Bai giang Cong nghe enzyme

Trường Cao Đẳng Kinh tế Công nghệ TPHCM Khoa Công nghệ Sinh học ************************** HIAST CÔ NG NG H Ệ E NZ YM E (Tài liệu lưu hành nội bộ) CBDG: ThS Lê Thanh Hải TPHCM, 03/2013 i CÔNG NGHỆ ENZYME MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1.1 Lịch sử nghiên cứu phát triển công nghệ enzyme 1.2 Khái niệm enzyme 1.2.1 Bản chất sinh học enzyme 1.2.2 Bản chất hóa học enzyme 1.2.3 Cấu trúc enzyme 1.3 Cơ chế tác dụng enzyme 1.3.1 Cơ chế xúc tác enzyme 1.3.2 Năng lượng xúc tác 1.3.3 Sự tạo thành phức hợp enzyme – chất 1.3.4 Động học phản ứng enzyme 1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng enzyme 10 1.3.5.1 Nhiệt độ 10 1.3.5.2 pH 11 1.3.5.3 Chất kìm hãm 11 1.3.5.4 Chất hoạt hóa 12 1.3.6 1.4 Phân loại enzyme 13 1.4.1 Danh pháp quốc tế enzyme 13 1.4.2 Phân loại enzyme 14 1.5 1.4.2.1 Oxydoreductase 14 1.4.2.2 Transpherase 14 1.4.2.3 Hydrolase 15 1.4.2.4 Lipase 15 1.4.2.5 Isomerase 15 1.4.2.6 Ligase 15 Phương pháp tách làm enzyme 15 1.5.1 Các phương pháp phá vỡ tế bào 15 1.5.2 Phương pháp gây biến tính chọn lọc 16 1.6 Tính chất đặc hiệu enzyme 13 Phương pháp xác định khả xúc tác enzyme 17 1.6.1 Các nhóm phương pháp xác định khả xúc tác E 17 1.6.2 Đơn vị hoạt độ 17 KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG CÔNG NGHỆ ENZYME 18 2.1 Ý nghĩa kỹ thuật tinh công nghệ enzyme 18 CÔNG NGHỆ ENZYME 2.2 Các phương pháp học tách enzyme 19 2.2.2 Các phương pháp phá vỡ tế bào sinh vật 19 2.2.2.1 Phá vỡ tế bào phương pháp học: 20 2.2.2.2 Phá vỡ tế bào phương pháp học: 20 2.2.2.3 Các phương pháp cô đặc 21 2.2.2.4 Các phương pháp tinh enzyme 21 2.2.2.5 Tạo sản phẩm enzyme 21 ENZYME CỐ ĐỊNH 22 Chuyển hóa sinh học 22 3.1.1 Chuyển hóa vật chất enzyme tự hay enzyme hịa tan 22 3.1.2 Chuyển hóa vật chất enzyme khơng hịa tan 22 3.1.3 Chuyển hóa vật chất trình lên men 23 3.1.4 Chuyển hóa vật chất tế bào cố định 23 3.2 Đặc điểm enzyme cố định 23 3.3 Phương pháp tạo enzyme cố định 23 3.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme cố định 23 3.3.2 Phương pháp cố định enzyme 25 3.4 Kỹ thuật 19 2.2.1 3.1 ii 3.3.2.1 Chất mang dùng để cố định enzyme 25 3.3.2.2 Phương pháp cố định enzyme 25 Ứng dụng enzyme cố định 26 3.4.1 Sản xuất fructose nhờ enzyme glucose isomerase 27 3.4.2 Sản xuất L-amino acid nhờ enzyme aminoacylase cố định 28 THU NHẬN ENZYME 28 4.1 Chọn nguồn nguyên liệu 28 4.2 Thu nhận enzyme 31 ỨNG DỤNG CỦA ENZYME 32 5.1 Tình hình ứng dụng enzyme công nghiệp giới 32 5.2 Ứng dụng y học 34 5.3 Ứng dụng hóa học 34 5.4 Ứng dụng công nghiệp 34 5.4.1 Ứng dụng công nghiệp thực phẩm 34 5.4.2 Ứng dụng công nghiệp dệt 36 5.4.3 Ứng dụng công nghiệp thuộc da 36 5.5 Ứng dụng nông nghiệp 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 CÔNG NGHỆ ENZYME MỞ ĐẦU 1.1 Lịch sử nghiên cứu phát triển công nghệ enzyme Enzyme học môn học nghiên cứu vật chất phân tử có hoạt tính sinh học Mơn học phát triển mạnh nhờ thành tựu mơn hóa sinh học, vi sinh vật học, di truyền học tiến ngành hóa học vật lý học Bảng 1.1 Những cột mốc quan trọng nghiên cứu phát triển môn enzyme học[2] STT Năm Nội dung nghiên cứu, phát triển 1833 Payen Persoz tách diastase từ malt 1874 Hansen người tách rennet từ bao tử cừu 1876 Kiihne người đề nghị gọi chất xúc tác sinh học enzyme 1897 Hai anh em nhà Buchner chứng minh dịch chiết từ nấm men chuyển hóa đường glucose thành cồn CO2 1900 Rohm sử dụng enzyme protease công nghệ thuộc da 1913 Rohm người sử dụng enzyme chất tẩy rửa 1917 Boidin Effront nghiên cứu α-amylase B.subtilis ứng dụng ngành dệt 1920 – 1928 Will Slitter tinh enyzme 1926 10 1928 Fleming phát penicilline 11 Thế chiến II Bắt đầu sản xuất kháng sinh theo mơ hình cơng nghiệp, sử dụng amyloglucosidase đường hóa tinh bột Sử dụng penicillineacylase sản xuất penicilline 12 1969 Tanabec co xây dựng quy trình cơng nghiệp sản xuất amino acid Sử dụng glucose isomerase sản xuất dịch đường giàu fructose Samner kết tinh enyme urease Northrop kết tinh protease CÔNG NGHỆ ENZYME Boyer et al đưa kỹ thuật di truyền Kỹ thuật có tác động tích cực cơng nghệ enzyme 13 1972 14 1973 15 1984 Nito xác lập trình tạo acrylamide loại q trình sản xuất có tham gia enzyme 16 1984 - Đã phát hàng trăm loại enzyme khác nhau, đưa vào sản xuất công nghiệp ứng dụng rộng rãi enzyme sản xuất đời sống kỹ thuật enzyme cố định, tế bào cố định đưa công nghệ enzyme đạt nhiều kết cao Tanobe co sản xuất aspartic acid lên men cố định tế bào Winter Ferch đưa công nghệ sản xuất protein Diastase: enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân tinh bột thành maltose Diastase enzyme phát Nó chiết tách từ malt vào năm 1833 Anselme Payen Jean-Francois Persoz – nhà Hóa học nhà máy đường Pháp Tên “diastase” xuất phát từ tiếng Hy Lạp (diastasis), dịch nha nóng, enzyme thủy phân tinh bột hạt đại mạch thành đường hòa tan tách phần bỏ malt với phần lại hạt Ngày nay, diastase α, β γ-amylase Rennet enzyme sản xuất dày động vật có vú cịn giai đoạn bú sữa mẹ thường sử dụng để làm phomai Rennet hỗn hợp enzyme, bao gồm: enzyme thủy phân protein (protease) gây đông tụ sữa, tách phần sữa đơng (phần chất rắn) phần huyết sữa (phần chất lỏng) Những enzyme hoạt động dày bê gọi chymosin rennin Ngồi ra, có enzyme quan trọng khác như: pepsin lipase Protease: (còn gọi peptidase proteinase) enzyme thủy phân protein α-amylase enzyme thủy phân liên kết alpha phân tử polysaccharide tinh bột glycogen thành glucose maltose Alpha amylase tìm thấy chủ yếu người động vật có vú khác, ngồi ra, chúng cịn có mặt loại hạt có chứa tinh bột tiết số loại nấm Urease: enzyme xúc tác phản ứng thủy phân ure thành carbon dioxide (CO2) amoniac (NH3), diện vi khuẩn đường ruột Urease tìm thấy vi khuẩn, nấm men thực vật 1.2 Khái niệm enzyme Sinh vật phân nhóm dựa vào cấu tạo thể chúng: sinh vật đơn bào sinh vật đa bào Mặc dù chúng có khác biệt lớn cấu tạo thể đặc điểm sinh lý khác chúng giống trao đổi chất với mơi trường bên ngồi số đặc điểm biến dị di truyền Sinh vật xem hệ thống mở có liên quan chặt chẽ đến trình trao đổi chất thể tế bào tế bào với mơi trường ngồi Q trình trao đổi chất bên tế bào tế bào với môi trường bên biểu sinh động sống Sự khác tế bào sống vật chất khơng phải sống khả trao đổi chất Khi thể khơng cịn khả trao đổi chất thể chết Do mối quan hệ giữ thể với bên mối quan hệ hữu Quá trình trao đổi chất bao gồm q trình dị hóa q trình đồng hóa Q trình dị hóa q trình phân giải vật chất để cung cấp cho tế bào lượng vật liệu xây dựng tế bào, trình xảy tế bào ngồi tế bào Q trình di hóa xảy tế bào trình cung cấp lượng, vật chất cho trình tổng hợp vật chất để tạo sinh khối nhằm làm đổi vật chất tế bào Quá trình dị hóa ngồi tế bào phần lớn đáp ứng cầu vật chất, giúp cho tế bào tổng hợp chất tế bào Năng lượng tạo từ q trình dị hóa ngồi tế bào thường giải phóng dạng nhiệt CƠNG NGHỆ ENZYME Quá trình tổng hợp vật chấtt cho ttế bào xảy tế bào Quá trình thư ường phải thu nhận lượng từ phản ứng ng q trình ddị hóa Như vậy, q trình trao đổi chất đượcc xem hệ h thống mở sinh vật môi trường ng xung quanh Hình 1.1 Hệ thống mở tế bào sinh vật Sản phẩm trình trao đổii ch chất tạo dạng sản phẩm:
Sản phẩm bậc
Sản phẩm bậc m đư tạo trình phân giải trình tổng t hợp Sản phẩm bậc 1: sản phẩm Các sản phẩm đượcc tham gia tr trực tiếp nên vật chất tế bào tham gia các trình tế t bào Sản phẩm bậc 2: sản phẩm m ccũng tạo từ trình tổng hợp trình phân giải gi tế bào Trong trình tổng hợp, p, m số vật chất tạo o khơng tham gia vào q trình trao đổi chất mà thoát khỏi tế bào Hi Hiện tượng coi trình sinh tổng ng hợp h thừa Hiện tượng sinh tổng hợp thừa có liên quan ch chặt chẽ đến hệ di truyền có tế bào Do đó, việc vi điều chỉnh hệ di truyền, nhiều điều chỉnh hệ gen ssẽ thu lượng lớn sản phẩm sinh tổng ng hợp h thừa Môi số vật chất tạoo q trình phân gi giải khơng tham gia vào q trình trao đổii chất ch nằm ngồi tế bào (q trình dị hóa ngồi tế bào) M Một số vật chất khác thoát khỏi tế bào vào mơi trường trư (q trình trình dị hóa tế bào) Quá trình trao đổi chất liên tụcc đư xảy tế bào, tạo nên biến đổi liên tục vật chấtt thiên nhiên Q trình chuy chuyển hóa theo đường sinh vật đóng vai trị ị r quan trọng nhiều chu trình chuyểnn hóa ch chất có thiên nhiên Các phản ứng sinh họ ọc xảy thường xuyên không tế bào sinh vậtt mà ccả ngồi mơi trường, bao quanh tế bào Các phản ph ứng sinh học xúc tác loạii protein đđặc biệt gọii enzyme Các enzyme tham gia phản ph ứng tế bào gọi enzyme ngoạii bào Các enzyme th thực tế bào gọii enzyme enzym nội bào Cả enzyme nội bào enzyne ngoại bào đềuu đư tổng hợp tế bào 1.2.1 Bản chất sinh học củaa enzyme Nhiều nhà khoa học nghiên ứu enzyme đến thống nhất: enzyme m loại protein sinh vật sống tổng hợpp nên tham gia vào cá phản ứng sinh học Như vậy, chất sinh học củaa enzyme ssản phẩm trình sinh họcc thực th phản ứng sinh hóa ngồi tế bào sinh vvật Các loại enzyme có đặcc tính chung sau:
Enzyme tạo tếế bào sinh vật: trình tổng hợp enzyme mộtt trình hết h sức phức tạp điều khiển, kiểm m soát rrất chặt chẽ
Enzyme tham gia phản ứng ng ccả tế bào sống enzyme đượcc tách khỏi kh tế bào sống
Enzyme tham gia phản ứng ng điều kiện nhiệt độ ôn hịa Vìì q trình sống s tế bào, enzyme tổng hợpp ho hoạt động điều kiện nhiệt độ tế bào nhiệt nhi độ thể Nhiệt độ thể tế bào sinh vvật thường nhiệt độ thấp Phần lớn nhiệtt độ đ thể sinh vật dao động khoảng 30 - 40oC CÔNG NGHỆ ENZYME
Enzyme tham gia xúc tác phản ứng thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hồn tồn lượng dự trữ hợp chất hóa học Q trình chuyển hóa thực theo chuỗi phản ứng, phản ứng xúc tác loại enzyme Các enzyme thay xúc tác để phản ứng xảy ra, để cuối tạo thành CO2, H2O, số chất khác giải phóng lượng Cũng chuỗi phản ứng tạo thành chu kỳ chuyển hóa khép kín Trong chuỗi chuyển hóa hở hay chuỗi chuyển hóa khép kín, sản phẩm phản ứng trước chất cho phản ứng sau
Enzyme thực phản ứng: Các phản ứng thường xảy tế bào (khi ta thực chúng ống nghiệm) Trong tế bào thường không xảy phản ứng enzyme đơn (một phản ứng) mà thường xảy phản ứng theo chuỗi phản ứng
Phản ứng enzyme phản ứng tiêu hao lượng Trong đó, phản ứng hóa học xúc tác vởi chất xúc tác hóa học địi hỏi lượng lớn Nhờ có hoạt động xúc tác enzyme, phản ứng sinh hóa xảy liên tục điều kiện lượng ơn hịa
Enzyme chịu điều khiển gen điều kiện phản ứng Gen định tổng hợp loại enzyme Mỗi enzyme định phản ứng sinh hóa Các nhà khoa học đưa chế sau: Một gen => enzyme => phản ứng Như vậy, gen định chất sinh học chất hóa học enzyme Cơ chế có ý nghĩa lớn việc điều khiển tổng hợp enzyme tế bào sinh vật 1.2.2 Bản chất hóa học enzyme Nếu tách enzyme khỏi tế bào tiến hành phân tách thành phần hóa học chúng, ta thấy chúng thuộc nhóm: Nhóm enzyme đơn cấu tử: Thuộc nhóm bao gồm enzyme cấu tạo thành phần hóa học protein Những enzyme tạo thành từ protein gọi enzyme đơn cấu tử Nhóm enzyme đa cấu tử Thuộc nhóm bao gồm enzyme có thành phần:
Apoprotein hay apoenzyme: Phần protein
Agon: Phần thứ thành phần protein Phần thường chất hữu đặc hiệu có vai trị thúc đẩy q trình xúc tác Ở enzyme đa cấu tử, phần apoenzyme đóng vai trị xúc tác thiếu thành phần thứ hai (các chất hữu có đặc hiệu) enzyme khơng thể hoạt động Chính thế, chất hữu đặc hiệu gọi chất cộng tác (cofactor) Các chất hữu đặc hiệu gắn chặt với phần protein, gắn lỏng với phần protein Ta dễ dàng tách chúng tiến hành thẩm tích qua màng Ở xảy tượng:
Những chất hữu đặc hiệu gắn chặt với protein liên kết đồng hóa trị gọi nhóm phụ (prosthetic)
Những chất hữu đặc hiệu gắn không chặt với protein dễ dàng tách chúng khỏi protein gọi coenzyme Tuy nhiên, phân biệt mang tính chất tương đối Ngồi nhà khoa học cho thấy, thành phần enzyme có diện số kim loại Các kim loại thường thành phần chất hữu đặc hiệu Ví dụ: hệ enzyme cytochrome, catalase, peroxydase, sắt (Fe) gắn chặt với nhân porphyrin Các kim loại có thành phần enzyme thường dễ tách khỏi enzyme Trong trường hợp enzyme kim loại, chúng hoạt tính Khi ta đưa kim loại tương ứng vào enzyme, hoạt tính enzyme lại khơi phục Tính chất mang tính chất thuận nghịch Vai trị kim loại hoạt động enzyme chưa làm sáng tỏ Tuy nhiên nhà khoa học cho rằng, kim loại đóng vai trị liên kết enzyme chất, liên kết apoenzyme coenzyme, tham gia trực tiếp vào trình vận chuyển điện tử vai trò sắt cytochrome peroxydase CÔNG NGHỆ ENZYME Bảng 1.2 Một số enzyme có chứa kim loại [2] STT 1.2.3 Enzyme Kim loại Hệ cytochrome, catalase, peroxydase Sắt (Fe) Polyphenoloxydase Đồng (Cu) Carbonic anhydrase Kẽm (Zn) Peptidase Mangan (Mn), Sắt (Fe), Magie (Mg) Phosphatase Magie (Mg) Arginase Mangan (Mn) Cấu trúc enzyme Enzyme protein đặc biệt Ngoài cấu trúc giống cấu trúc bình thường protein, enzyme cịn có cấu trúc đặc biệt liên quan đến hoạt động enzyme Khơng phải tồn phần enzyme tham gia vào hoạt động xúc tác, mà có phận đặc biệt mang tính đặc hiệu phân tử protein tham gia xúc tác phản ứng Bộ phận đặc hiệu gọi trung tâm hoạt động enzyme Trung tâm hoạt động enzyme bao gồm:
Những nhóm hóa học, liên kết peptide tiếp xúc trực tiếp với chất
Những nhóm hóa học, liên kết peptide khơng tiếp xúc trực tiếp với chất có chức trực tiếp q trình xúc tác Phần cịn lại đóng vai trị khung, giữ cho cấu trúc khơng gian thích hợp với khả xúc tác Nếu bị tác động điều kiện bên nhiệt độ, pH, nồng độ chất, khung biến đổi cấu trúc khơng gian Từ làm thay đổi sâu sắc hoạt tính enzyme Phần phân tử enzyme khơng có liên quan đến hoạt tính enzyme, bị tác động, bị bị biến đổi hồn tồn khơng ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Trung tâm hoạt động enzyme thường chứa amino acid có nhóm hóa học hoạt động mạnh amino acid serine, histidine, cysteine, lysine, arginine, glutamic acid, aspartic acid, tryptophan Các nhóm hóa học hoạt động có khả gắn với chất để tạo thành phức chất enzyme - chất Những nhóm hóa học hoạt động mạnh bao gồm:
Nhóm NH2 lysine
Nhóm -SH cysteine
Nhóm γ-carboxyl glutamic acid Các gốc amino acid tạo trung tâm hoạt động enzyme thường không nằm cạnh chuỗi polypeptide thẳng (cấu trúc bậc 1) Trong thực tế, chuỗi popypeptide enzyme tồn trạng thái không gian (cấu trúc bậc 3, bậc 4) nên amino acid thường tồn gần theo cấu trúc không gian Do cấu trúc không gian vậy, trung tâm hoạt động tạo thành Trong trung tâm hoạt động enzyme người ta cịn thấy có ion kim loại Các ion kim loại có mặt trung tâm hoạt động enyzme có vai trị xúc tác lớn Ngoài gốc amino acid, ion kim loại, nhà khoa học cịn cho thấy nhóm chức coenzyme coi phần cấu tạo trung tâm hoạt động enzyme CÔNG NGHỆ ENZYME Mỗi enzyme thường có trung tâm hoạt động Tuy nhiên có enzyme có trung tâm hoạt động (alcohol hydrogenase gan), chí có enzyme có tới trung tâm hoạt động (alcohol dehydrogenase nấm men) Hoạt động xúc tác trung tâm hoạt động có liên quan tới chất Các nhà khoa học nghiên cứu vấn đề đưa quan điểm quan trọng: Chỉ chất có cấu trúc phân tử thích hợp với trung tâm hoạt động enzyme kết hợp với trung tâm hoạt động enzyme để tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất Theo quan điểm này, chất có cấu trúc phân tử trùng với trung tâm hoạt động tượng kết hợp chặt chẽ mang tính đặc hiệu cao Chính thế, loại enzyme tham gia xúc tác phản ứng cho loại chất định Các loại enzyme thường tạo trung tâm hoạt động có cấu trúc không gian định Các trung tâm hoạt động thường hình thành sẵn enzyme Chính trung tâm hoạt động enzyme định cho phép chất cấu trúc tương ứng với trung tâm hoạt động kết hợp vào Quan điểm Fisher đề xướng Thuyết Fisher giải thích tượng gắn kết chất trung tâm hoạt động enzyme nhiều kết thực nghiệm, thuyết chưa giải thích trọn vẹn Thuyết trung tâm hoạt động linh hoạt Koshland nhiều nhà khoa học chấp nhận Theo thuyết này, nhóm chức trung tâm hoạt động enzyme tự chưa tham gia xúc tác Chính chất tác nhân tác động làm thay đổi cấu trúc không gian trung tâm hoạt động enzyme Chính tác động cảm ứng chất làm cho gốc amino acid, nhóm chức trung tâm hoạt động di chuyển, định hướng cách thích hợp, xác để gắn chất vào trung tâm hoạt động thực trình xúc tác Như vây, Koshland cho trung tâm hoạt động enzyme tạo thành có tác động cảm ứng chất Chính chế mềm dẻo trung tâm hoạt động giải thích cạnh tranh chất chất khơng phải chất lại có cấu trúc khơng gian giống chất Khi đó, chất giống chất chiếm chỗ trung tâm hoạt động enzyme phản ứng chất khơng xảy Hình 1.2 Mơ hình Fisher giải thích chế tác động enzyme với chất ... xúc tác loạii protein đđặc biệt gọii enzyme Các enzyme tham gia phản ph ứng tế bào gọi enzyme ngoạii bào Các enzyme th thực tế bào gọii enzyme enzym nội bào Cả enzyme nội bào enzyne ngoại bào đềuu... nhóm: Nhóm enzyme đơn cấu tử: Thuộc nhóm bao gồm enzyme cấu tạo thành phần hóa học protein Những enzyme tạo thành từ protein gọi enzyme đơn cấu tử Nhóm enzyme đa cấu tử Thuộc nhóm bao gồm enzyme. .. tổng quát enzyme: E+S Trong đó: E – enzyme (enzyme) ES S – Cơ chất (substrate) E+P P – Sản phẩm (products) CƠNG NGHỆ ENZYME Hình 1.4 Cơ chế xúc tác enzyme 1.3.2 Năng lượng xúc tác Enzyme tham