KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỐI VỚI NẤM ASPERGILLUS FLAVUS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỐI VỚI NẤM ASPERGILLUS FLAVUS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỐI VỚI NẤM ASPERGILLUS FLAVUS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 072010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH HỒ VĂN ÚT HẬU KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỐI VỚI NẤM ASPERGILLUS FLAVUS Chuyên ngành: Thú y Mã số : TY2007012 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Hướng dẫn Khoa học: PGS. TS. NGUYỄN NGỌC HẢI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 072010 i KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỐI VỚI NẤM ASPERGILLUS FLAVUS HỒ VĂN ÚT HẬU Hội đồng chấm luận văn: 1. Chủ tịch: PGS. TS. DƯƠNG THANH LIÊM Hội chăn nuôi Việt Nam 2. Thư ký: TS. TRẦN XUÂN HẠNH Công ty thuốc thú y Trung ương 2 (Navetco) 3. Phản biện 1: TS. LÊ ANH PHỤNG Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh 4. Phản biện 2: PGS. TS. LÂM THỊ THU HƯƠNG Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh 5. Ủy viên: PGS. TS. NGUYỄN NGỌC HẢI Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH HIỆU TRƯỞNG ii LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tôi tên là Hồ Văn Út Hậu sinh ngày 07 tháng 05 năm 1980 tại huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp, Con Ông Hồ Chính Hải và Bà Huỳnh Thị Nhành. Tốt nghiệp Tú tài tại Trường Trung học chuyên ban Lai Vung I, tỉnh Đồng Tháp năm 1998. Tốt nghiệp Đại học ngành Thú y hệ Tại chức tại Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh. Sau đó làm việc tại Trường Cao Đẳng Nghề Đồng Tháp, giáo viên Khoa Nông Nghiệp Thủy Sản. Tháng 09 năm 2007 theo học Cao học ngành Thú y tại Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh. Tình trạng gia đình: Vợ Võ Thị Cẩm Duyên, kết hôn năm 2006, Con Hồ Ngọc Đại, sinh năm 2008. Địa chỉ liên lạc: 341HT, ấp Hậu Thành, xã Tân Dương, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp hoặc Trường Cao Đẳng Nghề Đồng Tháp (số 02, đường Trần Phú, Phường 03, Thị xã Sa Đéc). Điện thoại: (067) 2215467 DĐ: 0909662729 Email: hau802007yahoo.com.vn iii LỜI CAM ĐOAN Tôi tên là Hồ Văn Út Hậu, xin cam đoan những kết quả trình bày trong cuốn luận văn này là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết quả hoàn toàn trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình hoặc luận văn nào trước đây. Tác giả luận văn Hồ Văn Út Hậu iv LỜI CẢM ƠN Trân trọng bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến: ۞ Sự giúp đỡ của Đảng ủy và Ban Giám hiệu trường Cao Đẳng nghề Đồng Tháp, khoa Nông Nghiệp Thủy Sản. ۞ Ban Giám hiệu trường ĐHNL – Tp. HCM, Ban Chủ nhiệm khoa CNTY, phòng Đào tạo Sau đại học, bộ môn Vi sinh – Truyền nhiễm, bộ môn Bệnh lý – Truyền nhiễm – Ký sinh, bộ môn Sinh lý – Sinh hóa và quí thầy cô đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho việc hoàn thành luận văn này. ۞ Thầy hướng dẫn là PGS TS Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian thực hiện công trình này. ۞ BGĐ Bệnh viện Từ Dũ, quí thầy Lê Anh Phụng và thầy Nguyễn Văn Khanh cùng cô Hồ Thị Nga đã giúp tôi thực hiện phân tích các mẫu thí nghiệm. ۞ Sự giúp đỡ của PGS TS Dương Thanh Liêm, PGS TS Nguyễn Ngọc Tuân, PGS TS Lâm Thị Thu Hương, TS Lê Anh Phụng, TS Trần Văn Chính, TS Đỗ Hiếu Liêm, TS Nguyễn Tất Toàn, Ths Nguyễn Thị Thu Năm đã đóng góp nhiều ý kiến quí báu cho việc hoàn chỉnh luận văn này. ۞ Các bạn hữu, quí đồng nghiệp đã nhiệt tình giúp đỡ trong thời gian qua và đặc biệt là sự hỗ trợ tận tình của Mẹ Huỳnh Thị Nhành với Vợ Võ Thị Cẩm Duyên cùng Con Hồ Ngọc Đại giúp tôi vượt qua nhiều khó khăn để đạt được thành quả ngày hôm nay. Tp. HCM, tháng năm Tác giả v TÓM TẮT Đề tài “Khảo sát tác động của vi khuẩn Bacillus subtilis đối với nấm Aspergillus flavus” được tiến hành tại Bộ môn Vi sinh – Truyền nhiễm, khoa Chăn nuôi Thú Y, trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM từ tháng 03 năm 2009 đến tháng 09 năm 2009. Qua thời gian thực hiện đề tài chúng tôi có những kết luận sau: Vi khuẩn Bacillus subtilis có thể phân lập được từ phân vịt (khoảng 2,5 tháng tuổi). Khảo sát khả năng ức chế aflatoxin của các gốc vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được từ phân vịt: Trên môi trường thạch nước cốt dừa: sau 5 ngày nuôi cấy chung vi khuẩn Bacillus subtilis và nấm mốc Aspergillus flavus, quan sát dưới ánh đèn tia cực tím (bước sóng 365 nm) cho thấy một số gốc vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng ức chế sự sinh trưởng và sinh độc tố aflatoxin của nấm mốc Aspergillus flavus. Trên môi trường bắp xay vỡ: sau 7 ngày nuôi cấy chung bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis và bào tử nấm mốc Aspergillus flavus, kết quả cho thấy một số gốc Bacillus subtilis có khả năng làm giảm sự sản sinh aflatoxin của nấm Aspergillus flavus trên bắp (875 ppb aflatoxin so với mẫu đối chứng 6200 ppb aflatoxin). Thức ăn hỗn hợp gây nhiễm aflatoxin khi được xử lý với vi khuẩn Bacillus subtilis có tỷ lệ gây chết vịt thấp hơn có ý nghĩa so với đối chứng (không xử lý với Bacillus subtilis), lần lượt là 0 %, 3,33 % so với đối chứng 23,33 %. Tỷ lệ vịt bệnh và mức độ bệnh tích trên gan cũng giảm rõ rệt ở lô được xử lý với vi khuẩn Bacillus subtilis so với lô đối chứng. vi SUMMARY The study “The effects of Bacillus subtilis on Aspergillus flavus” was performed in the Department of Microbiology and Contagious Diseases, Faculty of Veterinary and Animal Sciences, NongLam University Ho Chi Minh City from March 2009 to September 2009. The results showed: Bacillus subtilis be isolated from feces of ducks at about 2,5 months of age. After 5 days of culturing on coconut juice agar the growth of both Bacillus subtilis and Aspergillus flavus could be observed and aflatoxin production inhibition of Bacillus subtilis to Aspergillus flavus fungus could be detected. On ground maize medium after 7 days of culture some Bacillus subtilis strains might reduce the production of aflatoxin by Aspergillus flavus (6200 ppb aflatoxin in control compared to 875 ppb aflatoxin in the experimental lot). The treatment feed contaminated with aflatoxin with Bacillus subtilis resulted in lower mortality (0 % and 3,33 %) in comparing to the control without Bacillus subtilis treatment (23,33 %). Severity of liver lesions was observed less at lower level among ducks fed with diet treated with Bacillus subtilis than those of the control. vii MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG LÝ LỊCH CÁ NHÂN ................................................................................................. ii LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... iii LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... iv TÓM TẮT ................................................................................................................... v SUMMARY .............................................................................................................. vi Chương 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1 1.2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU ................................................................................. 2 1.3 YÊU CẦU ............................................................................................................. 2 Chương 2. TỔNG QUAN ........................................................................................... 3 2.1 KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ......................................... 3 2.1.1 Đặc điểm chung của giống Bacillus ................................................................... 3 2.1.2 Một số đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis ................................................. 5 2.1.2.1 Lịch sử phát hiện ............................................................................................. 5 2.1.2.2 Đặc điểm phân loại.......................................................................................... 5 2.1.2.3 Sự phân bố ....................................................................................................... 5 2.1.2.4 Đặc điểm hình thái .......................................................................................... 5 2.1.2.5 Đặc điểm nuôi cấy ........................................................................................... 6 2.1.2.6 Đặc điểm sinh hóa ........................................................................................... 6 2.1.3 Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis ....................................................................... 6 2.1.4 Kháng sinh được tổng hợp bởi Bacillus subtilis ................................................ 8 2.1.4.1 Peptide antibiotic được tổng hợp bằng ribosome ............................................ 8 2.1.4.2 Peptide antibiotic không được tổng hợp bằng ribosome................................. 9 2.2 KHÁI QUÁT VỀ MYCOTOXIN VÀ AFLATOXIN .......................................... 9 2.2.1 Mycotoxin .......................................................................................................... 9 2.2.2 Aflatoxin .......................................................................................................... 10 viii 2.2.2.1 Các loại độc tố aflatoxin ............................................................................... 10 2.2.2.2 Cơ chế gây bệnh của aflatoxin ...................................................................... 11 2.2.3 Bệnh nhiễm độc AF (Aflatoxicosis) ................................................................ 12 2.2.3.1 Nhiễm độc cấp tính ....................................................................................... 12 2.2.3.2 Nhiễm độc mãn tính ...................................................................................... 13 2.2.3.3 Ức chế miễn dịch và gây ung thư .................................................................. 14 2.2.4 Các loài nấm mốc sinh độc tố AF .................................................................... 14 2.2.5 Các biện pháp làm giảm độc AF trong thực liệu ............................................. 15 2.2.5.1 Phương pháp vật lý học ................................................................................. 15 2.2.5.2 Phương pháp hóa học .................................................................................... 16 2.2.5.3 Phương pháp sinh vật học ............................................................................. 17 2.3 KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA BACILLUS SUBTILIS VỚI NẤM ............... 18 Chương 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 20 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM .............................................................................. 20 3.2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU .................................................... 20 3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................... 20 3.4 VẬT LIỆU DÙNG CHO THÍ NGHIỆM ............................................................ 21 3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................................................... 22 3.5.1 PHÂN LẬP VI KHUẨN B. SUBTILIS TỪ PHÂN VỊT ................................. 22 3.5.2 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ AF CỦA VI KHUẨN B. SUBTILIS LÊN NẤM A. FLAVUS TRÊN MÔI TRƯỜNG NƯỚC CỐT DỪA VÀ BẮP ................ 23 3.5.2.1 Khảo sát khả năng ức chế của vi khuẩn B. subtilis lên nấm A. flavus .......... 23 3.5.2.2 Khảo sát khả năng ức chế của vi khuẩn B. subtilis lên nấm A. flavus ......... 25 3.5.3 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ LÀM AF CỦA KHUẨN B. SUBTILIS .................. 28 3.6 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ................................................................. 300 Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 311 4.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP B. SUBTILIS TỪ PHÂN VỊT ..................................... 311 4.1.1 Lựa chọn khuẩn lạc nghi ngờ B. subtilis ........................................................ 311 4.1.2 Xác định đặc điểm hình thái vi khuẩn nghi ngờ B. subtilis ........................... 311 ix 4.1.3 Xác định B. subtilis bằng xét nghiệm sinh hóa .............................................. 322 4.2 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG VI KHUẨN B. SUBTILIS ỨC CHẾ A. FLAVUS .. 333 4.2.1 Kiểm tra khả năng sinh AF của chủng nấm mốc A. flavus ............................ 333 4.2.2 Khảo sát khả năng ức chế nấm A. flavus của các gốc B. subtilis phân lập được ... 333 4.2.3 Khảo sát khả năng của các gốc B. subtilis làm giảm AF do A. flavus .......... 355 4.3 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA B. SUBTILIS ĐỐI VỚI AF TRÊN VỊT CON 377 4.3.1 Tỷ lệ bệnh ....................................................................................................... 377 4.3.2 Tỷ lệ nuôi sống ............................................................................................... 377 4.3.3 Khảo sát bệnh tích ............................................................................................ 39 4.3.3.1 Kết quả khảo sát trên vịt còn sống sau thí nghiệm ....................................... 39 4.3.3.2 Kết quả khảo sát bệnh tích trên vịt chết ...................................................... 433 4.3.4 Các chỉ tiêu sinh lý của máu trong giai đoạn 3 ngày – 2 tuần tuổi ................ 477 4.3.4.1 Haemoglobin ............................................................................................... 477 4.3.4.2 Hồng cầu ..................................................................................................... 488 4.3.4.3 Bạch cầu ...................................................................................................... 488 4.3.4.4 Công thức bạch cầu ....................................................................................... 49 4.3.4.5 Nhận xét chung về khả năng làm giảm độc AF của B. subtilis .................. 522 4.4 CÁC MẶT HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI .............................................................. 522 Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 544 5.1 KẾT LUẬN ....................................................................................................... 544 5.2 ĐỀ NGHỊ .......................................................................................................... 555 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 566 PHẦN TIẾNG VIỆT NAM .................................................................................... 566 PHẦN TIẾNG NƯỚC NGOÀI .............................................................................. 577 PHỤ LỤC ................................................................................................................ 611 x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT TIẾNG VIỆT KÝ HIỆU NGUYÊN CHỮ TĂHH Thức ăn hỗn hợp TIẾNG NƯỚC NGOÀI VIẾT TẮT NGUYÊN CHỮ NƯỚC NGOÀI NGHĨA TIẾNG VIỆT % mole GC % mole Guanine Cytosine AOAC Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội các nhà hóa phân tích CFU Colony forming unit Đơn vị tạo khuẩn lạc kDa Kilo dalton Đơn vị đo phân tử khối protein Ppb Part per billion Phần tỷ (μmkg) VP VogesProskauer Phản ứng VP xi DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1: Đặc tính của các loài thuộc giống Bacillus ................................................ 4 Bảng 2.2: Sự khác nhau giữa tế bào sinh dưỡng và nội bào tử vi khuẩn ................... 7 Bảng 2.3: Trọng lượng phân tử của một số loại AF ................................................ 10 Bảng 2.4: Một số loài nấm mốc có khả năng sản sinh AF ....................................... 14 Bảng 2.5: Điểm nóng chảy của một số loại AF ........................................................ 15 Bảng 2.6: Khả năng ức chế AFB1 của các gốc vi khuẩn B. subtilis ......................... 17 Bảng 3.1: Sơ đồ bố trí các chai thí nghiệm trên môi trường bắp.............................. 26 Bảng 3.2: Sơ đồ bố trí số vịt thí nghiệm trong các lô ............................................... 28 Bảng 4.1: Tỷ lệ phân lập B. subtilis trên phân vịt .................................................... 32 Bảng 4.2: Kết quả phân tích hàm lượng AF trên môi trường bắp xay vỡ ................ 35 Bảng 4.3: Tỷ lệ bệnh ở vịt (3 ngày – 2 tuần) (%) ..................................................... 37 Bảng 4.4: Tỷ lệ nuôi sống ở vịt (3 ngày – 2 tuần) (%) ............................................. 38 Bảng 4.5: Bệnh tích đại thể của gan và túi mật vịt thí nghiệm (lúc 2 tuần tuổi) ...... 39 Bảng 4.6: Bệnh tích tế bào gan thoái hóa mỡ ........................................................... 41 Bảng 4.7: Bệnh tích hoại tử tế bào gan ..................................................................... 41 Bảng 4.8: Bệnh tích tăng sinh ống dẫn mật .............................................................. 42 Bảng 4.9: Bệnh tích tăng sinh mô liên kết ................................................................ 42 Bảng 4.10: Bệnh tích đại thể của gan vịt chết trong thí nghiệm .............................. 44 Bảng 4.11: Bệnh tích vi thể (đánh giá mức độ bệnh tích) của gan vịt thí nghiệm ... 44 Bảng 4.12: Hàm lượng Hb ở vịt 2 tuần tuổi (g%) .................................................... 47 Bảng 4.13: Biến đổi số lượng hồng cầu ở các lô vịt thí nhiệm ................................ 48 Bảng 4.14: Số lượng bạch cầu trên vịt thí nghiệm (2 tuần tuổi) .............................. 48 Bảng 4.15: Biến đổi về tỷ lệ bạch cầu ái toan ở vịt thí nghiệm (%) ......................... 49 Bảng 4.16: Tỷ lệ bạch cầu ái kiềm ở các lô thí nghiệm (%) .................................... 49 Bảng 4.17: Biến đổi tỷ lệ bạch cầu dị nhiễm ở vịt 2 tuần tuổi (%) .......................... 50 Bảng 4.18: Tỷ lệ lâm ba cầu ở các lô thí nghiệm (%) .............................................. 51 Bảng 4.19: Biến đổi tỷ lệ bạch cầu đơn nhân lớn ở vịt thí nghiệm (%) ................... 51 xii DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Hình thái vi khuẩn B. subtilis ..................................................................... 5 Hình 4.1: Khuẩn lạc nghi ngờ B. subtilis trên môi trường thạch TSA ..................... 31 Hình 4.2: Hình thái vi khuẩn nghi ngờ B. subtilis dưới kính hiển vi ....................... 31 Hình 4.3: Kết quả thử phản ứng sinh hóa xác định B. subtilis ................................. 32 Hình 4.4: Khuẩn lạc của A. flavus trên môi trường thạch nước cốt dừa .................. 33 Hình 4.5: Sự ức chế phát triển của khuẩn lạc vi khuẩn đối với nấm mốc ................ 34 Hình 4.6: Cường độ vòng sáng AF không đều ở các phía của khuẩn lạc A. flavus . 34 Hình 4.7: So sánh các mẫu bắp sau 7 ngày ủ ........................................................... 35 Hình 4.8: Gan bình thường (lô I) .............................................................................. 40 Hình 4.9: Gan nhạt màu, xuất huyết (lô II) .............................................................. 40 Hình 4.10: Bề mặt gan bị sưng (lô III) ..................................................................... 40 Hình 4.11: Gan gần như bình thường (lô IV) ........................................................... 40 Hình 4.12: Túi mật sưng căng to (lô II) .................................................................... 45 Hình 4.13: Gan nhạt màu, bề mặt xuất huyết (lô II) ................................................ 45 Hình 4.14: Túi khí phủ fibrin (lô II) ......................................................................... 45 Hình 4.15: Gan nhạt màu, bề mặt gan sưng (lô II) ................................................... 45 Hình 4.16: Vịt có tình trạng chân bị cong do ảnh hưởng của aflatoxin ................... 45 Hình 4.17: Mô gan gần như bình thường (lô I) ........................................................ 46 Hình 4.18: Tăng sinh ống dẫn mật (+++) ở lô II ...................................................... 46 Hình 4.19: Tăng sinh ống dẫn mật (+) ở lô III ......................................................... 46 Hình 4.20: Mô gan chỉ hơi bị xung huyết (lô IV) .................................................... 46 Hình 4.21: Thoái hóa mỡ (++++) ở lô IV ................................................................ 46 Hình 4.22: Tăng sinh ống dẫn mật (++) ở lô IV ....................................................... 46 xiii DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ SƠ ĐỒ TRANG Sơ đồ 3.1: Phân lập vi khuẩn B. subtilis ................................................................... 23 Sơ đồ 3.2: Các bước thực hiện thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế sản sinh AF của các gốc B. subtilis phân lập được ....................................................................... 25 Sơ đồ 3.3: Phương pháp thu hoạch huyễn dịch bào tử vi khuẩn B. subtilis ............. 27 Sơ đồ 3.4: Phương pháp xác định số lượng bào tử vi khuẩn B. subtilis ................... 27 1 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay thức ăn hỗn hợp được sản xuất với quy mô công nghiệp để đáp ứng cho nhu cầu chăn nuôi gia súc, gia cầm ở các trang trại. Tình hình mua bán, dự trữ các nguồn thực liệu với số lượng lớn như hiện nay cộng với điều kiện tự nhiên ở nước ta rất thuận lợi cho nhiều loài nấm mốc phát triển, điển hình là các loài Aspergillus sinh độc tố aflatoxin (AF). Độc tố này gây ảnh hưởng trực tiếp đến gia súc gia cầm như giảm hiệu quả chuyển hóa thức ăn, sinh trưởng, suy giảm miễn dịch, gây nhiễm độc, rối loạn chức năng, thoái hóa gan mỡ và gây chết trong trường hợp nhiễm độc số lượng lớn. Nguy hiểm hơn, độc tố còn có thể ảnh hưởng gián tiếp đến sức khỏe cộng đồng. Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu nhằm tìm ra những biện pháp để làm giảm hoặc phá hủy AF như biện pháp vật lý (loại bỏ phần nhiễm nấm, xử lý nhiệt, chiếu xạ, dùng các chất hấp phụ, trích ly bằng dung môi, than hoạt tính,...), biện pháp hóa học (dùng ozon, ammonia,...). Việc lựa chọn phương pháp làm giảm hoặc phá hủy độc tố phải phù hợp với yêu cầu sau: khả thi, giá thành rẻ, hiệu quả, đồng thời không ảnh hưởng đến khẩu vị của thú hoặc làm hạ thấp giá trị dinh dưỡng của thức ăn hoặc hình thành các chất có hại. Định hướng mới hiện nay đang được quan tâm là áp dụng phương pháp vi sinh vật. Một số loài vi khuẩn, nấm mốc, nấm men đã được thử nghiệm về khả năng làm giảm tác hại của AF cho kết quả khả quan: nấm mốc (Rhizopus stolonifer, Rhizopus arrhizus), vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus pulimus), nấm men (Saccharomyces cerevisiae), và xạ khuẩn… Các vi sinh vật của phương pháp này có tác dụng làm giảm AF, kích thích tăng trọng, tăng hiệu lực miễn dịch và giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, ngoài ra còn có tác dụng bảo 2 vệ môi trường khi được thải ra ngoài tự nhiên. Để làm rõ vấn đề trên, chúng tôi thực hiện đề tài “KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỐI VỚI NẤM ASPERGILLUS FLAVUS”. Sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis (B. subtilis) là giải pháp hiện nay nhằm làm giảm khả năng gây độc trên vịt khi trong khẩu phần có độc tố AF. Đặc biệt vịt là loài rất mẫn cảm với AF. Đề tài hy vọng trở thành cơ sở để áp dụng phương pháp vi sinh vật trong việc làm giảm khả năng sinh độc tố của nấm Aspergillus flavus (A. flavus) nhằm góp phần tạo ra sản phẩm chăn nuôi chất lượng cao. 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Phân lập, xác định chủng vi khuẩn B. subtilis có khả năng ức chế sản sinh AF của nấm A. flavus nhằm có thể ứng dụng trong chăn nuôi hạn chế tác hại của độc tố nấm. 1.3 YÊU CẦU (1) Phân lập được vi khuẩn B. subtilis từ phân vịt. (2) Tìm ra chủng B. subtilis có khả năng ức chế sinh AF của nấm A. flavus (in vitro). (3) Đánh giá hiệu quả làm giảm độc AF trong khẩu phần nuôi vịt của vi khuẩn B. subtilis phân lập.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH **************** HỒ VĂN ÚT HẬU KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỐI VỚI NẤM ASPERGILLUS FLAVUS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 07/2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH **************** HỒ VĂN ÚT HẬU KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỐI VỚI NẤM ASPERGILLUS FLAVUS Chuyên ngành: Thú y Mã số : TY2007012 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Hướng dẫn Khoa học: PGS TS NGUYỄN NGỌC HẢI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 07/2010 KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỐI VỚI NẤM ASPERGILLUS FLAVUS HỒ VĂN ÚT HẬU Hội đồng chấm luận văn: Chủ tịch: PGS TS DƯƠNG THANH LIÊM Hội chăn nuôi Việt Nam Thư ký: TS TRẦN XUÂN HẠNH Công ty thuốc thú y Trung ương (Navetco) Phản biện 1: TS LÊ ANH PHỤNG Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh Phản biện 2: PGS TS LÂM THỊ THU HƯƠNG Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh Ủy viên: PGS TS NGUYỄN NGỌC HẢI Trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH HIỆU TRƯỞNG i LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tôi tên Hồ Văn Út Hậu sinh ngày 07 tháng 05 năm 1980 huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp, Con Ông Hồ Chính Hải Bà Huỳnh Thị Nhành Tốt nghiệp Tú tài Trường Trung học chuyên ban Lai Vung I, tỉnh Đồng Tháp năm 1998 Tốt nghiệp Đại học ngành Thú y hệ Tại chức Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh Sau làm việc Trường Cao Đẳng Nghề Đồng Tháp, giáo viên Khoa Nông Nghiệp Thủy Sản Tháng 09 năm 2007 theo học Cao học ngành Thú y Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh Tình trạng gia đình: Vợ Võ Thị Cẩm Dun, kết năm 2006, Con Hồ Ngọc Đại, sinh năm 2008 Địa liên lạc: 341/HT, ấp Hậu Thành, xã Tân Dương, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp Trường Cao Đẳng Nghề Đồng Tháp (số 02, đường Trần Phú, Phường 03, Thị xã Sa Đéc) Điện thoại: (067) 2215467 DĐ: 0909662729 Email: hau802007@yahoo.com.vn ii LỜI CAM ĐOAN Tôi tên Hồ Văn Út Hậu, xin cam đoan kết trình bày luận văn cơng trình nghiên cứu thân Các số liệu, kết hoàn toàn trung thực chưa công bố cơng trình luận văn trước Tác giả luận văn Hồ Văn Út Hậu iii LỜI CẢM ƠN Trân trọng bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến: ۞ Sự giúp đỡ Đảng ủy Ban Giám hiệu trường Cao Đẳng nghề Đồng Tháp, khoa Nông Nghiệp Thủy Sản ۞ Ban Giám hiệu trường ĐHNL – Tp HCM, Ban Chủ nhiệm khoa CNTY, phòng Đào tạo Sau đại học, môn Vi sinh – Truyền nhiễm, môn Bệnh lý – Truyền nhiễm – Ký sinh, mơn Sinh lý – Sinh hóa q thầy cô tạo điều kiện thuận lợi cho việc hoàn thành luận văn ۞ Thầy hướng dẫn PGS TS Nguyễn Ngọc Hải tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi suốt thời gian thực cơng trình ۞ BGĐ Bệnh viện Từ Dũ, quí thầy Lê Anh Phụng thầy Nguyễn Văn Khanh cô Hồ Thị Nga giúp thực phân tích mẫu thí nghiệm ۞ Sự giúp đỡ PGS TS Dương Thanh Liêm, PGS TS Nguyễn Ngọc Tuân, PGS TS Lâm Thị Thu Hương, TS Lê Anh Phụng, TS Trần Văn Chính, TS Đỗ Hiếu Liêm, TS Nguyễn Tất Toàn, Ths Nguyễn Thị Thu Năm đóng góp nhiều ý kiến q báu cho việc hồn chỉnh luận văn ۞ Các bạn hữu, q đồng nghiệp nhiệt tình giúp đỡ thời gian qua đặc biệt hỗ trợ tận tình Mẹ Huỳnh Thị Nhành với Vợ Võ Thị Cẩm Duyên Con Hồ Ngọc Đại giúp vượt qua nhiều khó khăn để đạt thành ngày hơm Tp HCM, tháng năm Tác giả iv TÓM TẮT Đề tài “Khảo sát tác động vi khuẩn Bacillus subtilis nấm Aspergillus flavus” tiến hành Bộ môn Vi sinh – Truyền nhiễm, khoa Chăn nuôi Thú Y, trường Đại học Nông Lâm Tp HCM từ tháng 03 năm 2009 đến tháng 09 năm 2009 Qua thời gian thực đề tài chúng tơi có kết luận sau: Vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ phân vịt (khoảng 2,5 tháng tuổi) Khảo sát khả ức chế aflatoxin gốc vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ phân vịt: - Trên môi trường thạch nước cốt dừa: sau ngày nuôi cấy chung vi khuẩn Bacillus subtilis nấm mốc Aspergillus flavus, quan sát ánh đèn tia cực tím (bước sóng 365 nm) cho thấy số gốc vi khuẩn Bacillus subtilis có khả ức chế sinh trưởng sinh độc tố aflatoxin nấm mốc Aspergillus flavus - Trên môi trường bắp xay vỡ: sau ngày nuôi cấy chung bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis bào tử nấm mốc Aspergillus flavus, kết cho thấy số gốc Bacillus subtilis có khả làm giảm sản sinh aflatoxin nấm Aspergillus flavus bắp (875 ppb aflatoxin so với mẫu đối chứng 6200 ppb aflatoxin) Thức ăn hỗn hợp gây nhiễm aflatoxin xử lý với vi khuẩn Bacillus subtilis có tỷ lệ gây chết vịt thấp có ý nghĩa so với đối chứng (không xử lý với Bacillus subtilis), %, 3,33 % so với đối chứng 23,33 % Tỷ lệ vịt bệnh mức độ bệnh tích gan giảm rõ rệt lơ xử lý với vi khuẩn Bacillus subtilis so với lô đối chứng v SUMMARY The study “The effects of Bacillus subtilis on Aspergillus flavus” was performed in the Department of Microbiology and Contagious Diseases, Faculty of Veterinary and Animal Sciences, Nong-Lam University Ho Chi Minh City from March 2009 to September 2009 The results showed: - Bacillus subtilis be isolated from feces of ducks at about 2,5 months of age - After days of culturing on coconut juice agar the growth of both Bacillus subtilis and Aspergillus flavus could be observed and aflatoxin production inhibition of Bacillus subtilis to Aspergillus flavus fungus could be detected - On ground maize medium after days of culture some Bacillus subtilis strains might reduce the production of aflatoxin by Aspergillus flavus (6200 ppb aflatoxin in control compared to 875 ppb aflatoxin in the experimental lot) The treatment feed contaminated with aflatoxin with Bacillus subtilis resulted in lower mortality (0 % and 3,33 %) in comparing to the control without Bacillus subtilis treatment (23,33 %) Severity of liver lesions was observed less at lower level among ducks fed with diet treated with Bacillus subtilis than those of the control vi MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG LÝ LỊCH CÁ NHÂN ii LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv TÓM TẮT v SUMMARY vi Chương MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ .1 1.2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU 1.3 YÊU CẦU .2 Chương TỔNG QUAN 2.1 KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 2.1.1 Đặc điểm chung giống Bacillus 2.1.2 Một số đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.2.1 Lịch sử phát .5 2.1.2.2 Đặc điểm phân loại 2.1.2.3 Sự phân bố .5 2.1.2.4 Đặc điểm hình thái 2.1.2.5 Đặc điểm nuôi cấy 2.1.2.6 Đặc điểm sinh hóa 2.1.3 Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis .6 2.1.4 Kháng sinh tổng hợp Bacillus subtilis 2.1.4.1 Peptide antibiotic tổng hợp ribosome 2.1.4.2 Peptide antibiotic không tổng hợp ribosome .9 2.2 KHÁI QUÁT VỀ MYCOTOXIN VÀ AFLATOXIN 2.2.1 Mycotoxin 2.2.2 Aflatoxin 10 vii 2.2.2.1 Các loại độc tố aflatoxin .10 2.2.2.2 Cơ chế gây bệnh aflatoxin 11 2.2.3 Bệnh nhiễm độc AF (Aflatoxicosis) 12 2.2.3.1 Nhiễm độc cấp tính .12 2.2.3.2 Nhiễm độc mãn tính 13 2.2.3.3 Ức chế miễn dịch gây ung thư 14 2.2.4 Các loài nấm mốc sinh độc tố AF 14 2.2.5 Các biện pháp làm giảm độc AF thực liệu .15 2.2.5.1 Phương pháp vật lý học 15 2.2.5.2 Phương pháp hóa học 16 2.2.5.3 Phương pháp sinh vật học .17 2.3 KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA BACILLUS SUBTILIS VỚI NẤM .18 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .20 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 20 3.2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 20 3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .20 3.4 VẬT LIỆU DÙNG CHO THÍ NGHIỆM 21 3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .22 3.5.1 PHÂN LẬP VI KHUẨN B SUBTILIS TỪ PHÂN VỊT 22 3.5.2 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ AF CỦA VI KHUẨN B SUBTILIS LÊN NẤM A FLAVUS TRÊN MÔI TRƯỜNG NƯỚC CỐT DỪA VÀ BẮP 23 3.5.2.1 Khảo sát khả ức chế vi khuẩn B subtilis lên nấm A flavus 23 3.5.2.2 Khảo sát khả ức chế vi khuẩn B subtilis lên nấm A flavus 25 3.5.3 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ LÀM AF CỦA KHUẨN B SUBTILIS 28 3.6 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 300 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 311 4.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP B SUBTILIS TỪ PHÂN VỊT .311 4.1.1 Lựa chọn khuẩn lạc nghi ngờ B subtilis 311 4.1.2 Xác định đặc điểm hình thái vi khuẩn nghi ngờ B subtilis 311 viii used for oral bacteriotherapy and bacterioprophylaxis of gastrointestinal disorders Appl Environ Microbiol 66(12):5241-5247 15 Kimura N., 1990 Bacillus subtilis strain and prevention of aflatoxin contamination in cereals and nuts 16 Klein C and Entian K-D., 1994 Genes involved in self-protection againts the lantibiotic subtilin produced by Bacillus subtilis ATCC 6633 Appl Environ Microbiol 60(8):2793-2801 17 Klein C., Kaletta C and Entian K-D., 1993 Biosynthesis of the lantibiotic subtilin is regulated by a histidine kinase/response regulator system Appl Environ Microbiol 59(1):296-303 18 Koneman E W., Allen S D., Janda W M, Schreckenberger P C and Winn W C., 1997 The aerobic Gram-positive bacilli Color atlas and textbook of diagnostic microbiology pp 657-663 19 Leclère V., Béchet M., Adam A., Guez J-S., Wathelet B., Ongena M., Thonart P., Gancel F., Chollet-Imbert M and Jacques P., 2005 Mycosubtilin overproduction by Bacillus subtilis BBG100 enhances the organism’s antagonistic and biocontrol activities 71(8):4577-4584 58 Appl Environ Microbiol 20 Lin T-P., Chen C-L., Chang L-K., Tschen J S-M and Liu S-T., 1999 Functional and transcriptional analyses of a fengycin synthetase gene, fenC, from Bacillus subtilis J Bacteriol 181(16):5060-5067 21 Nadeem M., Qazi J I, Baig S and Syed Q., 2007 Studies on commercially important alkaline protease from Bacillus lichniformis N-2 isolated from decaying organic soil Turk J Biochem 32 (4):171-177 22 Oancea S and Stoia M., 2008 Mycotoxins: A review of toxicology, analytical methods and health risks Acta Uni Cibi Seri E 12(1):19-36 23 Paik S H, Chakicherla A and Hansen J N., 1998 Identification and characterization of the structural and transporter genes for, and the chemical and biological properties of sublancin 168, a novel lantibiotic produced by Bacillus subtilis 168 J Biol Chemis 273(36):23134-23142 24 Shetty P H., Hald B and Jespersen L., 2007 Surface binding of aflatoxin B1 by Saccharomyces cerevisiae strains with potential decontaminating abilities in indigenous fermented foods Inter J Microbiol 113:41-46 25 Sieber S A and Marahiel M A., 2003 Learning from nature’s drug factories: Nonribosomal synthesis of macrocyclic peptide J Bacteriol 185(24):7036-7034 26 Stein T., Heinzmann S., Dusterhus S., Borchert S and Entian K-D., 2005 Expression and functional analysis of the subtilin immunity genes spaIFEG in the subtilin-sensitive host Bacillus subtilis MO1099 J Bacteriol 187(3):822-828 59 27 Stover A G and Drisk A., 1999 Control of synthesis and secretion of the Bacillus subtilis protein yqxM J Bacteriol 188(22):7065-7069 28 Stover A G and Drisk A., 1999 Regulation of synthesis of the Bacillus subtilis transition-phase, spore-associated antibacterial protein TasA J Bacteriol 181(17):5476-5481 29 Tamehiro N., Hosoya Y O., Okamoto S., Ubukata M., Hamada M., Naganawa H and Ochi K., 2002 Bacilysocin, a novel phospholipid antibiotic produced by Bacillus subtilis 168 Antimicrob Agen Chemother 46(2):315-320 30 Todar K., 2009 The genus Bacillus 31 Vollenbroich D., Pauli G., Ozel M and Vater J., 1997 Antimycoplasma properties and application in cell culture of surfactin, a lipopeptide antibiotic from Bacillus subtilis Appl Environ Microbiol 63(1):44-49 32 Widner W., 2006 Bacillus expression host 2006.ppt 33 Zheng G., Hehn R and Zuber P., 2000 Mutational analysis of the sbo-alb locus of Bacillus subtilis: Identification of genes required for subtilosin production and immunity J Bacteriol 182(11):3266-3273 60 PHỤ LỤC PHỤ LỤC KẾT QUẢ THỬ PHẢN ỨNG SINH HÓA CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN B SUBTILIS PHÂN LẬP ĐƯỢC Chủng phân lập Các phản ứng sinh hóa Catalase Lecithinase Nitrate VP Citrate Maltose 01 + – + + + – 02 + – + + + – 03 + – + + + – 04 + – + + + – 05 + – + + + – 06 + – + + + – 07 + – + + + – 08 + – + + + – 09 + – + + + – 10 + – + + + – 11 + – + + + – 12 + – + + + – 13 + – + + + – 14 + – + + + – 15 + – + + + – 16 + – + + + – 17 + – + + + – 18 + – + + + – 19 + – + + + – 20 + – + + + – 61 PHỤ LỤC CÁC TRƯỜNG HỢP VỊT CHẾT DO NHIỄM ĐỘC AF Chỉ tiêu khảo sát Stt Ngày (ký hiệu mẫu) chết Gan nhạt màu Hoại tử Xuất huyết Gan bở Túi mật 01 (AIIC1) 17/09/09 1 sưng 02 (AIIC2) 18/09/09 1 sưng 03 (BIIC1) 18/09/09 1 sưng 04 (BIIC2) 18/09/09 1 sưng 05 (BIIC3) 19/09/09 1 sưng 06 (CIIC1 19/09/09 1 sưng 07 (CIIC2) 19/09/09 1 sưng 08 (BIVC1) 20/09/09 0 sưng Ghi chú: (1): có; (0): khơng có, (A, B, C): tương ứng thí nghiệm lần 1, 2, 3; (II): lơ 2; (IV): lô 4; (C): chết; (1, 2, 3): tương ứng số 1, 2, PHỤ LỤC KẾT QUẢ MỔ KHẢO SÁT VỊT SỐNG (2 tuần tuổi – 20/09/09) Chỉ tiêu khảo sát Stt (ký hiệu mẫu) Gan nhạt màu Gan hoại tử Gan xuất huyết Gan bở Túi mật 01 (AIS1) 0 0 bình thường 02 (AIS2) 0 0 bình thường 03 (AIIS1) 1 sưng 04 (AIIS2) 0 bình thường 05 (AIIIS1) 0 0 bình thường 06 (AIIIS2) 0 0 bình thường 07 (AIVS1) 0 0 sưng 08 (AIVS2) 0 0 sưng 09 (BIS1) 0 0 bình thường 10 (BIS2) 0 0 bình thường 11 (BIIS1) 0 sưng 12 (BIIS2) 0 bình thường 62 Chỉ tiêu khảo sát Stt (ký hiệu mẫu) Gan nhạt màu Gan hoại tử Gan xuất huyết Gan bở Túi mật 13 (BIIIS1) 0 0 bình thường 14 (BIIIS2) 0 0 sưng 15 (BIVS1) 0 0 bình thường 16 (BIVS2) 0 0 bình thường 17 (CIS1) 0 0 bình thường 18 (CIS2) 0 0 bình thường 19 (CIIS1) 0 sưng 20 (CIIS2) 0 0 sưng 21 (CIIIS1) 0 0 sưng 22 (CIIIS2) 0 0 sưng 23 (CIVS1) 0 0 bình thường 24 (CIVS2) 0 0 sưng Ghi chú: (1): có; (0): khơng có, (A, B, C): tương ứng thí nghiệm lần 1, 2, 3; (I): lô 1; (II): lô 2; (III): lô 3; (IV): lô 4; (S): sống; (1, 2): tương ứng số 1, PHỤ LỤC KẾT QUẢ ĐỌC MẪU BỆNH TÍCH VI THỂ (gan vịt) Stt Ký hiệu mẫu 01 Chỉ tiêu THM Hoại tử TBG TS ODM TS MLK AIS1 + ± ± – 02 AIS2 + ± ± – 03 AIIS1 ++ +++ ++++ ++ 04 AIIS2 ++ +++ ++++ +++ 05 AIIIS1 + + ++ + 06 AIIIS2 + ± ++ + 07 AIVS1 + + + + 08 AIVS2 + + ++ + 09 BIS1 + ± ± – 63 Stt Ký hiệu mẫu 10 Chỉ tiêu THM Hoại tử TBG TS ODM TS MLK BIS2 + ± ± – 11 BIIS1 ++ ++ +++ ++ 12 BIIS2 ++ +++ +++ ++ 13 BIIIS1 + + + + 14 BIIIS2 + + ++ + 15 BIVS1 + + + + 16 BIVS2 + + ++ + 17 CIS1 + + ± – 18 CIS2 + + ± – 19 CIIS1 ++ +++ ++++ ++ 20 CIIS2 ++ +++ +++ ++ 21 CIIIS1 + + + + 22 CIIIS2 + + ++ ++ 23 CIVS1 ± + + + 24 CIVS2 ± + + + 25 AIIC1 ++++ +++ +++ ++ 26 AIIC2 ++++ +++ +++ ++ 27 BIIC1 ++++ +++ +++ ++ 28 BIIC2 ++++ +++ +++ ++ 29 BIIC3 ++++ +++ +++ ++ 30 BIVC1 ++++ +++ ++ ++ 31 CIIC1 ++++ +++ +++ ++ 32 CIIC2 ++++ +++ +++ ++ Ghi chú: THM: thối hóa mỡ, TBG: tế bào gan, TS ODM: tăng sinh ống dẫn mật, TS MLK: tăng sinh mơ liên kết, (±): bệnh tích khơng rõ, (–): khơng có bệnh tích; (+): bệnh tích nhẹ, (++): bệnh tích trung bình; (+++): bệnh tích nặng; (++++): bệnh tích nặng 64 PHỤ LỤC THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG TĂHH CHO VỊT (Lô I, II, III, IV) Thành phần Tỷ lệ (%) Độ ẩm tối đa 14 Protein tối thiểu 18 Xơ tối thiểu 6,0 Canxi (tối thiểu – tối đa) 0,8 – 1,2 Muối (tối thiểu – tối đa) 0,2 – 0,4 Phospho tối thiểu 0,5 Năng lượng trao đổi tối thiểu 2800 (Kcal/kg) Kháng sinh, dược liệu Hormone khơng có Ghi chú: TĂHH mua Công ty trách nhiệm hữu hạn Uni-President Việt Nam, số 16-18 đường ĐT 743 – KCN Sóng Thần II – huyện Dĩ An – tỉnh Bình Dương, ĐT: (84-650) 3790811 – – Fax: (84-650) 3790810 PHỤ LỤC KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ * Chi-Square Test: Sống, Chết (tỷ lệ sống, chết) Expected counts are printed below observed counts Song Chet Total 30 30 28.00 2.00 23 30 28.00 2.00 30 30 28.00 2.00 29 30 28.00 2.00 Total 112 120 Chi-Sq = 0.143 + 2.000 + 0.893 + 12.500 + 0.143 + 2.000 + 0.036 + 0.500 = 18.214 DF = 3, P-Value = 0.000 cells with expected counts less than 5.0 * Chi-Square Test: Sống, Chết (lô I – lô II) Expected counts are printed below observed counts Song Chet Total 30 30 26.50 3.50 23 30 26.50 3.50 Total 53 60 Chi-Sq = 0.462 + 3.500 + 0.462 + 3.500 = 7.925 DF = 1, P-Value = 0.005 cells with expected counts less than 5.0 65 * Chi-Square Test: Sống, Chết (lô II – lô III) Expected counts are printed below observed counts Song Chet Total 23 30 26.50 3.50 30 30 26.50 3.50 Total 53 60 Chi-Sq = 0.462 + 3.500 + 0.462 + 3.500 = 7.925 DF = 1, P-Value = 0.005 cells with expected counts less than 5.0 * Chi-Square Test: Sống, Chết (lô II – lô IV) Expected counts are printed below observed counts Song Chet Total 23 30 26.00 4.00 29 30 26.00 4.00 Total 52 60 Chi-Sq = 0.346 + 2.250 + 0.346 + 2.250 = 5.192 DF = 1, P-Value = 0.023 cells with expected counts less than 5.0 * Chi-Square Test: Bệnh, Không bệnh (tỷ lệ bệnh) Expected counts are printed below observed counts Benh Khong be Total 30 30 2.75 27.25 10 20 30 2.75 27.25 30 30 2.75 27.25 29 30 2.75 27.25 Total 11 109 120 Chi-Sq = 2.750 + 0.278 + 19.114 + 1.929 + 2.750 + 0.278 + 1.114 + 0.112 = 28.324 DF = 3, P-Value = 0.000 cells with expected counts less than 5.0 * Chi-Square Test: Bệnh, Không bệnh (lô I – lô II) Expected counts are printed below observed counts Benh Khong be Total 30 30 5.00 25.00 10 20 30 5.00 25.00 Total 10 50 60 Chi-Sq = 5.000 + 1.000 + 5.000 + 1.000 = 12.000 DF = 1, P-Value = 0.001 66 * Chi-Square Test: Bệnh, Không bệnh (lô II – lô III) Expected counts are printed below observed counts Benh Khong be Total 10 20 30 5.00 25.00 30 30 5.00 25.00 Total 10 50 60 Chi-Sq = 5.000 + 1.000 + 5.000 + 1.000 = 12.000 DF = 1, P-Value = 0.001 * Chi-Square Test: Bệnh, Không bệnh (lô II – lô IV) Expected counts are printed below observed counts Benh Khong be Total 10 20 30 5.50 24.50 29 30 5.50 24.50 Total 11 49 60 Chi-Sq = 3.682 + 0.827 + 3.682 + 0.827 = 9.017 DF = 1, P-Value = 0.003 * One-way ANOVA: Hồng cầu versus Lô Analysis of Variance for Hong cau Source DF SS MS F P Lo 1.144 0.381 2.34 0.083 Error 56 9.110 0.163 Total 59 10.254 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev + -+ -+ -+-1 15 2.2033 0.3407 ( -* -) 15 1.8753 0.4134 ( -* -) 15 2.1760 0.3316 ( -* -) 15 1.9693 0.5037 ( * -) + -+ -+ -+-Pooled StDev = 0.4033 1.75 2.00 2.25 2.50 Tukey's pairwise comparisons Family error rate = 0.0500 Individual error rate = 0.0106 Critical value = 3.74 Intervals for (column level mean) - (row level mean) -0.0615 0.7175 -0.3621 -0.6901 0.4168 0.0888 -0.1555 -0.4835 -0.1828 0.6235 0.2955 0.5961 67 * One-way ANOVA: Bạch cầu versus Lô Analysis of Variance for Bach cau Source DF SS MS F P Lo 101.0 33.7 0.43 0.734 Error 56 4405.3 78.7 Total 59 4506.3 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev + -+ -+ -+ -1 15 25.067 7.778 ( * ) 15 27.867 6.209 ( * ) 15 28.267 9.765 ( * ) 15 26.133 10.967 ( * ) + -+ -+ -+ -Pooled StDev = 8.869 21.0 24.5 28.0 31.5 Tukey's pairwise comparisons Family error rate = 0.0500 Individual error rate = 0.0106 Critical value = 3.74 Intervals for (column level mean) - (row level mean) -11.365 5.765 -11.765 -8.965 5.365 8.165 -9.632 -6.832 -6.432 7.498 10.298 10.698 * One-way ANOVA: Haemoglobin versus Lô Analysis of Variance for Haemoglo Source DF SS MS F P Lo 25.58 8.53 3.46 0.022 Error 56 138.00 2.46 Total 59 163.58 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev + -+ -+ -1 15 12.600 1.172 ( -* -) 15 10.833 1.735 ( -* -) 15 11.380 1.388 ( -* -) 15 11.300 1.883 ( -* -) + -+ -+ -Pooled StDev = 1.570 11.0 12.0 13.0 Tukey's pairwise comparisons Family error rate = 0.0500 Individual error rate = 0.0106 Critical value = 3.74 Intervals for (column level mean) - (row level mean) 0.251 3.283 -0.296 -2.063 2.736 0.969 -0.216 -1.983 -1.436 2.816 1.049 1.596 68 * One-way ANOVA: Bạch cầu toan versus Lô Analysis of Variance for Ai toan Source DF SS MS F P Lo 789 263 2.37 0.080 Error 56 6202 111 Total 59 6991 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev + -+ -+ -+-1 15 15.33 8.91 ( -* ) 15 24.87 13.21 ( * -) 15 18.67 8.52 ( * ) 15 22.40 10.80 ( * ) + -+ -+ -+-Pooled StDev = 10.52 12.0 18.0 24.0 30.0 Tukey's pairwise comparisons Family error rate = 0.0500 Individual error rate = 0.0106 Critical value = 3.74 Intervals for (column level mean) - (row level mean) -19.70 0.63 -13.50 -3.96 6.83 16.36 -17.23 -7.70 -13.90 3.10 12.63 6.43 * One-way ANOVA: Bạch cầu kiềm versus Lô Analysis of Variance for Ai kiem Source DF SS MS F P Lo 6.53 2.18 1.01 0.397 Error 56 121.20 2.16 Total 59 127.73 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+ -+ -+ -+ 15 2.267 2.187 ( -* ) 15 1.733 1.100 ( * ) 15 1.400 1.056 ( * ) 15 1.533 1.246 ( * ) -+ -+ -+ -+ Pooled StDev = 1.471 0.70 1.40 2.10 2.80 Tukey's pairwise comparisons Family error rate = 0.0500 Individual error rate = 0.0106 Critical value = 3.74 Intervals for (column level mean) - (row level mean) -0.887 1.954 -0.554 -1.087 2.287 1.754 -0.687 -1.221 -1.554 2.154 1.621 1.287 69 * One-way ANOVA: Bạch cầu trung tính versus Lơ Analysis of Variance for Trung tinh Source DF SS MS F P Lo 432 144 1.25 0.301 Error 56 6462 115 Total 59 6894 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+ -+ -+ -+ 15 35.33 16.50 ( * ) 15 35.53 7.75 ( * ) 15 30.73 6.98 ( * -) 15 29.53 8.97 ( * ) -+ -+ -+ -+ Pooled StDev = 10.74 25.0 30.0 35.0 40.0 Tukey's pairwise comparisons Family error rate = 0.0500 Individual error rate = 0.0106 Critical value = 3.74 Intervals for (column level mean) - (row level mean) -10.57 10.17 -5.77 -5.57 14.97 15.17 -4.57 -4.37 -9.17 16.17 16.37 11.57 * One-way ANOVA: Lâm ba cầu versus Lô Analysis of Variance for Lam ba cau Source DF SS MS F P Lo 145.0 48.3 0.51 0.679 Error 56 5335.2 95.3 Total 59 5480.2 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+ -+ -+ -+ 15 42.733 12.770 ( * -) 15 39.933 6.552 ( * -) 15 42.200 8.744 ( * -) 15 44.267 9.932 ( * -) -+ -+ -+ -+ Pooled StDev = 9.761 36.0 40.0 44.0 48.0 Tukey's pairwise comparisons Family error rate = 0.0500 Individual error rate = 0.0106 Critical value = 3.74 Intervals for (column level mean) - (row level mean) -6.626 12.226 -8.892 -11.692 9.959 7.159 -10.959 -13.759 -11.492 7.892 5.092 7.359 70 * One-way ANOVA: Bạch cầu đơn nhân versus Lô Analysis of Variance for Don nhan Source DF SS MS F P Lo 45.6 15.2 0.91 0.444 Error 56 941.2 16.8 Total 59 986.9 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+ -+ -+ -+ 15 8.000 4.440 ( * ) 15 9.533 4.155 ( * -) 15 10.133 3.944 ( * -) 15 10.133 3.833 ( * -) -+ -+ -+ -+ Pooled StDev = 4.100 6.0 8.0 10.0 12.0 Tukey's pairwise comparisons Family error rate = 0.0500 Individual error rate = 0.0106 Critical value = 3.74 Intervals for (column level mean) - (row level mean) -5.492 2.426 -6.092 -4.559 1.826 3.359 -6.092 -4.559 -3.959 1.826 3.359 3.959 * Descriptive Statistics: Hồng cầu by Lô Variable Hong cau Variable Hong cau Lo N Mean Median TrMean StDev 15 2.2033 2.1300 2.1892 0.3407 15 1.875 1.900 1.875 0.413 15 2.1760 2.0200 2.1469 0.3316 15 1.969 1.890 2.023 0.504 Lo SE Mean Minimum Maximum Q1 Q3 0.0880 1.6900 2.9000 1.9600 2.3600 0.107 0.910 2.840 1.680 2.070 0.0856 1.8200 2.9100 1.9300 2.5200 0.130 0.550 2.690 1.780 2.400 * Descriptive Statistics: Bạch cầu by Lô Variable Bach cau Variable Bach cau Lo Lo N Mean Median TrMean StDev 15 25.07 24.00 25.08 7.78 15 27.87 30.00 28.15 6.21 15 28.27 26.00 27.69 9.76 15 26.13 20.00 25.69 10.97 SE Mean Minimum Maximum Q1 Q3 2.01 12.00 38.00 20.00 30.00 1.60 16.00 36.00 22.00 32.00 2.52 14.00 50.00 18.00 36.00 2.83 14.00 44.00 16.00 38.00 * Descriptive Statistics: Haemoglobin by Lô Variable Haemoglo Variable Haemoglo Lo Lo N Mean Median TrMean StDev 15 12.600 12.400 12.646 1.172 15 10.833 11.100 10.731 1.735 15 11.380 11.800 11.446 1.388 15 11.300 11.400 11.238 1.883 SE Mean Minimum Maximum Q1 Q3 0.303 10.400 14.200 11.800 14.000 0.448 8.000 15.000 9.000 11.800 0.358 8.600 13.300 10.400 12.800 0.486 8.200 15.200 9.600 12.700 71 * Descriptive Statistics: Bạch cầu toan by Lô Variable Lo Ai toan Variable Lo Ai toan N Mean Median TrMean StDev 15.33 12.00 14.85 8.91 15 24.87 23.00 24.85 13.21 15 18.67 17.00 17.92 8.52 15 22.40 19.00 22.54 10.80 SE Mean Minimum Maximum Q1 Q3 2.30 2.00 35.00 10.00 24.00 3.41 3.00 47.00 14.00 37.00 2.20 8.00 39.00 12.00 23.00 2.79 6.00 37.00 14.00 34.00 15 * Descriptive Statistics: Bạch cầu kiềm by Lô Variable Lo Ai kiem Variable Lo Ai kiem N Mean Median TrMean StDev 2.267 2.000 2.000 2.187 15 1.733 2.000 1.692 1.100 15 1.400 1.000 1.308 1.056 15 1.533 1.000 1.462 1.246 SE Mean Minimum Maximum Q1 Q3 0.565 0.000 8.000 1.000 4.000 0.284 0.000 4.000 1.000 2.000 0.273 0.000 4.000 1.000 2.000 0.322 0.000 4.000 1.000 2.000 15 * Descriptive Statistics: Bạch cầu trung tính by Lơ Variable Trung ti Variable Trung ti Lo Lo N Mean Median TrMean StDev 15 35.33 27.00 34.00 16.50 15 35.53 36.00 35.54 7.75 15 30.73 32.00 30.38 6.98 15 29.53 30.00 29.00 8.97 SE Mean Minimum Maximum Q1 Q3 4.26 20.00 68.00 24.00 50.00 2.00 23.00 48.00 28.00 41.00 1.80 20.00 46.00 25.00 34.00 2.32 15.00 51.00 23.00 35.00 * Descriptive Statistics: Lâm ba cầu by Lô Variable Lo Lam ba Variable Lo Lam ba N Mean Median TrMean StDev 42.73 46.00 43.38 12.77 15 39.93 39.00 39.92 6.55 15 42.20 45.00 42.46 8.74 15 44.27 45.00 44.08 9.93 SE Mean Minimum Maximum Q1 Q3 3.30 15.00 62.00 36.00 52.00 1.69 29.00 51.00 35.00 46.00 2.26 23.00 58.00 39.00 47.00 2.56 23.00 68.00 38.00 49.00 15 * Descriptive Statistics: Bạch cầu đơn nhân by Lô Variable Don nhan Variable Don nhan Lo Lo N Mean Median TrMean StDev 15 8.00 9.00 7.85 4.44 15 9.53 9.00 9.38 4.16 15 10.13 10.00 9.85 3.94 15 10.133 11.000 10.000 3.833 SE Mean Minimum Maximum Q1 Q3 1.15 1.00 17.00 6.00 10.00 1.07 3.00 18.00 6.00 12.00 1.02 5.00 19.00 7.00 12.00 0.990 3.000 19.000 8.000 12.000 72 ... THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Hướng dẫn Khoa học: PGS TS NGUYỄN NGỌC HẢI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 07/2010 KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỐI VỚI NẤM ASPERGILLUS FLAVUS HỒ VĂN... ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH **************** HỒ VĂN ÚT HẬU KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỐI VỚI NẤM ASPERGILLUS FLAVUS Chuyên ngành: Thú y Mã số : TY2007012 LUẬN VĂN THẠC... Để làm rõ vấn đề trên, thực đề tài “KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỐI VỚI NẤM ASPERGILLUS FLAVUS Sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis (B subtilis) giải pháp nhằm làm giảm khả