ĐỊNH DANH VÀ NGHIÊN CỨU SỰ KHÁC BIỆT CỦA NẤM Phytophthora spp. Ở MIỀN NAM VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO SÁNH TRÌNH TỰ ITSrDNA

TÓM TẮT Nấm phytophthora là một trong những nấm gây hại nghiêm trọng trên cây trồng vì nó có thể gây hại trên nhiều loại cây cũng như trên nhiều bộ phận của cây, làm sản lượng nông nghi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỊNH DANH VÀ NGHIÊN CỨU SỰ KHÁC BIỆT

CỦA NẤM Phytophthora spp Ở MIỀN NAM

VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SO SÁNH TRÌNH TỰ ITS-rDNA

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : TRỊNH ĐÌNH HƯNG

Niên khóa : 2004 - 2008

Tháng 8/2009

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỊNH DANH VÀ NGHIÊN CỨU SỰ KHÁC BIỆT

CỦA NẤM Phytophthora spp Ở MIỀN NAM

VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SO SÁNH TRÌNH TỰ ITS-rDNA

Hướng dẫn khoa học: Sinh viên thực hiện:

TS LÊ ĐÌNH ĐÔN TRỊNH ĐÌNH HƯNG

Tháng 8/2009

LỜI CẢM ƠN

Con kính gửi lời cảm ơn đến ba mẹ, những người thân đã sinh ra con, nuôi dưỡng con và luôn bên cạnh đông viên con trong học tập

Tôi chân thành gửi lời cảm ơn đến:

TS Lê Đình Đôn, người luôn tân tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian làm đề tài

KS Nguyễn Văn Lẫm đã hết lòng giúp đỡ suốt thời gian tôi thực hiện đề tài Các anh chị làm việc tại trung tâm phân tích CNSH và Môi Trường, cũng như các anh chị phòng 105

Tập thể lớp DH04SH đã luôn sát cánh bên tôi chia sẻ vui buồn trong 4 năm trên giảng đường đại học

Những người bạn thân quanh tôi luôn động viên, chia sẻ niềm vui nỗi buồn

Sinh viên thực hiện

Trịnh Đình Hưng

TÓM TẮT

Nấm phytophthora là một trong những nấm gây hại nghiêm trọng trên cây trồng vì nó

có thể gây hại trên nhiều loại cây cũng như trên nhiều bộ phận của cây, làm sản lượng nông nghiệp ở nước ta giảm hàng năm, gây ảnh hưởng đến đời sống của người dân.Việc phát hiện kịp thời và tiêu diệt sớm loài nấm này có ý nghĩa quan trọng trong nông nghiệp Trên cở sở những kết quả đạt được từ việc nghiên cứu về hình thái và

sinh thái của nấm Phytophthora, chúng tôi đã đưa ra một qui trình định danh nấm

Phytophthora Quy trình định danh bao gồm quá trình tăng và nhân sinh khối, ly trích

DNA tổng số sau đó sử dụng cặp mồi ITS4 và ITS5 nhằm khuếch đại vùng trình tự đặc trưng ITS1-5,8S-ITS2 Kết hợp kết quả định danh hình thái và sự tương đồng di truyền với các loài tương ứng trên NCBI để xác định chính xác tên loài của 9 mẫu

nấm Tiến hành phân nhóm những mẫu Phytophthora đã định danh được thông qua

trình tự vùng ITS-rDNA, phân nhóm những mẫu nấm này dựa vào trình tự vùng ITS1

và trình tự vùng ITS2 để xác định vùng bảo tồn đặc trưng cho Phytophthora Sau quá trình thực hiện nghiên cứu đã tối ưu hóa quy trình ly trích DNA đối với nấm

Phytophthora Đã thiết lập và hoàn thiện qui trình phản ứng PCR khuếch đại được

vùng ITS – rDNA (ITS1– 5.8S – ITS2) bằng cặp primer ITS4 và ITS5 Xác định được

tên chính xác của 8 mẫu nấm Phytophthora thu thập ở Miền Nam Việt Nam Xây dựng cây phân nhóm của 8 mẫu nấm Phytophthora định danh được với các loài nấm trên NCBI Xác định được trình tự vùng ITS2 có tính bảo tồn cao đối với Phytophthora (82- 100%), có ý nghĩa trong việc phân biệt nấm Phytophthora ở mức độ loài Việc phân

nhóm dựa vào trình tự vùng ITS1 đặc trưng cho từng loài hơn, cho độ tin cậy cao

SUMMARY

Phytophthora is once of fungus, which undermine plants seriously, reduced

agriculture yield every year in our country.The timely detection to wipe out early this fungus is important solve in agriculture Acording to obtained resultsfrom stydies of

form and ecological Phytophthora, we were suggested a process of identifying for

Phytophthora The process includes using of PCR (Polymerase Chain Reaction) and using

of sequence technology to amplifies ITS1-5,8S-ITS2 sequense region with two primer, ITS4 ( 5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’) and ITS5 ( 5’ GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3’) Then using Clustal 1.83 and Treeview 1.6.6 software to compare ITS – rDNA (Internal Transcribed Space – rDNA) stable with their data on NCBI to identifying

species of Phytophthora The result show that:

- To optimize DNA isolated protocol for Phytophthora fungus

- To perfect PCR protocol, with purpose amplify ITS – rDNA region (ITS1– 5.8S – ITS2) by ITS4 and ITS5 primers

- Detective actually name of eight species Phytophthora

- Establishing and clearing the genetic relationship of 8 Phytophthora samples

Included : C2V3,S2, NL, A4, BT, SR500, 503 Cacao and PB235 with Phytophthora genus in NCBI

- Compare difference between eight species of Phytophthora throught compare

with the same of ITS – rDNA sequence ( ITS1 and ITS2) ITS2 is the best conserve

region of Phytophthora fungal (82-100%) Establishing and clearing the genetic

relationship base on ITS1 region will give confidence higher It have benefit for

defication of Phytophthora

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn iii

Tóm tắt iv

Summary v

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt viii

Danh sách các bảng ix

Danh sách các hình x

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về Phytophthora 3

2.1.1 Vị trí phân loại 3

2.1.2 Chu kì sống 4

2.1.3 Phân biệt nấm Pythium và Phytophthora 6

2.1.4 Triệu chứng của một số loại cây nhiễm Phytophthora 7

2.1.4.1 Trên ớt 7

2.1.4.2 Trên cà tím 8

2.1.4.3 Trên cà chua 8

2.1.4.4 Trên dưa hấu 9

2.1.4.5 Trên sầu riêng 10

2.2 Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS – rDNA 11

2.3 Phương pháp thường dùng trong phát hiện và định danh Phytophthora 12

2.3.1 Kỹ thuật quan sát đặc điểm hình thái của Phytophthora 12

2.3.2 So sánh sự tương đồng về sinh sản và sinh dưỡng 13

2.3.3 Izozymes 13

2.3.4 Huyết thanh học và kít chuẩn đoán 14

2.3.5 Kĩ thuật dùng probe , DNA fingerprinting, Molecular karyotyping 14

2.3.6 Kỹ thuật PCR( Polymererase Chain Reaction) RAPD 15

2.4 Một số công trình nghiên cứu về nấm Phytophthora 16

2.4.1 Một số nghiên cứu ngoài nước 16

2.4.2 Một số nghiên cứu trong nước 17

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 19

3.2 Vật liệu nghiên cứu 19

3.2.2 Dụng cụ và hóa chất 19

3.2.2.1 Ly trích DNA 19

3.2.2.2 Kỹ thuật điện di 20

3.2.2.3 Kỹ thuật PCR 20

3.3 Phương pháp nghiên cứu 20

3.3.1 Tăng sinh và nhân sinh khối 20

3.3.2 Ly trích DNA 21

3.3.3 Phản ứng PCR 21

3.4 Phương pháp xử lý số liệu 22

3.4.1 Xử lý trình tự 22

3.4.2 Vẽ cây phát sinh loài 22

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Quá trình tăng sinh, nhân sinh khối 23

4.2 Kết quả ly trích DNA tổng số Phytophthora 23

4.3 Kết quả chạy PCR 24

4.4 Kết quả giải trình tự 25

4.5 Kết quả phân nhóm của các mẫu nấm Phytophthora 31

4.5.1 Kết quả phân nhóm dựa vào vùng trình tự ITS – rDNA 31

4.5.2 So sánh sự khác nhau giữa các mẫu nấm dựa vào trình tự vùng ITS1 và ITS2 33

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36

5.1 Kết luận 36

5.2 Đề nghị 36

Tài liệu tham khảo 37 Phụ lục

ETDA ethylenediamine tetraacetic acid

ITS Internal Transcribed Spacer

Kbp kilobase pair

P citricola Phytophthora citricola

P.bostryosa Phytophthora bostryosa

P.capsici Phytophthora capsici

P.Cinnamomi Phytophthora cinnamomi

P.infetans Phytophthora infestans

P.Palmivora Phytophthora palmivora

PCR Polymerase Chain Reaction

RAPD Radom Amplified Polymorphism DNA

rDNA ribosome deoxynucleotide acid

RFLP Restriction fragment length polymorphism

RNA Ribonucleic acid

SDS Sodium dodecyl sulfate

TAE Tris Acetate EDTA

UV Ultraviolet

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Bảng ký hiệu các chủng nấm Phytophthora 20

Bảng 3.2 Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 50 μl 23

Bảng 3.3 Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR 24

Bảng 4.1 Độ tương đồng di truyền (%) mẫu A1 với các loài trên NCBI 26

Bảng 4.2 Độ tương đồng di truyền (%) mẫu A2 với các loài trên NCBI 27

Bảng 4.3 Độ tương đồng di truyền (%) mẫu A3 với các loài trên NCBI 27

Bảng 4.4 Độ tương đồng di truyền (%) mẫu A4 với các loài trên NCBI 28

Bảng 4.5 Độ tương đồng di truyền (%) mẫu A5 với các loài trên NCBI 28

Bảng 4.6 Độ tương đồng di truyền (%) mẫu A6 với các loài trên NCBI 29

Bảng 4.7 Độ tương đồng di truyền (%) mẫu A7 với các loài trên NCBI 29

Bảng 4.8 Độ tương đồng di truyền (%) mẫu A8 với các loài trên NCBI 30

Bảng 4.9 Độ tương đồng di truyền (%) mẫu A9 với các loài trên NCBI 30

Bảng 4.10 Kết quả định danh tên loài các mẫu trong đề tài 31

Bảng 4.11 Độ tương đồng di truyền (%) vùng ITS1 giữa các mẫu nấm 34

Bảng 4.12 Độ tương đồng di truyền (%) vùng ITS2 giữa các mẫu nấm 35

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Nấm Phytophthora inundata sau 4 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch V8 3

Hình 2.2 Chu kì sống của Phytophthora 5

Hình 2.3 Các dạng sống của Phytophthora 6

Hình 2.4 Hình dạng túi bào tử của Pythium và Phytophthora 7

Hình 2.5 Triệu chứng bệnh do P.capsici gây ra trên ớt 8

Hình 2.6 Thối rữa trái trên cà tím do nấm Phytopthora 8

Hình 2.7 Bệnh héo rũ cây cà chua do Phytophthora 9

Hình 2.8 Các giai đoạn khác nhau của bệnh thối rữa trái trên cây dưa hấu do Phytophthora 10

Hình 2.9 Bệnh thối gốc chảy mủ do nấm Phytophthora palmivora trên sầu riêng 11

Hình 2.10 Vùng trình tự ITS – rDNA 12

Hình 4.1 Sản phẩm của qui trình ly trích DNA 25

Hình 4.2 Kết quả PCR điện di trên gel agarose 1% 26

Hình 4.3 Kết quả phân nhóm nấm Phytophthora với loài tương ứng trên NCBI 32

Hình 4.4 Kết quả phân nhóm 8 mẫu nấm Phytophthora dựa vào vùng ITS – rDNA 33

Hình 4.5 Kết quả phân nhóm 8 mẫu nấm Phytophthora dựa vào vùng trình tự ITS 34

Phytophthora, hay còn gọi là hyplotype Ib (gây bệnh tàn rụi muộn ở cây) Theo Jean

Ristaino, nhà bệnh học thực vật thuộc ĐH Bắc Carolina tại Raleigh (Mỹ), trưởng

nhóm nghiên cứu, một chủng Phytophthora khác có tên haplotype Ia mới chính là thủ

phạm Các nhà khoa học đã lần theo nguồn gốc của mầm bệnh đến tận dãy Andes ở Nam Mỹ Bệnh tàn rụi muộn vẫn tiếp tục huỷ hoại những cánh đồng khoai tây và cà chua trên khắp thế giới Năm 2001, một trận dịch đã quét sạch vụ khoai tây của nước Nga - nguồn thực phẩm quan trọng của phần lớn dân nghèo trên đất nước này Những trận dịch với quy mô nhỏ hơn vẫn thường xuyên xảy ra tại Mexico, Ireland, Ecuador, và Mỹ (http://vietbao.vn/Khoa-hoc/Nan-doi-khoai-tay-Ireland-Dau-la-thu-pham/20107960/188/)

Ở miền Bắc nước ta đã phát hiện được hai loài nấm gây bệnh này, là

Phytophthora citrophthora và nấm Phytophthora citricola Bệnh làm thối rữa các cánh

hoa, chết nhụy, làm rụng hoa hàng loạt; gây hiện tượng thối nâu trên quả Đây cũng là một trong các nguyên nhân gây mất mùa các vùng bưởi đặc sản Phúc Trạch (Hà Tĩnh),

Đoan Hùng (Phú Thọ) và nhiều vùng cam quýt khác Nấm Phytophthora được xem là

một tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho thực vật do sức tàn phá mãnh liệt của nó Ở

Miền Nam, hàng năm nấm Phytophthora cũng gây ra những hậu quả to lớn, tàn phá

mùa màng, giảm năng suất và sản lượng của cây trồng Chúng gây ra rất nhều căn bệnh cho cây trồng như: bệnh thối rễ, thối lỡ cổ rễ, loét thân, tàn rụi lá, thối trái và đặc

biệt nguy hiểm là bệnh mốc sương trên khoai tây Nhìn chung nấm Phytophthora gây

bệnh trên nhiều loại cây: bưởi, tiêu, khoai tây, sầu riêng, cà chua, và gây hại trên nhiều

bộ phận: thân, lá, rễ, quả Vì vậy, nhiều nghiên cứu về nấm Phytophthora ở Việt Nam

nhằm mục đích tìm ra phương pháp phòng trừ thật hiệu quả là vô cùng cấp thiết, nhằm

để phát hiện sự lây lan, phát triển của bệnh và phát hiện được những chủng đột biến mới để có phương pháp phòng trừ tốt nhất

Ngày nay với những tiến bộ của khoa học công nghệ, nhất là công nghệ sinh học với các kỹ thuật sinh học phân tử, thì việc xác định chính xác tên loài của các

chủng nấm Phytophthora dựa vào vùng DNA bảo tồn không còn là điều vô cùng khó

khăn như trước đây Với mục đích trên, được sự hướng dẫn của TS.Lê Đình Đôn, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Định danh và nghiên cứu sự khác biệt của các loài nấm

Phytophthora spp ở Miền Nam Việt Nam bằng phương pháp so sánh trình tự vùng

ITS - rDNA ”

1.2 Yêu cầu của đề tài

Định danh nấm Phytophthora bằng các kĩ thuật sinh học phân tử Cụ thể là sử

dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi ITS4 và ITS5 để khuếch đại vùng ITS1-5,8S-ITS2

trong ribosomal DNA của nấm Phytophthora Sau đó sử dụng kỹ thuật đọc trình tự để

xác định tên loài và so sánh về sự tương đồng di truyền của vùng ITS-rDNA giữa các mẫu nấm thu thập ở Miền Nam Việt Nam

Phân nhóm những mẫu nấm định danh được dựa vào trình tự vùng ITS-rDNA, vùng ITS1, vùng ITS2, để từ đó xác định vùng nào có tính bảo tồn, vùng nào có tính

biến động đối với nấm phytophthora

Hoàn thiện quy trình định danh nấm Phytophthora giúp phát hiện nhanh và kịp

thời sự lây lan của mầm bệnh

1.3 Nội dung thực hiện

- Tăng sinh, nhân sinh khối các mẫu nấm Phytophthora trên nhiều loại cây

trồng ở một số vùng khác nhau

- Phát hiện gen ITS1-5,8S-ITS2 bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi ITS4 và ITS5

- So sánh sự tương đồng di truyền vùng ITS-rDNA của các mẫu nấm với loài tưng ứng với chúng trên NCBI

- So sánh sự khác nhau giữa các dòng Phytophthora thu thập được thông qua

so sánh sự tương đồng trình tự vùng ITS1 và ITS2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về Phytophthora

cư dân Sau đó vài thập kỷ lại gây nên một cuộc tranh cãi lớn về bệnh tàn lụi muộn

Bệnh Phytophthora đã được nghiên cứu ở Châu Âu Tuy nhiên, đây là một bệnh khá

phổ biến ở vùng nhiệt đới ẩm và gây nhiều bệnh nguy hiểm làm mất mùa ở nhiều loại

ăn quả quan trọng như: bệnh thối rễ, thối lỡ cổ rễ, loét than, tàn lụi và thối trái

Những loài Phytophthora có thể tìm thấy trong đất và nước mà chúng có thể

gây ra những triệu chứng của bệnh thối rễ và cuối cùng là chết Có ít nhất 300 loài

Phytophthora trên toàn thế giới và ít nhất 13 loài được tìm thấy ở Miền Nam Australia,

bao gồm P cinnamomi, P cactorum, P citriccola, P megasperma, P cryptogea và P

- Cây tiến hóa của Phytophthora

Leptomitale

Lagenidiales Oomycetes

Chomista

Ngành

2.1.2 Chu kì sống

Bào tử nấm Phytophthora không nhìn thấy được bằng mắt thường Dưới kính

hiển vi, hình dạng chính của chúng là hệ sợi, trông giống như những sợi tóc bạc Bào

tử túi (sporangia) được tạo ra trên những sợi nấm trong những điều kiện ẩm ướt và di động ở nhiệt độ thích hợp 22 - 280C Trong mỗi túi bào tử chứa 30 - 40 bào tử động,

có hình dạng xác định và được giải phóng khi có điều kiên thích hợp Những bào tử

động có thể di chuyển nhờ 2 roi, nó cho phép nấm Phytophthora có thể xâm nhiễm

vào những chóp rễ mới và khỏe mạnh Những bào tử động có thể sống sót trên 4 ngày Khi những điều kiện cho sự phát triển của nấm trở nên ít thuận lợi hơn (thường

là khi đất trở nên khô), những sợi nấm có thể hình thành nên dạng bào tử khác, chlamydospore (bào tử đảm hay bào tử chống chịu), đây là giai đoạn nghỉ ngơi của bào tử Giai đoạn bào tử nghỉ ngơi có thành tế bào dày và có khả năng sống sót trong đất hoặc mô vật chủ trong nhiều năm, đến khi gặp điều kiên phát triển thuận lợi thì chúng trở lại hoạt động Sợi nấm cũng có thể sống sót trên những mảnh thực vật hoặc trong đất (Robyn Bromley, June 2004)

Hình 2.3 Chu kì sống của nấm Phytophthora

(http://www.environment.sa.gov.au/biodiversity/pdfs/phytophthora_booklet.pdf)

Khi nấm Phytophthora được nuôi cấy trong môi trường thích hợp, khuẩn ty

(Mycelium) của nó phát triển rất nhanh Dưới điều kiện ẩm ướt chúng tạo ra những bào

tử vô tính được gọi là túi bào tử (Sporangia) hoặc túi bào tử động (Zoosporangia) Túi bào tử này nảy mầm trong môi trường nước hoặc khi nhiệt độ môi trường giảm Chúng phóng thích ra những bào tử động (Zoospore) với hệ lông roi không đều nhau Những bào tử động sau khi được phóng thích ra sẽ bơi lội hàng giờ liền và cuối cùng ngừng bơi lội để cuộn tròn hay kết kén Sau một thời gian chúng hình thành vách tế bào Ở giai đoạn này, bào tử được gọi là kén hay nang (Cyst) Bào tử chống chịu (Chlamydospore) ở dạng hình cầu hay oval, là một cấu trúc nghỉ vô tính Cấu trúc hữu tính bào gồm túi giao tử đực (Antheridium- bộ phận sinh sản đực) và túi noãn (oogonium - bộ phận sinh sản cái) Quá trình giảm phân hình thành nên túi giao tử đực

và túi noãn Đây chỉ là giai đoạn đơn bội trong vòng đời của nấm Phytophthora Giai

đoạn lưỡng bội đóng vai trò quyết định trong suốt chu kì sống của chúng Các vòi thụ tinh từ túi giao tử đực sẽ thoát vị đưa nhân của giao tử đực vào noãn Hợp tử sau khi

thụ tinh sẽ nảy mầm ở điều kiện thích hợp tùy thuộc vào sự kết hợp của trứng với một

hay nhiều ống giao tử đực Giống nấm Phytophthora bao gồm một số loài nấm dị tản (Heterothallic) (có hai kiểu lai A1và A2) như P infestans Số còn lại là những loại nấm đồng tản (Homothallic) bao gồm cả P sojae hoặc P porri

Hình 2.3 Các dạng sống của nấm Phytophthora (A): Sporangia;

(B): Zoospore ; (C): Chlamydospore ;(D): Oospore)

(http://en.wikipedia.org/wiki/Phytophthora)

2.1.3 Phân biệt nấm Pythium và Phytophthora

Khi phân lập các loài nấm Phytophthora, một trong những vi sinh vật mà chúng

ta thường đối mặt là nấm Pythium Nấm Phytophthora và nấm Pythium đều thuộc họ

Pythiaceae và chúng có mối quan hệ di truyền rất gần nhau Sự khác nhau giữa hai

giống này bao gồm sự khác nhau về cách tạo ra bào tử động: ở Phytophthora bào tử động thường sản xuất bên trong túi bào tử, ở nấm Pythium bào tử động phát triển bên

trong nang được sản xuất bởi túi bào tử Đây là đặc điểm quan trọng nhất dùng để

phân biệt nấm Phytophthora và nấm Pythium

Ngoài ra, Pythium và Phytophthora spp có quá trình tái sinh cấu trúc sinh

dưỡng tương tự nhau Một túi noãn (oogonium) sẽ được thụ tinh bởi một túi giao tử

đực (antheridium) Kết quả tạo ra một túi bào tử hai vách dày Quá trình tái sinh cấu

trúc sinh dưỡng là túi bào tử (sporangia) và cho phép dễ dàng thấy được sự khác nhau

giữa Pythium và Phytophthora Túi bào tử của Pythium có dạng hình cầu đến oval

hoặc có thể có hình thù không theo quy luật, trong khi túi bào tử của Phytopthora có

hình thù đặc trưng của quả chanh Đó là những hình dạng chung có thể được dùng để

xác định Pythium và Phytophthora, tuy nhiên sự đa dạng di truyền bên trong mỗi

giống có thể xác định phức tạp hơn nhiều (Jason H Broc và Glenn H Beard, 2002)

(b) (c) (a)

Hình 2.4 Hình dạng túi bào tử của nấm Pythium và nấm Phytophthora (a): Pythium

oogonium (O) và Antherridium (A); (b): Pythium Sporagium; (c): Phytophthora Sporangia

(http://www.abbs.info/pdf/40-02/9-158-07291.pdf)

2.1.4 Triệu chứng của một số loại cây nhiễm nấm Phytophthora

2.1.4.1 Trên ớt

Rễ, thân, lá và trái của những cây ớt trưởng thành rất dễ bị tổn thương Mặc dù

sự lây nhiễm có thể xuất hiện ở những vùng cao nhất của cây hầu như bệnh thường

xuất hiện vùng gần mặc đất, những vùng tối, và đẫm nước Nơi thân cây bị thương tổn

trở nên nâu đen rồi đen và cuối cùng thân bong vỏ và cây chết Những rễ nhiễm bệnh

thường có màu nâu đen và xốp

Những đốm trên lá đầu tiên nhỏ, không đồng đều sau đó lan rộng toàn bộ lá

Khi lan rộng, những đốm bệnh có màu nâu sáng và có thể rạn nứt Những vùng nhiễm

bệnh được phân chia bởi sự phát triển của những sợi nấm trắng trong suốt mùa mưa

Sự thối rữa nhanh chóng của các lá non và sự thay thế toàn bộ chồi non

Những quả ớt bị nhiễm bệnh thông qua thân cây Sự thối rữa quả xuất hiện ở

những vùng có màu xanh đen, ẩm ướt và được phủ lên trên một một lớp sợi nấm màu nâu

đen như bông Những quả ớt nhiễm bệnh khô, trở nên co quắt lại, nhăn nheo, có màu nâu

và vẫn còn những tàn tích giống như thân cây (Amanda J Gevens và ctv, 1994)

Mặc dù toàn bộ cây rất dễ nhiễm bệnh, nhưng thối rữa quả là triệu chứng đầu

tiên gây ra bởi P capsici trên cây cà tím Triệu chứng khởi đầu từ một vùng tròn nâu

đen trên bất kì phần nào của trái ở bất kì giai đoạn phát triển nào Những tổn thương ban đầu là đường viền bao quanh bởi sự lan rộng nhanh chóng vùng màu nâu sáng Phát triển từ trắng đến xám trong suốt mùa mưa, giai đoạn ẩm ướt, bắt đầu trên phần

già nhất của trái bị tổn thương Nấm Phytophthora gây thối rữa trái trên quả cà tím Bệnh thối rữa trái cà tím cũng có thể do các loài nấm như Phytophthora spp và Phompsis sp

Hình 2.6 Thối rữa trái trên cà tím do nấm

Phytopthora.(http://edis.ifas.ufl.edu/VH045)

2.1.4.3 Trên cà chua

Nấm Phytophthora có thể gây nhiễm bệnh trên ngọn, đốm lá và tàn rụi lá ở cây

cà chua Những ngọn cây nhiễm bệnh có màu nâu và mềm, những cây nhiễm bênh này thường dễ bị héo và ngã đổ phần trên Triệu chứng chung khác thường gặp là thối rữa trái Những trái không bị tổn thương ở bất kì độ tuổi nào cũng có thể bị nhiễm bệnh

Sự thối rữa hầu như phổ biến ở những vùng trái tiếp xúc với đất và bắt đầu có bóng tối, hoặc những vùng ẩm ướt Những đốm bệnh lan rộng nhanh chóng trong suốt thời tiết ấm áp và bao phủ 50% hoặc hơn trên bề mặt trái, với sự xuất hiện của những vùng đồng tâm Đầu tiên, những trái bị nhiễm bệnh vẫn còn trơn mượt và rắn chắc mặc dù

sự bạc màu đã lan rộng đến trung tâm trái Sau thời gian đó và dưới điều kiện ẩm ướt, trái nhiễm bệnh được phủ một lớp nấm trắng và thối rữa hoàn toàn khi bị sự xâm nhiễm của một vi sinh vật thứ hai Những triệu chứng của bệnh thối rữa trái trên cây cà

chua gây ra bởi loài nấm khác Phytophthora spp , P dreschlera và P parasitica về cơ bản giống nhau Sự thối rữa trái cà chua gây ra bởi P.infestans (tàn rụi muộn) thì nhăn

nheo, bờ mép lõm hóp

Hình 2.7 Bệnh héo rũ cây cà chua do nấm

Phytophthora.(http://edis.ifas.ufl.edu/VH045)

2.1.4.4 Trên dưa hấu

Triệu chứng bệnh tàn rụi trên lá dưa hấu là khô và trở nên nâu và chết muộn Tuy nhiên, tất cả các giai đoạn của cây dưa hấu có nguy cơ nhiễm bệnh cao Triệu chứng sớm của bệnh thối rữa trái bao gồm sự lan rộng nhanh chóng, không đều của những vùng tổn thương màu nâu rồi lan rộng thành hình oval Những vòng tròn đồng tâm có thể xuất hiện trong phạm vi vùng bị tổn thương Những vùng trung tâm thối rữa được phủ lên một màng nấm trắng, trong khi ở mép ngoài xa hơn của vùng nhiễm bệnh có màu nâu đen và ướt Cuối cùng toàn bộ trái bị thối rữa Những triệu chứng

ban đầu của vi khuẩn gây sưng trái dưa hấu cũng tương tự như P capsici Tuy nhiên,

sau khi những vùng tổn thương lan rộng, thì hai bệnh này có thể dễ phân biệt vì sự lan rộng ra ngoài, sự hiện của màng nấm và những triệu chứng khác liên hệ với vi khuẩn

gây sưng trái, Phytophthora gây thối rữa

Hình 2.8 Các giai đoạn khác nhau của bệnh thối rữa trái trên cây dưa hấu do nấm Phytophthora

(http://edis.ifas.ufl.edu/VH045)

2.1.4.5 Trên cây sầu riêng

Nấm Phytophthora palmivora gây hại trên sầu riêng từ giai đoạn vườn ươm đến

cây trưởng thành và cây đang cho trái, trên rễ, thân, lá và trái Trên rễ: cây sầu riêng trồng trên vùng đất thấp, ẩm độ cao thì rễ dễ nhiễm nấm Phytophthora và thường thấy các rễ non bị thối có màu nâu đen, rễ chết dần làm cây phát triển chậm, sau đó nấm lây lan dần đến phần thân cây phía trên làm chảy nhựa thân, bộ lá chuyển màu vàng cây không phát triển và chết dần Trên thân, cành: cây nhiễm bệnh có bộ lá không còn bóng mượt và chuyển màu vàng, sau đó rụng theo từng cành hay một phía của cây, bộ

rễ phía dưới bị thối Trên thân có dấu hiệu chảy nhựa ra trên bề mặt vỏ cây, vết bệnh ướt và nhựa có màu nâu, nấm thường tấn công xung quanh gốc và các cành của cây sầu riêng Nếu cây bị hại nặng vết bệnh sẽ phát triển xung quanh thân chính và cành làm cho bộ lá biến màu vàng úa cuối cùng làm cây chết vì không được cung cấp dinh dưỡng Khi cạo lớp vỏ bị bệnh ra thấy phần gỗ có màu nâu sẫm chạy dọc theo thân và cành Trên lá: vết bệnh đầu tiên là những đốm đen nâu nhỏ trên mặt lá và lan rất nhanh, sau 2 ngày lá chuyển thành màu nâu và bào tử nấm lây sang lá kế cận, lá bị nhũng rồi khô dần và sẽ rụng sau vài ngày, khi có mưa kèm theo gió mạnh sẽ là điều kiện tốt cho bệnh lây lan khắp cả vườn Trên trái: vết bệnh khởi đầu là một vài chấm nhỏ màu nâu đen thường xuất hiện ở vị trí dọc theo chiều từ cuống trái sầu riêng trở xuống xung quanh trái, hiếm thấy vết bệnh ở phần cuối trái, sau đó phát triển thành hình tròn hay loang lỗ và có màu nâu trên vỏ trái Khi trái già vết bệnh nứt ra và phần

thịt bên trong bị thối, có rất nhiều sợi nấm màu trắng trên vết bệnh và làm trái sầu

riêng rụng trước khi chín (KS Nguyễn Văn Đức Tiến và Nguyễn Thị Lệ Thoa, 2008)

b) c) a)

Hình 2.9 Bệnh thối gốc chảy mủ do nấm Phytophthora palmivora trên sầu riêng

(http://www.dost-bentre.gov.vn/index.php?option=com_content&task=view&id=1285&Itemid=282)

2.2 Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS – rDNA

rDNA (ribosomal DNA) là nhóm gene mã hoá rRNA của ribosome, có nhiều bản sao

và không mã hoá cho bất kỳ protein nào Đây là vùng gen bảo tồn nên được xem là cơ

sở chính xác để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt của các sinh vật cùng loài hay khác loài, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quá trình tiến hoá, phát sinh loài, phân loại nấm và xác định tính đa dạng di truyền của sinh vật cũng như các dòng nấm do việc phân loại nấm dựa vào đặc điểm hình thái, cơ chế trao đổi chất, cấu trúc vách tế bào và thành phần protein có kết quả phân loại thường không chính xác và cần khoảng thời gian dài (Guarro và cs, 1999)

rDNA chứa vùng 18S, ITS1, 5.8S, ITS2, 28S và IGS (Intergenic Spacer là vùng kém bảo tồn nhất của rDNA) Vùng 5.8S – rDNA có kích thước rất nhỏ và ít có sự biến đổi (Szymanski và cs, 2001) Vùng ITS – rDNA là vùng có rất nhiều biến đổi, mặc dù chúng thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hoá của sinh vật tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này thường để xác định các biệt hoá trong cùng loài để lập phổ

hệ di truyền (Guarro và cs, 1999)

Các primer thiết kế trên những oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật cùng giới nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh, tạo phổ hệ di truyền Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng được thiết kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật (Van de peer và cs, 1996) Các primer chúng tôi sử dụng trong đề tài này cũng được thiết kế theo hai dạng trên Vùng ITS, các primer được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn 18S, 5.8S và 28S Primer ITS2 và ITS3 được thiết kế, sàng lọc dựa trên vùng 5.8S – rDNA của N

crassa, Schizosaccharomyces pombe và S cerevisiae, Vicia faba chuột Vùng 28S –

rDNA của S prombe, S cerevisiae và lúa (Oryza sativa) được so sánh để thiết kế ITS4 Primer ITS5 có trình tự dựa vào vùng 18S – rDNA của N crassa, có đầu 5’ chỉ

cách primer ITS1 25 bp (White và cs, 1989)

Hình 2.10 Vùng trình tự ITS – rDNA

2.3 Phương pháp thường dùng trong phát hiện và định danh Phytophthora

2.3.1 Kỹ thuật quan sát đặc điểm hình thái của Phytophthora trên môi trường nuôi cấy

Đây được xem là kỹ thuật định danh cơ bản bởi vì nó xuất hiện sớm và được sử

dụng rộng rãi trong quá trình phân lập, định danh các loài nấm cũng như vi khuẩn gây bệnh

Những đặc điểm hình thái làm cơ sở để nhận biết nấm Phytophthora bao gồm:

hình dạng túi bào tử, chóp đầu và tính rụng, sự hiện diện của bào tử vách dày và sợi nấm trương phồng, sự tiếp xúc giữa túi đực và túi noãn và tổ chức hữu tính là cùng tản

hay khác tản

Môi trường thông thường dùng cho quá trình nhận biết Phytophthora: V-8

juice, cà rốt agar, lima bean agar

Khi ủ ở nhiệt độ thích hợp, mẫu nấm nuôi cấy sẽ có những biểu hiện hình thái đặc trưng cho loài Đặc điểm sợi nấm, hình dạng tản nấm hoặc khả năng hình thành bộ phận vô tính như túi bào tử, bào tử vách dày (chlamydospore) trên bề mặt môi trường

nuôi cấy là đặc điểm quan trọng để phát hiện Phytophthora

Với kỹ thuật trên ta có thể phát hiện một số loài Phytophthora chẳng hạn: loài

P.capsici với dạng tản nấm đồng nhất, túi bào tử hình thành nhiều nhưng không có sự

hiện diện của bào tử vách dày (chlamydospore) Trong khi P parasitica với dạng nấm

xòe ra, túi bào tử và bào tử vách dày (chlamydospore) hình thành phong phú trên môi

trường nuôi cấy

Tuy nhiên, kỹ thuật này đòi hỏi nhiều thời gian và công sức Nó không phải là giải pháp tốt cho kiểm tra thường lệ trên một số lượng mẫu lớn (Drenth và Irwin, 2001) Mục đích định danh muốn thực sự đạt hiệu quả cao, ta phải kết hợp đồng thời

kỹ thuật quan sát hình thái với các kĩ thuật hiện đại về sinh học phân tử

2.3.2 So sánh sự tương đồng về sinh sản và sinh dưỡng

Kĩ thuật so sanh tính tương đồng về sinh sản thường được sử dụng để xác định

và mô tả mật độ lai của loài, đặc tính sinh học giữa các loài, bên trong loài Kĩ thuật so sánh tính tương đồng về sinh dưỡng thường được sử dụng để xác định các tiểu quần thể clone hoặc các cá thể trong một loài Hai kỹ thuật này khác nhau không nhiều về di

truyền và cơ chế

Giới hạn của kiểm tra tính tương quan sinh sản bao gồm những điều sau: khó khăn phải đối mặt trong việc tái sinh những điều kiện lai thích hợp trong môi trường thuần khiết Tất cả những chủng kiểm tra thích hợp trong những quần thể lai khác nhau của các loài định sẵn có thể không có giá trị, một số cá thể trong quần thể nấm có thể không có bộ phận sinh sản, và do đó không thể tái sản xuất với bất kỳ những chủng kiểm tra đã biết

So sánh về sinh dưỡng hay dị thể hạch (heterokaryon) giúp ta hiểu thêm về mối liên hệ di truyền của những chủng nấm trong một loài Kỹ thuật này đơn giản dựa vào

khả năng nối nhau của sợi nấm của hai chủng khác nhau

Kỹ thuật này được sử dụng như một kĩ thuật xác định sự đa dạng di truyền trong

các loài nấm, đột biến dinh dưỡng- sinh trưởng, đột biến nitrate- nonutilizing (nit)

2.3.3 Izozymes

Trong phân tách Izozyme, nhiều enzyme có thể không kiểm tra được trong các mẫu đã định Các enzyme cắt này được xác định có thể ở dạng đơn hình trong khi có rất ít sự khác nhau giữa các loài, dưới loài hoặc chúng có độ đa hình rất cao Các enzyme sau khi điện di trên tinh bột, gel polyacryamide, hoặc màng cellulose acetate

cơ chất enzyme được cho vào cùng với thuốc nhuộm chlorogenic Phản ứng giữa enzyme với cơ chất và với thuốc nhuộm, phức tạp của phản ứng màu phản ánh sự hiện

diện của enzyme Sự khác nhau nhỏ trong cấu hình acid amino có thể thay đổi trong cấu trúc hay vật mang của protein Sự xác định và tính biến động của những enzyme này phụ thuộc nhiều yếu tố khác nhau bao gồm những điều kiện trên sinh vật như: tốc

độ tăng trưởng, độ pH, dòng điện, hệ thống đệm, tuổi, độ đậm của dung dịch nhuộm

và chuẩn bị mẫu

Gel cellulose acetate thường được sử dụng do nó hạn chế thấp nhất thời gian

chuẩn bị so với điện di bằng gel polyacrylamide và tinh bột (Miroslav Zeidler, 2000)

2.3.4 Huyết thanh học và kít chuẩn đoán

Việc ứng dụng kháng thể trong kiểm tra và phát hiện nấm gây bệnh có nguồn gốc từ đất đã ra đời 5 - 10 năm trước Nhiều phương pháp thường được sử dụng để sản xuất ra huyết thanh miễn dịch các loại bệnh cây do nấm gây ra mà không cần phải hiểu biết về mặt di truyền của nguyên liệu nấm bệnh (vách tế bào, bào tử, các protein hòa tan)

đã tạo ra huyết thanh miễn dịch đa dòng đặt biệt Vấn đề gặp phải với kháng thể sử dụng

là sự thiếu tính chuyên biệt và đặc hiệu trong hầu hết chất nền là mô cây hay đất

Kháng thể đơn dòng được chấp nhận như một dụng cụ chuẩn đoán và phát hiện

ở mức độ loài và dưới loài Kháng thể đơn dòng có thể ở cấp độ giống, loài hay các

chủng đặc biệt

Các kit chuẩn đoán thường kiểm tra và phát hiện các mần bệnh từ đất dựa vào

kĩ thuật kháng thể đơn dòng hay đa dòng Những kit này có thể chứng minh rằng sự

cần thiết của các chuẩn đoán nhanh và chính xác

2.3.5 Kĩ thuật dùng probe acid nucleic, DNA fingerprinting và Molecular karyotyping

Sử dụng DNA như probe phân tử để xác định các loài nấm bệnh Một đoạn

DNA giới hạn được tạo dòng và được dùng để xác định ở cấp độ loài nấm P.parasitica

(Goodwin và cs, 1989) Hiệu quả của các probe acid nucleic khi xác định các loài nấm phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau bao gồm cả mức độ đa dạng di truyền hiện diện

trong các loài đã biết

Một số ứng dụng khác của probe acid nucleic gần đây là việc sử dụng các probe DNA Minisatellite trong kĩ thuật DNA fingerprinting (Jeffreys và cs, 1985) Các probe rất nhỏ được sử dụng trên rất nhiều sinh vật để xác định cá thể và theo dõi phả hệ,

chúng chỉ hiện diện để xác định độ đa dạng di truyền trên nấm Minisatellite probe, probe oligonucleotide có thể được ứng dụng cho cấp độ loài, dưới loài và cả những dòng clone (Rodriguez, 1989)

2.3.6 Kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên biệt

Đây là kỹ thuật quan trọng của nghiên cứu vì quá trình PCR có khả năng khuếch đại đoạn DNA cần thiết lên số lượng lớn với cặp mồi đặc trưng Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng cặp mồi ITS4 và ITS5 để khuếch đại vùng trình tự ITS – rDNA.Trong kỹ thuật này chúng ta cần phải lưu ý đến các yếu tố như: nồng độ DNA mẫu, nồng độ của những thành phần tham gia phản ứng PCR, chu trình nhiệt của phản úng vì chúng có ảnh hưởng lớn lên kết quả phản ứng PCR

Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Phương pháp PCR đã được hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase Thật vậy, nếu ta cung cấp mồi chuyên biệt bắt cặp bổsung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp được đoạn DNA nằm giữa hai mồi đó Vì thế, ta có thể sử dụng cặp mồi riêng biệt để khuếch đại vùng đặc trưng của một loài, từ đó có thể định danh được tên loài

Phản ứng PCR gồm 3 bước:

(1) Biến tính phân tử DNA

(2) Bắt cặp mồi với mạch khuôn

+ Mồi và nhiệt độ lai: Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có kết quả cao Trình tự mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp

bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược Mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại

+ Các thành phần khác : như dNTP, Mg2+ cũng ảnh hưởng mạnh đến quá trình PCR Nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm

+ Số lượng chu kì phản ứng PCR: Không nên vượt quá 40 chu kì, vì sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau ( Hồ huỳnh Thùy Dương, 1998)

2.4 Một số công trình nghiên cứu về nấm Phytophthora

2.4.1 Một số nghiên cứu ngoài nước

Để nhanh chóng và chắc chắn về sự khác nhau của P infestans từ những loài

Phytophthora khác, hai đoạn DNA đạt được từ kĩ thuật RAPD đã được lựa chọn như

những marker, cũng như những primer cho kĩ thuật PCR để phát hiện một cách đặc

hiệu P.infestans đã được phát triển bởi kĩ thuật phân tích những trình tự của vùng ITSII trong rDNA của các loài Phytophthora Những primer, PISP-1 và ITS3 được khuếch đại một đoạn đơn Đoạn 450 bp có trong bộ gen của P.infestans, nhưng không

hiện diện ở các loại nấm hoặc vi khuẩn khác Nhiệt độ lai và chất lượng DNA mẫu được thay đổi nhằm tối ưu hóa những điều kiện PCR Từ kết quả của nghiên cứu phát hiện bằng PCR, những primer chuyên biệt cho loài được lựa chọn với nhiệt độ lai trong khoảng 550C – 610C, và nồng độ DNA mẫu từ 10 pg – 100 ng (Kyoung Su Kim

và Youn Su Lee, 2001)

Sự khác nhau về mặt di truyền giữa 10 mẫu phân lập của Phytophthora

cinnamomi Rand và 24 mẫu của Phytophthora citricola Sawada từ 12 loài thực vật

khác nhau phát triển ở vườn ươm Polish đã được xác định DNA được tách chiết từ nuôi cấy mầm bệnh thuần khiết và được khuếch đại bằng kĩ thuật PCR sử dụng những

đoạn mồi ISSR và RAPD 9 primer được dùng để khuếch đại DNA của P cinnamomi

và 8 dùng để khuêch đại DNA của P citricola Những sản phẩm khuếch đại được phân tích nằm trong khoảng 300 - 2300bp Sự khác biệt về mặt di truyền từ 17-35% đối với P

cinnamomi và từ 10 - 60% đối với P citricola(Katarzyna Wiejacha và ctv, 2004)

Việc xác định được 12 trình tự đa hình đơn trong trình tự genome của

Phytophthora ramorum đã tạo ra một bước đột phá quan trọng, phát hiện ra sự đa dạng

di truyền của chúng trong các vườn ươm (chiếm 91%) cao hơn một cách đáng kể so

với các khu rừng (18%) Những phân tích đã xác định được chỉ có hai dạng di truyền liên hệ chặt chẽ trong các khu rừng ở Mỹ, trong khi những cấu trúc di truyền phổ biến

từ các vườn ươm ở Châu Âu là dạng trung gian phức tạp Trên cây phân loại di truyền

151 mẫu phân lập tạo thành 3 nhánh Mẫu ở khu rừng Mỹ và vườn ươm Châu Âu trên cây phân loại tạo thành 2 nhánh riêng biệt , trong khi một mẫu phân lập từ một vườn ươm ở Mỹ thuộc một nhánh thứ 3 khác Kết hợp Microsatellite với phân tích trình tự

và đa hình cho thấy 3 nhánh cho thấy dòng tiến hóa khác nhau Điều này có ý nghĩa trong ngăn chặn mầm bệnh và thương mại (K.Ivors M và ctv, 2006)

58 loài phân lập bao gồm 39 loài Pyhthium và 17 loài Phytophthora được chọn

để phân tích mối quan hệ di truyền với việc phân tích trình tự của 3 vùng gen: rDNA, cytochrome xidase II (cox II) và beta-tubulin Vùng trình tự ITS1 và ITS2, bao gồm trình tự 5.8S-rDNA được khuếch đại bằng PCR với toàn bộ primer ITS1 và ITS4 Bên cạnh đó, trình tự 563bp của cox II được khuếch đại với cặp primer FM66 và

ITS-FM58 đối với Pythium và FM75 và FM78 đối với Phytophthora Trình tự 658bp của

beta-tubulin đựợc khuếch đại với primer xuôi BT5 và primer ngược BT6 Kết quả phân tích 3 vùng DNA cho ra bốn nhánh chính trong cây phát sinh loài Nhánh 1 bao

gồm Pythium được phân lập từ giai đoạn sợi nấm đến giai đoạn túi bào tử phân thùy Nhánh 2 là Pythium từ giai đoạn bào tử chống chịu đến bào tử động Trong khi đó nhánh 3 là Phytophthora được phân lập từ những tảng nấm Nhánh 4 là những loài

Pythium có túi bào tử chống chịu tương tự với túi bào tử có nhú quan sát được ở Phytophthora Vậy với trình tự của 3 vùng trên có thể xác định mối quan hệ di truyền

của những loài đã phân lập được (Villa và ctv, 2006)

2.4.2 Một số nghiên cứu trong nước

Sử dụng hai kĩ thuật mô tả hình thái và PCR định danh được một số loài nấm

như Phytophthora capsici gây bệnh trên hồ tiêu ở Bà Rịa- Vũng Tàu, Phytophthora

parasitica gây bệnh trên sầu riêng Đồng Nai, Phytophthora palmivora gây bệnh trên

sầu riêng và lan Dendrobium Ở Đắc Lắc và Thành Phố Hồ Chí Minh

Viện Bảo vệ thực Vật, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã ngiên cứu về

dịch hại chính do nấm gây ra trên cây hồ tiêu trong đó có nấm Phytophthora Nghiên cứu cho thấy bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora và Pythium gây ra: P.capsici,

P.cinnamomi, P.nicotianae và nấm Pythium Trong đó nấm P.capsici là tác nhân gây

hại chính Điều trị tích cực bằng thuốc Agrifos 400 vào đầu mùa mưa đối với các gốc

tiêu bị bệnh có tác dụng hạn chế lây lan của bệnh Bệnh chết chậm là một bệnh phức

hợp do tác hại cộng hưởng của nhiều tác nhân như: tuyến trùng, nấm Fusarium,

Phytophthora, Pythium, rệp sáp gây ra Bước đầu sử dụng phân bón hữu cơ đa chức

năng MT1 có hiệu quả hạn chế tác hại của dịch bệnh và tăng năng suất hồ tiêu tại Đắc Nông và Quảng Trị (Báo cáo dịch hại chính trên cây hồ tiêu và biện pháp phòng trừ, Viện Bảo vệ thực vật, Viện Khoa học Nông nghiệp Miền Nam, 2006)

Theo Võ Thị Thu Oanh (2003) thành phần bệnh hại trên cây sầu riêng tại thành phố Hồ Chí Minh có 8 loại bệnh hại, tất cả đều do nấm gây ra Trong đó trên trái sâu

riêng có 2 bệnh hại đó là: bệnh bồ hóng lớp (do nấm Capnodium sp.) và bệnh thối trái (do nấm Sclerotium rolfsii hoặc do nấm Phytophthora sp.), trong đó bệnh thối trái do nấm Phytophthora sp rất phổ biến ở các vườn

Bệnh xì mủ, thối gốc do nấm Phytophthora spp gây ra là một bệnh rất nguy

hiểm trên nhiều loại cây trái như sầu riêng, cam, quýt, nhãn, chôm chôm, ca cao Ðây

là một bệnh rất nguy hiểm trên cây ăn trái, bởi vì chúng tấn công và gây hại nghiêm trọng trên nhiều loại cây trồng từ giai đoạn cây con đến giai đoạn trưởng thành thậm chí đến giai đoạn sau khi thu hoạch Trong mùa lũ, phần lớn cây trồng đều bị tổn thương, nhất là bộ rễ, vì thế nấm bệnh dễ dàng tấn công, chúng biểu hiện rõ nhất là giai đoạn sau lũ, đôi khi làm cho vườn cây chết hàng loạt, hơn cả thiệt hại khi ngập

Ðể phòng trị bệnh này, cần có những biện pháp tổng hợp từ canh tác đến việc sử dụng thuốc hóa học như: sử dụng gốc ghép kháng bệnh, cải thiện các biện pháp canh tác như đất đai thông thoáng, thoát nước tốt, nhất là sau khi cây ngập úng, cần tạo điều kiện cho vườn thoát nước nhanh bằng cách khai thông nơi ứ đọng nước và phá

bỏ lớp váng mặt đất bằng cách dùng cuốc răng xới nhẹ mặt đất sau khi nước rút Khi phát hiện cây bệnh , phải sớm điều trị bằng thuốc hoá học kết hợp với việc cải thiện các yếu tố canh tác như trên Hiện nay, hai loại thuốc được xem là đặc trị của bệnh xì

mủ, thối gốc là Aliette và Ridomil Tuy nhiên , chúng chỉ có hiệu quả trong thực tế khi điều trị sớm và đúng cách (Bùi Thanh Liêm, 2004)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được tiến hành từ tháng 4 đến tháng 8 năm 2008 tại trung tâm phân tích

Hóa Sinh trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

Các chủng nấm Phytophthora được phân lập ở Miền Nam Việt Nam do Bộ

Môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Học, trường Đại Học Nông Lâm cung cấp

Bảng 3.1 Bảng ký hiệu các chủng nấm Phytophthora

Tên ký hiệu Kết quả định

danh hình thái Cây kí chủ Địa điểm phân lập

C2V3 P.nicotianae Bưởi Bình Dương

S2 P.colocasiae Khoai Môn Đồng Nai

NL P.palmivora Ca Cao ĐH Nông Lâm

TP.HCM

A4 P.capcisi Tiêu Bà Rịa - Vũng Tàu

BD P.parasitica Thân bưởi ĐDL Tân Uyên- Bình Dương

BT P.palmivora Ca cao Bến Tre

SR500 P.palmivora Sầu riêng Đắc Lắc

503 Ca Cao P.palmivora Ca cao Đắc Lắc

Cọng lá PB235 P.botryosa Cọng lá cao su Bà Rịa- Vũng Tàu

3.2.2 Dụng cụ và hóa chất

3.2.2.1 Ly trích DNA

Dụng cụ:

+ Máy vortex + Máy li tâm

+ Máy ủ nhiệt độ 600C + Pipetman và đầu tip các loại

Hóa chất:

+ Lysis buffer (50 mM Tris HCl; 50mM EDTA; 3% SDS; 1% β-mercaptoethanol ) pH 8.0 + Hỗn hợp Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol (25:24:1)

+ Isopropanol, Ethanol 70%, Nitơ lỏng

+ Dung dịch TE (10mM Tris HCl; 1mM EDTA; pH 8.0 )

3.2.2.2 Kỹ thuật điện di

Vật liệu:

+ Mẫu nấm ly trích

Hóa chất:

+ Dung dịch TAE (Tris HCl; NàEDTA 0,5M; Glacial acetic acid)

+ Agarose, Thuốc nhuộm gel Ethidium bromide 1%

+ 10X PCR buffer + Dung dịch đệm TAE 0,5%

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Tăng sinh và nhân sinh khối

Mẫu nấm được thu thập trên nhiều cây ký chủ khác nhau được tăng sinh trên môi trường PGA

Sau khoảng 3 - 4 ngày, khi tản nấm đã hình thành và có đường kính khá lớn (4 -5 cm)

ta tiến hành cấy nấm sang các đĩa môi trường cà rốt đặc

Sau 3 - 4 ngày khi tản nấm có đường kính khoảng 4-5 cm, thì tiến hành cấy nấm sang môi trường nhân sinh khối cà rốt lỏng

Cách cấy nấm sang môi trường nhân sinh khối:

+ Sử dụng những đĩa nấm mang các tản nấm có đường kính 4 - 5cm

+ Cắt nhỏ (băm nhuyễn) rìa mép tản nấm

+ Cấy mẫu nấm đã được băm nhuyễn sang bình chứa môi trường cà rốt lỏng + Sau khi cấy, những bình nhân sinh khối phải được ủ tối từ 6 - 8 ngày trong điều kiện nhiệt độ phòng, tĩnh lặng

Quá trình thu sinh khối: mẫu nấm sau khi nhân sinh khối sẽ được lọc qua vải

đã được hấp khử trùng và làm khô kiệt bằng giấy thấm Bảo quản mẫu ở -700C

3.3.2 Ly trích DNA

Qui trình ly trích DNA tổng số dựa trên qui trình ly trích của Lee và Taylor (1990)

có cải tiến một số bước

Qui trính ly trích DNA

- Nghiền mẫu trong Nitơ lỏng và cho vào các eppendorf

- Mỗi eppendorf ly trích chứa khoảng 1/3 mẫu nấm đã nghiền

- Cho vào mỗi eppendorf 750 µl Lysis buffer Ủ ở nhiệt độ 650C trong 1giờ 30 phút

- Cho thêm 500 µl hỗn hợp Phenol:Chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), lắc nhẹ dung dịch có màu trắng đục

- Ly tâm 12000 rpm/10 ph/100C, hút pha trên cho vào một eppendorf mới

- Thêm 500 µl hỗn hợp Phenol:Chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), lắc nhẹ

- Ly tâm 12000 rpm/10 ph/100C, hút pha trên cho vào một eppendorf mới

- Cho Isopropanol vào theo tỷ lệ 2:1, dung dịch xuất hiện kết tủa

- Ly tâm 12000 rmp/5 ph/100C, thu nhận DNA cô đặc có màu trắng đục ở đáy eppendorf Rửa mẫu nhiều lần bằng ethanol 70% Tiếp tục hong khô mẫu

- Pha loãng mẫu với TE 0.5 X hay nước cất 2 lần vô trùng Mẫu ly trích được bảo quản 40C

Kiểm tra sự có mặt và độ tinh sạch của DNA bằng cách điện di trên gel agarose 1% Sản phẩm ly trích DNA được chạy điện di trong dung dịch TAE và chạy 60V/30 phút/250mA Sau đó, miếng gel được nhuộm Ethidium Bromide trước khi đọc

kết quả trên máy Geldoc

DNA tổng số thu được phải được pha loãng ở nồng độ thích hợp để tiến hành phản ứng PCR Nồng độ DNA chạy phản ứng PCR nằm trong khoảng 3ng-100ng tùy thuộc mẫu DNA

3.3.3 Phản ứng PCR

Hóa chất cần pha cho phản ứng PCR:

- dNTPs, hai primer ITS4 và ITS5

- DNA mẫu sao cho lượng DNA < 100ng/μl

- Nhiệt độ bắt cặp Tm = 2*(A+T) + 4*(G+C)

- Trình tự cặp primer chạy PCR lần lượt là:

ITS4 (5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’) ITS5 (5’ GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3’)

Primer ITS4 100 pmol/ μl 10 pmol/ μl 1 μl

Primer ITS5 100 pmol/ μl 10 pmol/ μl 1 μl

Taq DNA polymerase 5 UI 0,5 UI 0,25 μl

Bảng 3.3 Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR

- Điều kiện chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR 50V/40 phút/ 250mA Sau đó

nhuộm gel và chụp hình bằng máy Geldoc

3.4 Phương pháp xử lý số liệu

3.4.1 Xử lý trình tự

Sử dụng phần mềm Chromas 145-95 để xử lý trình tự

Phần mềm BLAST để so sánh trình tự với các loài nấm Phytophthora đã được

giải trình tự trên ngân hàng gen.( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

3.4.2 Vẽ cây phát sinh loài

Phần mềm CluxtalX 1.83 để so sánh độ tương đồng của trình tự và vẽ cây sinh

loài bằng phần mềm Treeview 1.6

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Quá trình tăng sinh, nhân sinh khối

Sau quá trình tăng sinh và nhân sinh khối 9 mẫu nấm trên môi trường cà rốt, chúng tôi rút ra một số nhận xét như sau:

- Tất cả các mẫu nấm đều phát triển tốt trong điều kiện ánh sáng tối, yên tĩnh

- Nhiệt độ thích hợp cho sự tăng sinh là 220C – 280C

- Thời gian nhân sinh khối tùy theo từng mẫu

4.2 Kết quả ly trích DNA tổng số Phytophthora

Qui trình ly trích DNA tổng số là một qui trình khởi đầu rất quan trọng cho các

kỹ thuật sinh học phân tử và là yếu tố quan trọng hàng đầu qyết định sự thành công cho phản ứng PCR và kỹ thuật giải trình tự của chúng tôi sau này Do đó nó đóng vai trò thu nhận sản phẩm DNA cho những phản ứng tiếp theo gồm phản ứng PCR và kỹ thuật giải trình tự Chúng tôi đã tham khảo quy trình của Lee và Taylor (1990), sau đó

cải tiến thêm một số bước cho phù hợp với nấm Phytophthora

Quy trình ly trích DNA này tương đối đơn giản nhưng vẫn thu được lượng DNA có độ tinh sạch cao Do trong qui trình ly trích này, mẫu được nghiền trong Nitơ lỏng đến khi thật mịn để các tế bào tách rời nhau ra nhưng không phá vỡ thành tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho Lysis buffer phá hủy thành tế bào Đồng thời, việc sử dụng phenol/ chloroform/ isoamylalcohol (25:24:1) hai lần giúp tủa protein và loại bỏ hết protein, polysaccharide, lipid, RNA có trong mẫu DNA Áp dụng qui trình ly trích này, điện di 60V/ 30 phút/250 mA sản phẩm trên gel agarose 1% Chúng tôi thu được kết quả ly trích DNA tổng số ở hình 4.1

Quy trình ly trích này loại bỏ hầu hết những phần tạp nhiễm nhưng vẫn không ảnh hưởng đến chất lượng DNA Như vây đã ly trích thành công DNA tổng số của

nấm Phytophthora Dựa vào band DNA thu nhận từ kết quả điện di DNA tổng số nấm

Phytophthora được ly trích, tiến hành pha loãng DNA tổng số đến nồng độ thích hợp

để thực hiện phản ứng PCR