BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI CHẾ BIẾN CAO SU CỦA VI KHUẨN Bacillus subtilis

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TPHCM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI CHẾ BIẾN CAO SU CỦA VI KHUẨN Bacillus subtilis Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : ĐỒN THỊ HIẾU THẢO Niên khóa : 2008-2012 Tháng 7/2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TPHCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI CHẾ BIẾN CAO SU CỦA VI KHUẨN Bacillus subtilis Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực PGS.TS LÊ ĐÌNH ĐƠN ĐỒN THỊ HIẾU THẢO ThS TRẦN THỊ VÂN Tháng 7/2012 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, Bộ môn Công nghệ Sinh học, tất qúy thầy cô truyền đạt kiến thức kinh nghiệm cho tơi suốt q trình học trường PGS.TS Lê Đình Đơn giúp đỡ, tạo điều kiện để tơi thực tốt khóa luận tốt nghiệp Th.S Trần Thị Vân tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tơi suốt thời gian thực tập hồn thành tốt khố luận Các bạn lớp DH08SH bên tôi, giúp đỡ, động viên, chia sẻ thời gian thực tập suốt năm học vừa qua Cha mẹ, bậc sinh thành sinh nuôi dưỡng tơi, anh chị em gia đình ln quan tâm, ủng hộ tơi học tập hồn thành khố luận tốt nghiệp Sinh viên thực Đồn Thị Hiếu Thảo i TÓM TẮT Nước thải cao su thuộc loại gây ô nhiễm nghiêm trọng chứa hàm lượng chất hữu cao, đồng thời gây mùi thối (sinh H2S mercaptan) có phân hủy yếm khí ảnh hưởng đến hệ sinh thái thủy sinh vật, nguồn tiếp nhận, môi trường sống người Để hạn chế ô nhiễm loại nước thải này, phải dựa vào hoạt động phân hủy chất hữu vi sinh vật tự nhiên Vì đề tài “Bước đầu đánh giá khả xử lý nước thải chế biến cao su vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập phòng thí nghiệm” thực phòng thí nghiệm Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học Môi trường Trường Đại học Nông Lâm TPHCM Đối tượng nghiên cứu chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ mẫu đất nước thải thuộc Công ty cao su Eah’leo, Cơng ty cao su Bình Long, hồ nước thải sinh hoạt đường 17 – phường Linh Trung, quận Thủ Đức Phương pháp tiến hành sau: dòng vi khuẩn Bacillus sp từ mẫu đất, mẫu nước thải khác phân lập dựa vào hình thái khuẩn lạc Thử phản ứng sinh hóa để khẳng định chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Sau tiến hành khảo sát khả xử lý nước thải chế biến cao su chủng Bacillus subtils phân lập Sau phân lập thu chủng vi khuẩn có hình thái khuẩn lạc giống với Bacillus sp Thử phản ứng sinh hóa khẳng định có chủng Bacillus subtilis Trong chủng vi khuẩn Bacillus subtilis cho khảo sát khả xử lý nước thải cao su chủng D3 có khả xử lý tốt điều kiện hiếu khí với hiệu suất xử lý là: COD đạt 89,03%, BOD đạt 91,45%, SS đạt 79,06% ii SUMMARY Wastewater from rubber processing contaminants serious contains high concentrations of organic matter, and cause bad odors (H2S and mercaptan) after anaerobic decomposition that affects aquatic ecosystem organisms, receiving water, and human habitat The active organic matter decomposition of natural microorganisms could be applie to limit contamination for this kind of wastewater So the project "Initial assessment of treatment wastewater capacity from rubber processing factory of Bacillus subtilis, which were isolated in the laboratory" was carried in the laboratory of the Institute Research Environmental and Biotechnology of Nong Lam University Researched objects were Bacillus subtilis strains isolated from soil and waste water of Eah’leo rubber company, Binh Long rubber Company and Reservoir of domestic waste water in Street 17 – Linh Trung Commune – Thu Đuc District Method is executed as follows: seven strains of Bacillus subtilis were collected from soil and wastewater Six Bacillus subtilis strains were confirmed by biochemical reactions test, then all of isolated strains were tested for the capacity of wastewater treatment with the wastewater from rubber processing factory After isolating, seven strains of bacteria that colonies’s form similar to Bacillus sp were collected To try the biochemical reactions it is confirmed that six strains are Bacillus subtilis In the six strains of Bacillus subtilis to a survey of wastewater treatment capacity rubber is D3 strain has the best capabilities in aerobic conditions, with processor performance is 89.03% COD, 91.45% BOD, 79.06% SS iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH CÁC BẢNG viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan nước thải cao su 2.1.1 Nguồn gốc nước thải chế biến cao su 2.1.2 Tính chất nước thải cao su 2.1.3 Mức độ ô nhiễm nước thải chế biến mủ cao su 2.1.4.2 Công nghệ xử lý nước thải chế biến cao su giới 2.1.4.2 Công nghệ xử lý nước thải cao su nước 2.2 Sơ lược vi khuẩn Bacillus subtilis 11 2.2.1 Đặc điểm chung giống Bacillus 11 2.2.2 Một số đặc điểm Bacillus subtilis 12 2.2.2.1 Lịch sử phát 12 2.2.2.2 Đặc điểm phân loại 13 2.2.2.3 Đặc điểm phân bố 13 2.2.2.4 Đặc điểm hình thái 13 2.2.2.5 Đặc điểm nuôi cấy 14 2.2.2.6 Đặc điểm sinh hóa 14 2.2.3 Bào tử khả tạo bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 14 iv 2.2.3.1 Cấu tạo bào tử 14 2.2.3.2 Khả tạo bào tử 16 Tính đối kháng Bacillus subtilis 16 2.2.4 2.2.4.1 Với vi sinh vật gây bệnh 16 2.2.4.2 Với đồng loại 16 Độc tính Bacillus subtilis 17 2.2.5 2.2.5.1 Đối với người 17 2.2.5.2 Đối với động vật 17 2.2.5.3 Đối với thực vật 18 2.2.5.4 Đối với vi sinh vật 18 Một số ứng dụng Bacillus subtilis 18 2.2.6 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 20 3.1 Thời gian địa điểm thực 20 3.2 Đối tượng khảo sát 20 3.3 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 20 3.4 Môi trường nuôi cấy 20 3.5 Nội dung nghiên cứu 20 3.6 Phương pháp nghiên cứu 21 3.6.1 Thu thập mẫu phân lập chủng Bacillus subtilis 21 3.6.1.1 Cách lấy mẫu để phân lập vi khuẩn 21 3.6.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis 21 3.6.2 Khảo sát đặc điểm sinh hóa vi khuẩn 22 3.6.3 Đánh giá khả xử lý nước thải cao su dòng Bacillus subtilis 22 3.6.3.1 Bố trí thí nghiệm 22 3.6.3.2 Phương pháp phân tích tiêu 23 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Kết phân lập Bacillus subtilis 25 4.1.1 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ Bacillus subtilis 25 4.1.2 Đặc điểm hình thái vi khuẩn nghi ngờ Bacillus subtilis 26 4.1.3 Khảo sát đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập 26 v 4.2 Kết xử lý nước thải chủng vi khuẩn phân lập 27 4.2.1 Kết phân tích tiêu sau 20 ngày thí nghiệm 27 4.2.1.1 Kết đánh giá màu mùi 27 4.2.1.2 Kết khảo sát tiêu pH 29 4.2.1.3 Kết khảo sát tiêu BOD 30 4.2.1.4 Kết khảo sát tiêu COD 31 4.2.1.5 Kết khảo sát tiêu SS 32 4.2.2 So sánh hiệu suất xử lý chủng vi khuẩn hai điều kiện hiếu khí yếm khí sau 20 ngày làm thí nghiệm 33 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34 5.1 Kết luận 34 5.2 Đề nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 PHỤ LỤC 38 vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT TP Tổng hàm lượng phospho COD Chemical Oxygen Demand BOD Biochemical oxygen Demand DO Hàm lượng oxygen hòa tan SS Suspended Solids MLVSS Mixed Liquor Volatile Suspended Solid B subtillis Bacillus subtilis B licheniformis Bacillus licheniformis B pumilis Bacillus pumilis B.megaterium Bacillus megaterium MR Methyl red VP Voges proskauer MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Nguồn gốc chất gây ô nhiễm nước nước thải chế biến cao su Bảng 2.2 Đặc tính nước thải chế biến cao su Bảng 2.3 So sánh hàm lượng chất ô nhiễm nước thải chế biến cao su nước thải đô thị Bảng 2.4 Một số công nghệ xử lý nước thải cao su Malaysia Bảng 2.5 Hệ thống công nghệ xử lý nước thải cao su số nhà máy 10 Bảng 2.6 Đặc tính loài thuộc giống Bacillus 12 Bảng 2.7 Đặc điểm sinh hóa Bacillus subtilis 15 Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm đánh giá khả xử lý nước thải chủng 23 Bảng 4.1 Kết thử sinh hóa chủng phân lập 27 Bảng 4.2 Kết giá trị pH trung bình nghiệm thức qua ngày 29 Bảng 4.3 Kết giá trị BOD trung bình nghiệm thức qua ngày 30 Bảng 4.4 Kết giá trị COD trung bình nghiệm thức qua ngày 31 Bảng 4.6 Hiệu suất xử lý mẫu điều kiện hiếu khí sau 20 ngày thí nghiệm 33 viii TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Chuyên đề công nghệ xử lý nước thải chế biến mủ cao su Việt Nam, 2010 Cơng ty mơi trường Hành Trình Xanh (Getech) Chuyên đề công nghệ xử lý nước thải chế biến mủ cao su giới, 2010 Cơng ty mơi trường Hành Trình Xanh (Getech) Tơ Minh Châu, 2000 Giáo trình thực tập vi sinh vật học Tủ sách trường Đại học Nông Lâm TPHCM Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến Phạm Văn Ty,1998 Vi sinh vật học Nhà xuất Giáo dục TPHCM Nguyễn Lân Dũng, Hoàng Đức Nhuận, 1976 Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học Nhà xuất khoa học kỹ thuật, TPHCM Võ Thành Đan Phan Trường Khanh, 2009 Nghiên cứu ứng dụng dòng vi khuẩn Bacillus sp xử lý bùn ao nuôi cá tra Luận văn tốt nghiệp Trường Đại hoc An Giang Nguyễn Hồng Hà, 2010 Tính tốn thiết kế trạm xử lý nước thải cao su Hưng ThịnhTân Biên- Tây Ninh.Luận văn tốt nghiệp Hồ Văn Út Hậu, 2010 Khảo sát tác động vi khuẩn Bacillus subtilis nấm Aspergillus flavus Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM Trần Thu Hoa, 2003 Nghiên cứu khả dung bào tử Bacillus subtilis tái tổ hợp làm nguyên liệu thuốc chủng ngừa qua niêm mạc Luận án Tiên sĩ dược học, chuyên ngành Công nghệ Dược phẩm- Bào chế thuốc, trường đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh 10 Nguyễn Thị Kim Hòa, 2007 Nghiên cứu khả áp dụng sản xuất cho nhà máy chế biến mủ cao su Xuân Lập – công ty cao su Đồng Nai Luận văn tốt nghiệp Viện Môi trường tài nguyên,Trường Đại học Quốc gia TPHCM 35 11 Lý Kim Hữu, 2005 Khảo sát đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtilis tìm hiểu điều kiện ni cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm chế phẩm Probiotic Luận văn tốt nghiệp, khoa Chăn nuôi thú y Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM 12 Biền Văn Minh Cách nhuộm nội bào tử vi khuẩn Trường Đại học Sư Phạm Đại học Huế 13 Nguyễn Hoàng Mỹ, Võ Hồng Thi, Trương Thị Mỹ Khanh Vũ Thị Hương Lan, 2011 Nghiên cứu tuyển chọn số chủng vi sinh vật có khả xử lý protein ứng dụng xử lý nước thải chế biến thủy sản Khoa Môi trường Công nghệ sinh học, Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp HCM 14 Lê Đỗ Mai Phương, 2004 Phân lập giám định vi khuẩn Bacillus subtilis tự nhiên, bước đầu khảo sát khả sinh enzyme amylase enzyme protease Luận văn tốt nghiệp, trường Đại học Mở TPHCM 15 Nguyễn Ngọc Quỳnh Trâm, 2010 Đánh giá tương tác Bacillus subtilis kháng sinh việc ức chế vi khuẩn E.coli Luận văn tôt nghiệp Khoa Công Nghệ Thú y, Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM 16 Ngô Tự Thành, Bùi Thị Việt Hà, Vũ Minh Đức Chu Văn Mẫn 2007 Nghiên cứu hoạt tính enzyme ngoại bào số chủng Bacillus phân lập khả ứng dụng chúng xử lý nước thải Khoa Sinh, Trường Đại Học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội 17 Phạm Ngọc Thạch, 1963 Bacillus subtilis việc điều trị bệnh lao phổi bệnh phổi tập san bệnh lao số 6, 5-20 Nhà xuất Y học, Hà Nội 18 Vũ Thị Thứ, 1996 Nghiên cứu đặc điểm sinh học khả ứng dụng số chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus subtilis Luận án phó tiến sĩ khoa học, sinh học, Viện sinh học nhiệt đới Tài liệu tiếng anh 19 Thanyapoj Norasipitak, 2009 Systemic Resistance Induced by Bacillus subtilis in Citrus A thesis for the Degree of Master of Science in Biochemistry Price of Songakla University 36 20 Mitra Mohammadi, Hasfalina Che Man, Mohd Ali Hassan Phang Lai Yee, 2010 Treatment of wastewater from rubber industry in Malaysia Afican Journal of Biotechnology : 6233 - 6243 21 Perapong Tekasakul Surajiit Tekasakul, 2006 Enviromental problems related to natural rubber production in Thailand J.Aerosol Res 21: 122-129 22 Soule.M.H, 1932 Identify of Bacillus subtilis, Cohn 1872 The Journal of Infectious Diseases 51 : 191-215 Tài liệu tham khảo internet 23 http://www.sciencephoto.com/media/14873/enlarge Ngày truy cập 14/7/2012 24 Nguyễn Ngọc Bích Góp ý thơng số amoniac thực TCVN 5945:1995 công nghiệp chế biến cao su thiên nhiên Việt Nam, 2005 Viện nghiên cứu cao su Việt Nam http://archive.tcvn.vn/index.php?p=show_page&cid=&parent=113&sid=118&iid=2 428 Ngày truy cập 10/7/2012 25 Bacillus subtilis Final Risk Assessment,1997 http://www.epa.gov/oppt/biotech/pubs/fra/fra009.htm Ngày truy cập 10/7/2012 37 PHỤ LỤC I Kết thí nghiệm Kết thí nghiệm xử lý nước thải điều kiện yếm khí Bảng phụ lục Kết hàm lượng tiêu sau 20 ngày thí nghiệm điều kiện yếm khí Mẫu COD BOD TSS pH Ba D1.1 1213 553 211 7,1 Ba D1.2 1389 621 233 7,1 Ba D3 1849 838 227 6,9 Ba N1.1 1676 436 198 7,3 Ba N1.2 924 750 210 7,0 Ba N3 1184 685 201 7,4 Kết xử lý thống kê 2.1 Chỉ tiêu pH Bảng 2.1 Bảng ANOVA giá trị pH đo ngày A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 8.979 1.497 628.532 0.0000 Within 14 0.033 0.002 -Total 20 9.012 Bảng 2.2 Bảng ANOVA giá trị pH đo 10 ngày A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 13.296 2.216 581.704 0.0000 Within 14 0.053 0.004 -Total 20 13.350 Bảng 2.3 Bảng ANOVA giá trị pH đo 20 ngày A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 15.425 2.571 674.834 0.0000 Within 14 0.053 0.004 -Total 20 15.478 2.2 Chỉ tiêu COD Bảng 2.4 Bảng ANOVA giá trị COD đo ngày A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 1806936.667 301156.111 220.097 0.0000 Within 14 19156.000 1368.286 -Total 20 1826092.667 Bảng 2.5 Bảng ANOVA giá trị COD đo 10 ngày A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 3760918.667 626819.778 599.009 0.0000 Within 14 14650.000 1046.429 -Total 20 3775568.667 Bảng 2.6 Bảng ANOVA giá trị COD đo 20 ngày A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 4153837.333 692306.222 1354.933 0.0000 Within 14 7153.333 510.952 -Total 20 4160990.667 2.3 Chỉ tiêu BOD Bảng 2.7 Bảng ANOVA giá trị BOD đo ngày A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 350013.619 58335.603 111.307 0.0000 Within 14 7337.333 524.095 -Total 20 357350.952 Bảng 2.8 Bảng ANOVA giá trị BOD đo 10 ngày A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 768691.810 128115.302 348.997 0.0000 Within 14 5139.333 367.095 -Total 20 773831.143 Bảng 2.8 Bảng ANOVA giá trị BOD đo 10 ngày A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 768691.810 128115.302 348.997 0.0000 Within 14 5139.333 367.095 -Total 20 773831.143 Bảng 2.9 Bảng ANOVA giá trị BOD đo 20 ngày A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 915114.952 152519.159 562.801 0.0000 Within 14 3794.000 271.000 -Total 20 918908.952 2.4 Chỉ tiêu TSS Bảng 2.10 Bảng ANOVA giá trị TSS đo ngày A N A L Y S I S O F Degrees of V A R I A N C E Sum of T A B L E Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 163021.333 27170.222 28.599 0.0000 Within 14 13300.667 950.048 -Total 20 176322.000 Bảng 2.11 Bảng ANOVA giá trị TSS đo 10 ngày A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 14288.952 2381.492 10.057 0.0002 Within 14 3315.333 236.810 -Total 20 17604.286 Bảng 2.12 Bảng ANOVA giá trị TSS đo 20 ngày A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 67382.476 11230.413 58.564 0.0000 Within 14 2684.667 191.762 -Total 20 70067.143 II Thành phần số loại môi trường 2.1 Môi trường Trypticase Soya Agar (TSA) Soya pepton 15 g/l Tryptone peptone g /l NaCl g/l Agar 18 g/l pH 7,3 ± 0,2 Hấp khử trùng 1210C/ 15 phút 2.2 Môi trường Tryticase Soya Broth (TSB) Soy pepton 15 g/l Tryptone peptone g/l NaCl g/l pH 7,3 ± 0,2 Hấp khử trùng 121oC/15 phút 2.3 Môi trường Clarklubs Pepton bột g/l Glucose g/l KH2PO4 g/l pH 6,7 – 7,1 Hấp khử trùng 1210C/15 phút 2.4 Môi trường lên men loại đường Cao thịt g/l Pepton bột 10 g/l Đường 10 g/l Phenol red 0,01 g/l pH 7,4 Hấp khử trùng 1210C/15 phút 2.5 Môi trường Simons Citrate Agar Sodium citrate g/l K2HPO4 g/l MgSO4 0,2 g/l Brothymol blue 0,08 g/l NaCl g/l NH4H2PO4 g/l Agar 18 g/l pH 6,9 ± 0,2 Hấp khử trùng 1210C/15 phút 2.6 Môi trường khử Nitrate Cao thịt g/l Pepton bột g/l NaNO3 g/l Agar g/l pH 7,0 ± 0,2 2.7 Dịch pha loãng: Dung dịch nước muối pepton (SPW) Thành phần gồm có 8,5g NaCl 1g pepton 100ml nước Dung dịch chứa bình chứa 0,5-1,0 lít, hấp khử trùng phân phối thành thể tích xác 9ml vào ống nghiệm vô trùng 2.8 Phương pháp nhuộm Gram Các bước tiến hành: Phết canh khuẩn lên miếng lam Cố định mẫu cách hơ qua đèn cồn Đặt giấy lọc lên vết phết vi khuẩn Nhuộm crystal violet phút Rửa nước, thấm khô Đặt giấy lọc lên vết phết vi khuẩn Cố định màu lugol phút Rửa nước, thấm khô Tẩy cồn 960 khoảng 15 giây Rửa nước, thấm khô Đặt giấy lọc lên vết phết vi khuẩn Nhuộm màu dung dịch Fuchsine kiềm loãng Rửa nước, thấm khơ Xem kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần (vật kính dầu) 2.9 Các phản ứng sinh hóa  Khả lên men đường Chuẩn bị: Môi trường đường: maltose, glucose, manitol Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Ống nghiệm, ống Durham Cách làm: cho vào ống nghiệm có sẵn mơi trường đường ống Durham hấp khử trùng 1210C/15 phút Sau cấy vi khuẩn vào môi trường ủ 370C/24 Quan sát đổi màu sinh Nếu vi khuẩn có khả lên men đường, chuyển đường thành rượu, rượu lên men thành acid làm pH môi trường giảm, chuyển màu môi trường Kết quả: Phản ứng (-): môi trường có màu hồng đỏ Phản ứng (+): mơi trường có màu vàng  Thử phản ứng Catalase Chuẩn bị: Dung dịch H2O230% Lame Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Cách làm: dùng piptte lấy vi khuẩn, phết lên lame kính khơ Sau nhỏ giọt H2O2 30% lên vết vi khuẩn Đọc kết sau khoảng 15 giây Kết quả: Phản ứng (-): khơng có tượng sủi bọt Phản ứng (+): có tượng sủi bọt  Thử phản ứng VP (Voges Proskauer) Chuẩn bị: Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Môi trường Clark lubs α – naphtol 10%, NaOH 40% Cách làm: cấy vi khuẩn vào môi trường Clarklubs, ủ nhiệt độ 37oC/24 Sau nhỏ – giọt NaOH 40% – giọt α – naphtol 10% Sau 15 phút đọc kết Kết quả: Phản ứng VP (-): mơi trường có màu vàng Phản ứng VP (+): mơi trường có màu đỏ  Thử phản ứng MR (Methyl – Red) Chuẩn bị: Môi trường Clark lubs Thuốc thử Methyl Red Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Cách làm: Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn cấy vào mơi trường Clark lubs, ni nhiệt độ 370C/24 Sau nhỏ – giọt thuốc thử Methyl Red vào canh khuẩn đọc kết Kết quả: Phản ứng MR (-): mơi trường có màu vàng Phản ứng MR (+): mơi trường có màu đỏ  Thử phản ứng khử Nitrate (NO3) Chuẩn bị: Môi trường Nitrate Dung dịch thuốc thử Giess A, Giess B Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Cách làm: Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn cấy sâu vào môi trường thạch nitrate, nuôi nhiệt độ 370C/24 Sau 24 nhỏ vào môi trường – giọt Giess A, sau nhỏ tiếp – giọt Giess B Kết quả: Phản ứng (-): mơi trường có màu vàng Phản ứng (+): mơi trường có màu đỏ  Thử khả sử dụng Citrate Chuẩn bị: Môi trường Citrate Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Cách làm: cấy vi khuẩn vào môi trường Citrate Nuôi nhiệt độ 370C/24h Kết quả: Phản ứng (-): mơi trường có màu xanh mạ non Phản ứng (+): mơi trường có màu xanh dương III Các phương pháp thực 3.1 Phương pháp gián tiếp đếm số khuẩn lạc môi trường thạch Nguyên tắc phương pháp cấy thể tích xác định dung dịch huyền phù cần nghiên cứu lên môi trường đặc đĩa petri sau đếm số khuẩn lạc mọc lên sau ủ Khi ta coi khuẩn lạc kết phát triển từ tế bào Dùng dung dịch cần đếm vi khuẩn pha loãng độ liên tiếp nhau, theo số 10, thông thường lấy vi khuẩn pha lỗng ba nồng độ liên tiếp thích hợp với loại vi khuẩn Đảm bảo đếm khuẩn lạc, có hai ống nhìn thấy khuẩn lạc Ví dụ: 10-6, 10-7, 10-8, nồng độ pha loãng lấy 0,1 ml cấy lên đĩa thạch thích hợp (có thể dùng que gạt thủy tinh hay bi thủy tinh để dàn mỏng) sau ủ 370C/24 Đếm số khuẩn lạc mọc đĩa thạch Sau có số khuẩn lạc ta tính tốn sau: A = ∑C ∕d(n1+0,1.n2) Trong N: số vi sinh vật đơn vị kiểm tra (được tính CFU/ml) ∑C: tổng số khuẩn lạc đếm tất đĩa petri giữ lại n1: số đĩa giữ lại độ pha loãng thứ n2: số đĩa giữ lại độ pha loãng thứ hai d: hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ Hình Nước thải sau ngày xử lý (a) Nước thải đầu vào; (b) Nước thải sau ngày xử lý; (c) Nước thải sau 20 ngày xử lý 3.2 Phương pháp xác định hàm lượng COD Xác định theo phương pháp dicromat môi trường acid sunfuric với xúc tác bạc sunfate: Ðầu tiên rửa ống nghiêm có nút vặn với H2SO4 20 % trước sử dụng Chọn thể tích mẫu: 2,5 ml mẫu; 1,5 ml K2Cr2O7 0,016 M 3,5 ml acid reagent Ðậy nút vặn, lắc kỹ nhiều lần (chú ý phản ứng sinh nhiệt) Ðặt ống nghiệm vào giá inox, cho vào tủ sấy nhiệt dộ 1500C 2giờ Sau để nguội đến nhiệt độ phòng Ðổ dung dịch vào bình tam giác 100 ml, thêm 1- giọt ferroin định phân FAS 0,1 M Ngừng lại mẫu chuyển từ màu xanh sang màu nâu đỏ Làm hai mẫu trắng với nước cất (mẫu đun khơng đun) Tính tốn kết MFAS = VK2Cr2O7 / V FAS (dùng chuẩn độ mẫu không đun) *0.1 COD (mgO2/L) = (A – B) *M* 8000 / v Trong A: VFAS dùng định phân mẫu trắng đun (mL) B: VFAS dùng định phân mẫu (mL) M: nồng độ mole FAS V: thể tích mẫu (mL) 3.3 Phương pháp xác định hàm lượng BOD Chuẩn bị nước pha loãng cách thêm 1ml dung dịch đệm photphat, MgSO4, CaCl2, FeCl3 cho l nước cất bão hòa O2 sục khí 2giờ Pha lỗng theo tỉ lệ thích hợp 5%, chiết nước pha lỗng vào chai Một chai dậy kín để ủ ngày (DO5) chai định phân tức (DOo) Chai ủ 200C đậy kín, niêm lớp nước mỏng chỗ loe miệng chai Ðịnh phân lượng O2 hòa tan Cho 2ml MnSO4và 2ml iodide- azide kiềm Ðậy nút chai đảo ngược lên xuống vài phút Ðể yên cho kết tủa lắng hoàn toàn, cẩn thận mở nút chai, thêm 2ml H2SO4đđ Ðậy nút, rửa chai vòi, đảo ngược chai, làm tan kết tủa hồn tồn Rót bỏ 97ml dung dịch, định phân mẫu lại dung dịch Na2S2O3 0.025M Cho đến có màu vàng rơm nhạt Thêm vài giọt thị hồ tinh bột, tiếp tục định phân màu xanh Làm tương tự với chai ủ ngày Tính tốn kết 1ml Na2S2O3 0.025M dùng = mgO2/L BOD5 (mgO2/L) = (DO0- DO5)*f Trong đó: DO0: hàm lượng oxy hòa tan ngày dầu tiên DO5: hàm lượng oxy hòa tan ngày thứ f: hệ số pha loãng mẫu 3.4 Phương pháp xác định hàm lượng TSS Ðầu tiên sấy giấy lọc GF/C tủ sấy nhiệt độ 103- 105oC khoảng 1h, Lấy để nguội bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng khoảng 30phút, Cân trọng lượng giấy lọc A (mg), Ðể giấy lọc hệ thống lọc chân không, Lấy 50 ml nước lọc qua hệ thống giấy lọc Sấy giấy lọc lọc tủ sấy nhiệt dộ 103- 1050C, 1giờ Lấy để nguội bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng khoảng 30phút Cân trọng lượng giấy lọc B (mg) Tính tốn kết quả: SS (mg/L) = (A-B)* 1000 / v Trong đó: A: khối lượng giấy lọc (mg) B: khối lượng giấy lọc mẫu sau sấy (mg) v: thể tích mẫu (ml) ... cạnh nhiều cơng trình nghiên cứu thành cơng nhà khoa học, giúp cải thi n khả xử lý nước thải nhà máy chế biến cao su làm giảm thi u nhiễm mơi trường (Trích “Cơng ty mơi trường Hành Trình Xanh”,... B.pumulis, B.megaterium, có khả sản sinh enzyme lecithinase, loại enzyme làm vỡ màng tế bào động vật Tuy nhiên, chưa có chứng cho thấy lecithinase gây bệnh người Theo Edberg (1991) B subtillis... Đối tượng khảo sát Các chủng Bacillus subtilis phân lập từ mẫu đất nước thải 3.3 Thi t bị dụng cụ thí nghiệm Thi t bị: tủ sấy, tủ cấy, nồi hấp tiệt trùng, cân điện tử, máy lắc, lò vi sóng, kính