KHẢO SÁT CÁC ĐẶC ĐIỂM CỦA Clostridium perfringens PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT CÁC ĐẶC ĐIỂM CỦA Clostridium perfringens PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2004 – 2008 Sinh viên thực hiện: PHAN THỊ KIỀU TRINH Tháng 9/2008 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT CÁC ĐẶC ĐIỂM CỦA Clostridium perfringens PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM Giáo viên hướng dẫn: Ths NGUYỄN TIẾN DŨNG CN PHẠM THỊ PHƯƠNG UYÊN Tháng 9/2008 Sinh viên thực hiện: PHAN THỊ KIỀU TRINH LỜI CẢM ƠN  Xin gởi lời biết ơn sâu sắc đến ba mẹ thành viên gia đình ln quan tâm động viên cổ vũ cho suốt thời gian học tập thực khoá luận  Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, tất Quý Thầy Cô truyền đạt kiến thức cho em suốt thời gian học tập trường  Xin gởi lời cám ơn chân thành đến Thạc sỹ Nguyễn Tiến Dũng Cử nhân Phạm Thị Phương Uyên tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em thực khoá luận  Xin cám ơn anh Lẫm (trưởng phòng vi sinh I5), thầy cô anh chị cán nghiên cứu Trung tâm phân tích trường Đại học Nơng Lâm tận tình giúp đỡ, hỗ trợ em mặt sở vật chất mặt kỹ thuật  Xin cám ơn bạn Hồng Loan, Vân Kiều, Quế Mai Hoa sát cánh tơi tồn khố luận  Xin cám ơn tất bạn lớp Công nghệ sinh học 30 chia sẻ vui buồn hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ góp ý cho tơi suốt thời gian học tập Sinh viên thực Phan Thị Kiều Trinh iii TÓM TẮT Phan Thị Kiều Trinh, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Đề tài nghiên cứu: Khảo sát đặc điểm chủng Clostridium perfringens phân lập từ thực phẩm Đề tài thực phịng thí nghiệm vi sinh, môn Công nghệ sinh học, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh từ tháng 4/2008 đến tháng 8/2008 Giáo viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Tiến Dũng CN: Phạm Thị Phương Uyên Nội dung nghiên cứu: Khảo sát đặc điểm chủng Clostridium perfringens phân lập từ mẫu thực phẩm Khảo sát tỷ lệ biểu enzym: acid phosphatase β -galactosidase chủng Clostridium perfringens phân lập Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến biểu enzym acid phosphatase β – galactosidase Kết quả: C perfringens phân lập từ thực phẩm ổn định đặc điểm: tế bào hình que; bào tử hình trứng; khuẩn lạc thạch TSC tròn đen; làm tan máu, không di động lên men lactose Các đặc điểm thay đổi: kích thước khuẩn lạc thạch TSC; khả khử nitrate thủy giải gelatin Cả chủng C perfringens phân lập từ thực phẩm có biểu ổn định hoạt tính enzym β-galactosidase acid phosphatase Các yếu tố ảnh hưởng, làm chậm biểu hoạt tính enzym β-galactosidase acid phosphatase gồm: mẫu thực phẩm (cá khô nước mắm pha), nhiệt độ nuôi ủ (340C) iv SUMMARY PHAN THI KIEU TRINH, Nong Lam University of Ho Chi Minh City Graduating thesis topic “Investigating the characters of the Clostridium perfringens isolated from food”, carried out at the laboratory of Microbiology of Department of Biotechnology, Nong Lam University, from April 2008 to August 2008 Supervisor: Master of Microbiology: Nguyen Tien Dung Bachelor of science: Pham Thi Phuong Uyen Contents: Investigating the characters of the C perfringens isolated from food Investigating the ratio of expression the activities of enzyms β- galactosidase and acid phosphatase Investigating the factors, have delayed the expression of enzyms β- galactosidase and acid phosphatase Results: Several properties of investigated C perfringens are stable such as: rod shape, ovoid spore, round and black colony, haemolysis, non- motility and lactose fermentation Some changeable properties such as size of colony on TSC agar, nitrate reduction and gelatin liquefaction All investigated C perfringens express the activities of enzyms β- galactosidase and acid phosphatase stabely Some factors delayed the expression of enzyms are matrices and incubation temperature (34oC) v MỤC LỤC TRANG LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT iv SUMMARY v MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ ix DANH SÁCH CÁC BẢNG x Chương 1- MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích ý nghĩa 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Ý nghĩa 1.3 Nội dung nghiên cứu Chương 2- TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đại cương Clostridium perfringens 2.1.1 Lịch sử phát Clostridium perfringens 2.1.2 Tình hình lịch sử gây bệnh Clostridium perfringens 2.1.3 Định nghĩa 2.1.4 Phân loại Clostridium perfringens 2.1.5 Đặc điểm sinh học 2.1.6 Phân bố 2.1.7 Các loại độc tố Clostridium perfringens 2.1.8 Biểu lâm sàng nhiễm Clostridium perfringens 2.1.9 Tiêu chuẩn Clostridium perfringens thực phẩm 2.2 Cơ chế chuyển hoá vật chất 2.2.1 Cơ chế lên men lactose 2.2.2 Cơ chế thuỷ giải gelatin 11 2.2.3 Cơ chế khử nitrate thành nitrite 12 2.3 Sự biểu enzym acid phosphatase β-galactosidase C perfringens 14 vi 2.3.1 Enzym acid phosphatase 14 2.3.2 Enzym β – galactosidase 16 2.4 Các nghiên cứu ứng dụng biểu enzym việc chẩn đoán Clostridium perfringens 17 Chương 3- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18 3.1 Thời gian địa điểm 18 3.2 Vật liệu 18 3.2.1 Nguyên vật liệu 18 3.2.2 Thiết bị dụng cụ 18 3.2.3 Hố chất mơi trường 18 3.3 Phương pháp nghiên cứu 19 3.3.1 Phương pháp nhuộm Gram 19 3.3.2 Phương pháp nhuộm bào tử 21 3.3.3 Phương pháp thực thử nghiệm sinh hoá 21 3.3.4 Phương pháp đổ đĩa đếm khuẩn lạc 22 3.3.5 Quy trình thử nghiệm biểu enzym acid phosphatase β – galactosidase 24 3.3.6 Phương pháp gây nhiễm chủng vào mẫu thực phẩm 25 3.3.7 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến biểu enzym 27 Chương 4- KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 29 4.1 Kết khảo sát đặc điểm chủng Clostridium perfringens phân lập từ mẫu thực phẩm 29 4.2 Kết khảo sát tỷ lệ biểu enzym: acid phosphatase β - galactosidase chủng Clostridium perfringens phân lập 36 4.3 Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến biểu enzym β-galactosidase acid phosphatase 39 Chương 5- KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43 5.1 Kết luận 43 5.2 Đề nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT PCR Polymerase chain reaction ELISA Enzym- Linked Immuno sorbent Assay UV Ultra- violet TSC Tryptose Sulphite Cycloserine Agar 4- MUP methyl umbelliferyl phosphate ONPG o-nitrophenyl-D-galactopyranoside ONP o-nitrophenol BHI Brain Heart Infusion SPW Saline Pepton Water NMM Buffered nitrate motility medium LGM Lactose gelatin medium viii DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ HÌNH Hình 2.1 TRANG Hình dạng vi khuẩn Clostridium perfringens Hình 2.2 Hình dạng vị trí bào tử Clostridium perfringens tế bào Hình 2.3 Hình dạng khuẩn lạc C perfringens mơi trường thạch Hình 2.4 Thử nghiệm lên men lactose 11 Hình 2.5 Cấu trúc phân tử gelatin 11 Hình 2.6 Thử nghiệm gelatin 12 Hình 2.7 Thử nghiệm nitrate 13 Hình 3.1 Quy trình nhuộm Gram 20 Hình 4.1 Khuẩn lạc chủng C perfringens môi trường thạch TSC 34 Hình 4.2 Hiện tượng tan máu chủng C perfringens 34 Hình 4.3 Ảnh nhuộm Gram tế bào chủng C perfringens 35 Hình 4.4 Bào tử Clostridium perfringens vật kính 100 X kính hiển vi quang học 35 Hình 4.5 Phản ứng ONPG dương tính 38 Hình 4.6 Phản ứng MUP dương tính 38 SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1 Quy trình khảo sát đặc điểm sinh hóa C perfringens 23 Sơ đồ 3.2 Quy trình gây nhiễm chủng vào thực phẩm 26 Sơ đồ 3.3 Quy trình khảo sát biểu enzym mẫu thực phẩm nhiệt độ thời gian khác 28 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1 Số trường hợp ngộ độc tử vong C perfringens Mỹ Bảng 2.2 Tỉ lệ Clostridium perfringens nhiễm loại thực phẩm khác Bảng 2.3 Các loại độc tố dòng C perfringens Bảng 2.4 Các bệnh độc tố gây Bảng 2.5 Giới hạn cho phép C perfringens thực phẩm Bảng 2.6 Biểu enzym phosphatase chủng vi khuẩn giá trị pH khác 15 Bảng 4.1 Kết khảo sát hình dạng đặc điểm sinh hoá chủng Clostridium perfringens 31 Bảng 4.2 Kết khảo sát biểu enzym β- galactosidase acid phosphatase 37 Bảng 4.3 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian nhiệt độ nuôi cấy lên biểu enzym β-galactosidase acid phosphatase nuôi cấy mẫu cá khô vàng 40 Bảng 4.4 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian nhiệt độ nuôi cấy lên biểu enzym β-galactosidase acid phosphatase nuôi cấy mẫu nước mắm 41 x ... nghiên cứu: Khảo sát đặc điểm chủng Clostridium perfringens phân lập từ mẫu thực phẩm Khảo sát tỷ lệ biểu enzym: acid phosphatase β -galactosidase chủng Clostridium perfringens phân lập Khảo sát yếu... ? ?Khảo sát đặc điểm chủng Clostridium perfringens phân lập từ thực phẩm? ?? 1.2 Mục đích ý nghĩa 1.2.1 Mục đích Khảo sát biến động đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng C perfringens phân lập. .. phương pháp phân tích nhanh C perfringens thực phẩm theo đề xuất Adcock Saint, 2001 1.3 Nội dung nghiên cứu  Khảo sát đặc điểm chủng Clostridium perfringens phân lập từ mẫu thực phẩm  Khảo sát tỷ