Thẩm định phương pháp chuẩn độ thể tích

Tính đặc hiệuLà khả năng của phương pháp có thể xác định chính xác chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác có thể có trong mẫu thử các tạp chất, sản phẩm phân huỷ, chất nền .

THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP

CHUẨN ĐỘ THỂ TÍCH

THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP

Định nghĩa:

Thẩm định (validation) là quá trình triển khai toàn bộ công việc của quy trình phân tích để chứng minh phương pháp phân tích đủ chính xác, đủ độ tin cậy và đáp ứng mục đích sử

dụng đã dự kiến.

Khi nào tiến hành TĐQTPT:

• Công việc thẩm định phải được tiến hành

trước khi sử dụng một phương pháp mới vào công việc phân tích hàng ngày.

• Ngoài ra việc tái thẩm định quy trình phân

tích cũng cần được xem xét trong các trường hợp:

• Do có thay đổi trong quá trình tổng hợp hoạt

chất.

• Do có thay đổi trong thành phần của thuốc.

• Do có thay đổi trong quy trình phân tích:

Thay đổi nhà cung cấp các thuốc thử quan trọng, thay đổi về trang thiết bị: Thay thế

thiết bị phân tích chính (VD: máy HPLC).

- Tính toàn vẹn của mẫu.

- Thiết bị được hiệu chuẩn theo định kỳ.

- Cán bộ phân tích đủ năng lực:

Các chỉ tiêu đặc trưng cho thẩm định quy trình phân tích:

- Giới hạn phát hiện (limit of detection - LOD).

- Giới hạn định lượng (limit of quantitation -

LOQ).

Tính đặc hiệu

Là khả năng của phương pháp có thể xác

định chính xác chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác có thể có trong mẫu thử (các tạp chất, sản phẩm phân huỷ, chất

nền ) Một quy trình phân tích thiếu tính

đặc hiệu có thể được bổ trợ bằng cách tiến hành thêm quy trình phân tích khác.

Độ tuyến tính

Độ tuyến tính của một phương pháp

phân tích nhằm đánh giá sự phụ thuộc tuyến tính giữa kết quả đo được (trong một khoảng đo xác định) với nồng độ

chất phân tích có trong mẫu thử Độ

tuyến tính được đánh giá bằng cách

quan sát đồ thị đáp ứng giữa nồng độ và hàm lượng của chất phân tích.

tuyến tính.

Độ đúng

Độ đúng là giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích với giá trị thực của mẫu đã biết

Độ chính xác

Độ chính xác là mức độ chụm giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại quy trình phân tích nhiều lần trên cùng một mẫu thử đồng nhất

Độ chính xác bao gồm độ lặp lại, độ chính xác trung gian, độ tái lặp.

LOD - LOQ

- LOD: là nồng độ thấp nhất của hoạt chất

cần phân tích có trong mẫu mà phương pháp phân tích có thể phát hiện được.

- LOQ: là lượng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử để có thể định lượng được với

độ đúng và độ chính xác thích hợp.

PHƯƠNG PHÁP CHUẨN ĐỘ THỂ TÍCH

Khái niệm

• Kỹ thuật sử dụng dung dịch của một chất

phản ứng (dung dịch chuẩn độ) thêm vào

một dung dịch của chất phản ứng thứ hai

(chất phân tích) cho tới khi xác lập được

điểm tương đương

• Vì việc đo thể tích đóng vai trò chủ yếu nên

phương pháp này còn được gọi là chuẩn độ thể tích.

Khái niệm (tiếp)

• Điểm tương đương được xác định bằng các

phương pháp sau:

- Nhận biết điểm chuyển màu của dung dịch (nếu một trong hai chất chuẩn độ hay chất phân tích có màu).

- Dùng chỉ thị chuyển màu.

- Xác định từ đường cong chuẩn độ (dùng kỹ thuật đo điện thế, đo ampe…).

Khái niệm (tiếp)

Các phương pháp chuẩn độ

thể tích thông dụng

Phân loại theo phản ứng hóa học:

• Chuẩn độ acid – base

• Chuẩn độ oxy hóa – khử

• Chuẩn độ tạo phức

• Chuẩn độ kết tủa

Các phương pháp chuẩn độ

thể tích thông dụng (tiếp)

Phân loại theo các phương pháp xác

định điểm tương đương:

Một số điểm lưu ý đối với

• Chuyên luận bao gồm phép thử thích hợp để

định lượng tạp chất liên quan (tạp hữu cơ)

(VD: định lượng tạp chất liên quan bằng

phương pháp HPLC).

Một số điểm lưu ý đối với chuẩn độ thể tích (tiếp)

Các nguyên nhân gây ra sai số trong phép chuẩn độ thể tích

Chất gốc Không phù hợp, không tinh khiết, ẩm, không đồng nhất, chất

lượng không đảm bảo, nhiễm tạp (CO2, O2) Cân Cân không chính xác, độ ẩm môi trường quá cao hay quá thấp,

thao tác không đúng Cốc chuẩn độ Nhiễm bẩn, dùng cốc chuẩn độ không phù hợp.

Buret Đầu nối bị hở, buret bị ăn mòn, pitông bị rò, có bọt khí trong hệ

thống ống dẫn, khóa ba chiều bị hở.

Mẫu Tá dược hay tạp chất ảnh hưởng tới phép chuẩn độ

Phản ứng động học Quá chậm

Dung môi Không tinh khiết, khả năng hòa tan hoạt chất kém, không bền,

nhiễm tạp (CO2, O2), pH hay sức ion không phù hợp Dung dịch chuẩn độ Không tinh khiết, bị phân hủy, nhiễm tạp (O2), độ nhạy kém,

pH hay sức ion không phù hợp, nồng độ quá cao hay quá thấp

Các nguyên nhân gây ra sai số trong phép chuẩn độ thể tích

Dụng cụ đo Sensor không phù hợp, điện cực bị nhiễm tạp, mất kết nối với

detector, nắp cáp nối không đúng vị trí, vị trí buret và đầu điện cực không phù hợp, thời gian đáp ứng của điện cực quá lâu, quá trình rửa điện cực và que khuấy giữa các lần chuẩn độ không phù hợp

Các thông số

chuẩn độ Thông số định lượng không thích hợp, các thông số chuẩn độ đặt sai, tốc độ chuẩn độ quá lâu hay quá nhanh, cách đánh giá

điểm tương đương không thích hợp

Nhiệt độ Nhiệt độ dao động, đặc biệt khi chuẩn độ với dung môi hữu cơ,

phản ứng định lượng có sinh nhiệt hay thu nhiệt nhiều Môi trường Điều kiện môi trường không ổn định, thay đổi bất lợi

(ẩm, nhiệt, ánh sáng)

Các nguyên nhân gây ra sai số trong phép chuẩn độ thể tích

• Phương pháp chuẩn độ thể tích bằng cách

quan sát (visual titration):

- Sai số do chỉ thị: Sự sai khác giữa điểm

tương đương và điểm kết thúc của phép

chuẩn độ.

- Sai số do thao tác: Cần chú ý đến động tác

“vi chỉnh” khi gần đến điểm tương đương.

Giảm thiểu rủi ro trong chuẩn độ

• Dung dịch chuẩn độ:

- Sử dụng hóa chất tinh khiết

- Mua chất chuẩn có chất lượng cao từ nhà cung cấp đáng tin cậy

- Chuẩn bị mẫu theo hướng dẫn, sử dụng

đúng thiết bị (cân, cốc chuẩn độ)

Giảm thiểu rủi ro trong chuẩn độ

(tiếp)

• Bảo quản dung dịch chuẩn độ:

- Tránh ánh sáng mặt trời, trong nhiệt độ ổn định

- Chống lại sự xâm nhập của độ ẩm/CO2,

bằng silicagel/chất hấp thu CO2

- Lưu lại thời gian tối đa của dung dịch chuẩn

độ trực tiếp trên con chip của burret -> bắt

buộc phải thay khi hết hạn

Giảm thiểu rủi ro trong chuẩn độ

(tiếp)

• Điện cực:

- Thay chất điện giải ít nhất 3 tháng / lần

(không châm thêm do làm tăng nồng độ chất điện giải), SD chất điện giải có độ tinh khiết cao

- Đảm bảo mức chất điện giải luôn cao hơn

mức của mẫu

- Không chùi mạnh điện cực với khăn giấy (gây tích điện)

- Vệ sinh điện cực sau khi sử dụng

- Điện cực pH: Không để khô; luôn đóng nắp tại vị trí châm chất điện giải khi không sử

dụng

THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP

CHUẨN ĐỘ THỂ TÍCH

Nguyên liệu

Tính đặc hiệu/chọn lọc

- Tính đặc hiệu kém

- Được bổ trợ thêm bằng các quy trình phân tích khác như định tính, thử tạp chất hoặc so sánh với một quy trình định lượng đặc hiệu

đã được thẩm định.

Tính đặc hiệu/chọn lọc (tiếp)

• Ví dụ: Thẩm định quy trình định lượng Magnesi

trong Esomeprazol magnesi:

- Phân hủy cưỡng bức trong HCl 0,1M / NaOH 0,1M -> định lượng theo quy trình -> so sánh kết quả định lượng với kết quả định lượng ban đầu (khi chưa tiến hành phân hủy)

- Phân tích một hoạt chất có cấu trúc tương tự (Omeprazol natri) theo quy trình -> không có đáp ứng

Tính đặc hiệu/chọn lọc (tiếp)

giữa các chất trong phản ứng cũng có thể biểu thị một phần tính đặc hiệu của phương pháp

Ví dụ: các bước chuyển màu của chỉ thị trong phép chuẩn độ hỗn hợp NaHCO3 và

Na2CO3 bằng dung dịch HCl

Độ tuyến tính

• PP mới: ít nhất 7 mức khối lượng

(bao gồm ít nhất 80 – 120% khối lượng

định lượng dự kiến; V dung dịch chuẩn độ trong khoảng 20 % - 90 % thể tích buret)

• Thông thường: ít nhất 5 mức khối lượng

Độ tuyến tính (tiếp)

• Phương trình hồi qui y = ax + b

y: thể tích dung dịch chuẩn độ tiêu thụ (ml) x: khối lượng chất chuẩn (g; mg) (hoặc thể tích dung dịch chuẩn gốc (ml))

• Vẽ đồ thị biểu diễn số dư (residual plot) Các

điểm này phải phân bố đều về hai phía của

trục x (trục biểu diễn hàm lượng hay nồng độ mẫu thử).

Độ đúng

• Phân tích trên mẫu chuẩn đã biết rõ hàm

lượng: so sánh kết quả với nồng độ/ hàm lượng lý thuyết đã biết.

• So sánh với kết quả thu được từ quy trình đã

được công nhận (ví dụ: HPLC…).

Giá trị trung bình của các tập hợp phải khác nhau không có ý nghĩa thống kê.

Độ đúng (tiếp)

• Thực hiện tại ít nhất 03 mức nồng độ Tại mỗi

mức, thực hiện ít nhất 03 mẫu độc lập.

• Thực hiện tại ít nhất 06 mẫu tương ứng với

100 % lượng cân lý thuyết

Độ lặp lại

• Dựa trên kết quả của độ đúng

• Tiến hành trên ít nhất 6 mẫu độc lập có nồng

độ tương ứng với 100 % giá trị định lượng.

Độ chính xác trung gian

• Thực hiện như qui trình phân tích đã xây

dựng nhưng tiến hành khác ngày, kiểm

nghiệm viên, thiết bị phân tích.

• So sánh độ chính xác giữa dãy kết quả của

hai ngày phân tích bằng phương pháp thống

kê

Độ tái lặp

• Thực hiện như qui trình phân tích đã xây

dựng nhưng tiến hành khác phòng thí

nghiệm

• Được sử dụng khi xây dựng các chuyên luận

dược điển, chuyển giao phương pháp

• Không bắt buộc khi đã thực hiện nghiên cứu

độ chính xác trung gian.

Yêu cầu về độ lặp lại - độ đúng

TT Phương pháp Giới hạn hàm lượng (%) Độ lặp lại RSD (%) Độ đúng tương đối (%)

2 Môi trường khan ± 1,0 0,33 ± 0,67

3 Liên hợp acid base ± 1,0 0,33 ± 0,67

Độ chắc chắn của phương pháp

Khảo sát khi thay đổi các yếu tố:

- Thiết bị (điện cực, máy chuẩn độ,

- Các điều kiện bảo quản dung dịch chuẩn

Thành phẩm

Tính đặc hiệu

• Tiến hành trên mẫu placebo: Đáp ứng (V ml)

của mẫu placebo không lớn hơn 1 % so với thể tích dự kiến tại điểm tương đương

Độ tuyến tính

• Thực hiện trên mẫu nguyên liệu hoặc mẫu tự

tạo (nguyên liệu trộn với tá dược)

• Ít nhất ở 5 mức khối lượng, bao gồm ít nhất

khoảng 80 – 120% lượng định lượng và thể tích dung dịch chuẩn độ tại điểm tương

đương đạt trong khoảng 20 % đến 90% thể tích buret

• Vẽ đồ thị biểu diễn số dư (residual plot) Các

điểm này phải phân bố đều về hai phía của

trục x (trục biểu diễn hàm lượng hay nồng độ mẫu thử).

Độ tuyến tính (tiếp)

Độ tuyến tính (tiếp)

Độ đúng

• Mẫu tự tạo: Thêm một lượng hoạt chất đã

biết vào mẫu placebo (chứa tất cả các thành phần của công thức bào chế trừ hoạt chất

cần phân tích)

Thực hiện tối thiểu ở 3 mức khối lượng (từ

80% - 120% lượng cân qui định, hoặc 70% - 130% đối với ĐĐHL), mỗi mức 3 lần riêng biệt

Độ đúng (tiếp)

• Không có mẫu tự tạo: Thêm một lượng đã

biết của chất cần phân tích (tương ứng với

10 %; 20 %; 30 % lượng hoạt chất cần định lượng)

Thực hiện tối thiểu ở 3 mức khối lượng, mỗi mức tiến hành 3 lần riêng biệt

HC có sẵn Tổng lượng thêm vào phải nằm trong khoảng tuyến tính

Độ đúng (tiếp)

• Áp dụng qui trình phân tích xác định lượng

hoạt chất thu hồi -> tính % thu hồi:

% thu hồi = M tt / M lt x100

• Yêu cầu: 98,0 % - 102,0 %

RSD ≤ 2,0 %

Độ lặp lại

• Tiến hành trên mẫu thực và đồng nhất.

• Hoặc tiến hành trên mẫu tự tạo

Độ lặp lại

• Tiến hành định lượng 6 lần trên mẫu chế

phẩm đã được làm đồng nhất ở khối lượng hoạt chất 100 % (hoặc 3 mức khối lượng x 3 lần)

Tính RSD % của các kết quả thu được.

Yêu cầu: RSD ≤ 2,0 %

Độ chính xác trung gian

• Thực nghiệm tối thiểu 6 lần trên mẫu thử với

các điều kiện thay đổi (kiểm nghiệm viên,

thiết bị, ngày tiến hành).

Độ tái lặp

• Thực hiện như qui trình phân tích đã xây

dựng nhưng tiến hành khác phòng thí

nghiệm

• Được sử dụng khi xây dựng các chuyên luận

dược điển, chuyển giao phương pháp

• Không bắt buộc khi đã thực hiện nghiên cứu

độ chính xác trung gian

Độ chắc chắn của phương pháp

Khảo sát khi thay đổi các yếu tố:

- Thiết bị (điện cực, máy chuẩn độ,

- Các điều kiện bảo quản dung dịch chuẩn

LOD - LOQ

- Dựa vào quan sát (phân tích mẫu đã biết

nồng độ và xác định nồng độ tối thiểu có thể quan sát được đáp ứng)

- Dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu (áp dụng

cho phương pháp phân tích có nhiễu đường nền)

- Dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ

dốc.

LOD - LOQ (tiếp)

Cách tính LOD, LOQ dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc:

LOD = 3.3 S/a; LOQ = 10 S/a

- S: Độ lệch chuẩn của đáp ứng (xác định trên

mẫu trắng/placebo, đo đáp ứng đường nền và

Tài liệu tham khảo

Analytical Methods.

Edited by Joachim Ermer John H McB Miller

Copy right © 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH

&Co.KGaA, Weinhein.

brochure 16, Mettler Toledo.

Methodology – ICH Q2(R1).

European Directorate for the Quantity of Medicine

& HealthCare 7th Edition- 2015.

Điện thoại : 0983099011

Địa chỉ email: vanhiep261074@yahoo.com.vn