cuvet 1 cm và mẫu trắng là pha động để xác định cực đại và chọn bước sóng cực đại cho định lượng Kết quả phổ UV của dung dịch IAT trong pha động được thể hiện trong hình 3.2.
Hình 3.3 Phổ UV của dung dịch IAT trong pha động
Kết quả cho thấy IAT có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 245 nm Vậy chúng tôi lựa chọn bước sóng 245 nm để định tính, định lượng IAT
Dựa trên tài liệu tham khảo và kết quả khảo sát bước sóng định lượng, nhóm nghiên cứu đã phát triển một phương pháp HPLC nhằm định tính và định lượng IAT.
+ Pha tĩnh: Cột C8 (250 x 4,6 mm; 5 àm)
Đệm citrat pH 3,2 được chuẩn bị bằng cách hòa tan 6 g natri citrat dihydrat và 14,25 g acid citric khan trong 950 ml nước cất Sau đó, điều chỉnh pH về mức 3,2 ± 0,1 bằng natri citrat dihydrat hoặc acid citric khan nếu cần thiết Cuối cùng, pha loãng dung dịch với nước cất cho đến khi đạt 1000 ml và trộn đều.
+ Pha động: Chuẩn bị hỗn hợp đệm citrat pH 3,2 - acetonitril (84 : 16), lọc và đuổi khí
+ Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
+ Bước sóng phát hiện: 245 nm
+ Thể tớch tiờm mẫu: 20 àl
- Các dung dịch tiêm sắc ký:
+ Dung dịch thử: Hòa tan 5 mg IAT trong 50 ml pha động, hút chính xác
3 ml dung dịch này pha loãng với pha động thành 20 ml
+ Dung dịch chuẩn: Hòa tan 5 mg tạp chuẩn A của USP trong 50 ml pha động, hút chính xác 3 ml dung dịch này pha loãng với pha động thành 20 ml
Dung dịch phân giải được tạo ra bằng cách hòa tan IAT, ACDQ và terazosin hydroclorid trong pha động, đạt được nồng độ 15 µg/ml IAT, 30 µg/ml terazosin hydroclorid và 30 µg/ml ACDQ.
- Tính thích hợp của hệ thống sắc ký:
Dung dịch phân giải cho thấy độ phân giải tối thiểu giữa hai đỉnh terazosin hydroclorid và IAT là 10,0, trong khi độ phân giải giữa terazosin hydroclorid và ACDQ tối thiểu là 8,0.
+ Dung dịch chuẩn: Hệ số đối xứng của pic không quá 2,0, số đĩa lý thuyết không nhỏ hơn 1500, giá trị RSD giữa các lần tiêm lặp lại không quá 2,0%
Thời gian lưu của đỉnh chính trong sắc ký đồ của mẫu thử phải tương ứng với thời gian lưu của đỉnh chính trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn.
Hàm lượng IAT trong nguyên liệu được xác định thông qua nồng độ và diện tích pic chính trên sắc ký đồ của cả dung dịch chuẩn và dung dịch thử.
3.2.2.3 Thẩm định phương pháp HPLC
Tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Dung dịch chuẩn để đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký được chuẩn bị bằng cách hòa tan 5,481 mg tạp chuẩn A của USP trong 50 ml pha động Sau đó, hút 3 ml dung dịch này và pha loãng với pha động thành 20 ml Tiêm lặp lại dung dịch chuẩn này vào hệ thống 6 lần và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Bàn luận
3.2.1 Phương pháp định tính nguyên liệu IAT bằng TLC
Đến nay, phương pháp TLC mà nhóm nghiên cứu của chúng tôi phát triển vẫn chưa được công bố trong bất kỳ tài liệu nào ngoài các tài liệu nội bộ của nhóm.
Khi thẩm định độ đặc hiệu của phương pháp TLC, dung dịch phân giải bao gồm ba thành phần chính: IAT, TEZ và ACDQ IAT là tạp chất có trong TEZ, trong khi ACDQ là nguyên liệu dùng để tổng hợp IAT Các chất này có cấu trúc hóa học tương tự nhau, điều này giúp việc tách các vết sắc ký trở nên hiệu quả hơn.
Phương pháp định tính đã được xây dựng được khẳng định độ đặc hiệu thông qua 39 mẫu thử hoàn toàn khác nhau, điều này cũng phản ánh kết quả đáng ghi nhận của nhóm nghiên cứu.
3.2.2 Phương pháp định tính, định lượng nguyên liệu IAT bằng HPLC
Hiện tại, chưa có nghiên cứu nào công bố về phương pháp định lượng nguyên liệu IAT, đặc biệt là các nghiên cứu thực hiện song song với chất chuẩn của USP.
Chúng tôi nhận thấy rằng phương pháp HPLC nhóm xây dựng để định tính và định lượng nguyên liệu IAT có nhiều điểm tương đồng và khác biệt so với các phương pháp được đề cập trong tài liệu tham khảo.
Về bản chất của phương pháp phân tích
Phương pháp xác định IAT trong USP 38 và các tài liệu tham khảo khác nhằm xác định giới hạn tạp chất A trong nguyên liệu chứa terazosin và doxazosin Trong khi đó, phương pháp của chúng tôi được xây dựng để định tính và định lượng nguyên liệu IAT tinh khiết.
Nồng độ IAT trong dung dịch phân tích theo phương pháp USP 38 cao nhất chỉ đạt 2 àg/ml, cho thấy IAT là tạp chất trong nguyên liệu terazosin Để đảm bảo độ chính xác trong định lượng, nồng độ dung dịch tiêm sắc ký trong phương pháp của chúng tôi được thiết lập ở mức 15 àg/ml.
Về dung môi pha mẫu
Phương pháp xây dựng của chúng tôi sử dụng dung môi pha mẫu động, đơn giản hơn so với phương pháp pha mẫu trong USP 38, vốn yêu cầu ba loại dung môi khác nhau cho ba giai đoạn pha mẫu.
Chúng tôi đã chọn cột C8 loại pha tĩnh để áp dụng trong các phương pháp kiểm tra chỉ tiêu tạp chất liên quan đến TEZ theo các quy định trong các Dược điển, cụ thể là phương pháp 1 và phương pháp 2 như đã đề cập trong phần tổng quan.
Về thành phần pha động và tỷ lệ pha động
Trong các nghiên cứu, thành phần và tỷ lệ pha động thường có sự khác biệt đáng kể Nghiên cứu này áp dụng pha động với thành phần đơn giản.
Sản phẩm 40 nhất có thành phần tương tự như USP 38, bao gồm hỗn hợp hai thành phần chính là đệm citrat pH 3,2 và acetonitril Tỷ lệ giữa hai thành phần này cũng tương tự như trong USP 38, nơi sử dụng tỉ lệ 1685:315, trong khi chúng tôi áp dụng tỉ lệ 84:1.
Về thể tích tiêm mẫu
Phương phỏp ỏp dụng thể tớch tiờm mẫu là 20 àl, là thể tớch tiờm mẫu theo các phương pháp tham khảo trong các Dược điển
Trong các tài liệu tham khảo, có 3 mức tốc độ dòng đƣợc sử dụng là 0,5 - 0,8 - 1 ml/phút Chúng tôi áp dụng mức tốc độ dòng là 1 ml/phút
Theo các dược điển, nhiệt độ cột cho terazosin là 30 o C và cho doxazosin là 35 o C Một nghiên cứu đã thực hiện phân tích ở hai nhiệt độ 20 o C và 40 o C Chúng tôi đã quyết định chọn nhiệt độ cột là 30 o C cho phân tích của mình.
Về bước sóng phát hiện
Phương pháp trong USP 38 sử dụng bước sóng 254 nm, bên cạnh đó còn có các bước sóng khác như 210 nm, 220 nm và 245 nm được đề cập trong tài liệu tham khảo Nhóm nghiên cứu đã thực hiện khảo sát bước sóng định lượng qua phương pháp quét phổ và phát hiện rằng 245 nm là bước sóng có độ hấp thụ cực đại của IAT Do đó, nhóm quyết định chọn bước sóng này để tiến hành định lượng IAT.
Phương pháp HPLC được phát triển dựa trên chuyên luận terazosin của USP 38 và các tài liệu tham khảo khác, đã có những điều chỉnh về bản chất và các điều kiện như nồng độ định lượng, dung môi pha mẫu, tỷ lệ pha động và bước sóng phát hiện Những thay đổi này nhằm tối ưu hóa phương pháp định lượng nguyên liệu IAT và phù hợp với trang thiết bị hiện có tại phòng thí nghiệm.
- Phương pháp HPLC đã được thẩm định theo đúng các tiêu chí được quy định trong các tài liệu chính thống như hướng dẫn của ASEAN, ICH, USP [25],
[33], [43] Độ đặc hiệu của phương pháp HPLC được đánh giá dựa trên bốn tiêu chí:
Sự tương ứng về thời gian lưu giữa pic IAT trong sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn, cùng với hệ số tinh khiết và hệ số chồng phổ UV của pic IAT, cho thấy độ phân giải cao giữa các pic trong dung dịch phân giải Dung dịch này cũng được xây dựng để thẩm định độ đặc hiệu của phương pháp, tương tự như trong thẩm định độ đặc hiệu của phương pháp TLC Kết quả thực nghiệm chứng minh rằng phương pháp này có độ đặc hiệu cao.
