Bài giảng Công nghệ protein và enzyme: Chương 1 - TS. Nguyễn Xuân Cảnh

Bài giảng Công nghệ protein và enzyme: Chương 1 Protein cung cấp cho người học những kiến thức như: Khái niệm protein; Phân loại protein; Cấu trúc phân tử protein; Các liên kết hóa học trong phân tử protein; Tính chất của protein; Phương pháp định tính và định lượng protein. Mời các bạn cùng tham khảo!

9/18/2020 CƠNG NGHỆ PROTEIN-ENZYME PROTEIN-ENZYME TECHNOLOGY • Giảng viên: TS Nguyễn Xuân Cảnh • Email: nxcanh@vnua.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH • Hóa sinh học Phạm Thị Chân Châu, Trần Thị Áng Nhà xuất Giáo dục 2005 • Hóa sinh công nghiệp Lê Ngọc Tú Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội 2004 • Enzyme ứng dụng Phạm Thị Chân Châu, Phan Tuấn Nghĩa Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội 2007 • Biochemistry (Fifth edition) Jeremy M Berg, John L Tymoczko, Lubert Stryer W H Freeman and Company 2001 • Biochemistry : The chemical reaction of living cells (Fifth edition) David E Metzler ELSEVIER 2003 • Enzyme in Industry: Production and Applications Wolfgang Aehle WILLEY-BLACKWELL 2004 9/18/2020 NỘI DUNG CHÍNH • Protein • Enzyme • Các phương pháp nghiên cứu protein enzyme • Ứng dụng protein enzyme • Công nghệ nghiên cứu sản xuất protein/ enzyme • Cơng nghệ AND tái tổ hợp sản xuất cải biến protein/ enzyme • Enzyme cố định Chương 1.Protein 1.1 Khái niệm protein 1.2 Phân loại protein 1.3 Cấu trúc phân tử protein 1.4 Các liên kết hóa học phân tử protein 1.5 Tính chất protein 1.6 Phương pháp định tính định lượng protein 9/18/2020 1.1 Khái niệm chung • Protein đại phân tử sinh học, tìm thấy tất tế bào sống • Protein tham gia vào tất các q trình chức sống thể • Protein tạo amino acid (chuỗi polypeptide), chúng liên kết với liên kết peptide –CO-NH- • Chỉ có 20 amino acid tiêu chuẩn tồn sinh vật sống • 20 amino acid  vơ vàn protein khác dựa vào tổ hợp xếp amino acid  số lượng vô lớn cấu trúc khác • Trình tự amino acid xác định ADN Đơn vị Dalton ? Nhà hóa học, vật lý học, thiên văn học người Anh Tiên phong thuyết nguyên tử đại Nghiên cứu bệnh mù màu Da đơn vị khối lượng định nghĩa 1/12 khối lượng nguyên tử C (ở trạng thái bản) Da có giá trị =1.660538782(83)×10−27 kg Da xấp xỉ khối lượng proton neutron John Dalton (1766-1844) 9/18/2020 Thành phần cấu tạo Tất protein chứa nguyên tố: C: 50-55% O: 21-24% H: 6,5-7,3% N: 15-18% S: 0-0,24% (chỉ có mặt số protein) Ngoài nguyên tố trên, số protein chứa lượng nhỏ nguyên tố khác như: P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca Lịch sử nghiên cứu protein • PROTEIN, tiếng Hy Lạp (prota) có nghĩa “quan trọng trước tiên” • Năm 1838, Jons Jakob Berzelius sử dụng để mô tả phân tử hữu có khối lượng phân tử lớn Protein sử dụng để mô tả hợp chất hữu có tầm quan trọng dinh dưỡng động vật • 1926, James B Sumner chứng minh enzyme phân lập kết tinh • 1955, Sir Frederick Sanger xác định trình tự insulin Đây chứng chứng tỏ protein có cấu trúc đặc thù • 1958, cấu trúc chiều haemoglobin myoglobin làm sáng tỏ Max Perutz Sir John Cowdery Kendrew phương pháp phân tích nhiễu xạ tia X 9/18/2020 Thành tựu nghiên cứu Protein Đến 10.000 cấu trúc protein làm sáng tỏ mức độ nguyên tử Hàng triệu đột biến cho phép nghiên cứu phương thức protein thay đổi đặc điểm Mơ máy tính cho phép mơ hình hóa đặc điểm protein  Vấn đề tồn đọng? Protein problems !!! Protein structure or folding of protein Amino acid sequence  folding  D structure  Dự đoán cấu trúc dựa vào trình tự amino acid? Protein evolution Bao nhiêu protein hình thành suốt q trình tiến hóa? Protein crystallisation Dự đoán cấu trúc điều kiện mà protein kết tinh? 9/18/2020 1.2 Phân loại Protein • Vi khuẩn E.coli nhỏ bé, tế bào có khoảng 3000 protein khác • Cho đến khơng thể dự đốn tổng số protein khác có mặt tự nhiên • Phân loại protein? Phân loại protein dựa vào chức • Enzymes: • Hormones: insulin, lipotropin, prolactin, nọc độc rắn • Protein vận chuyển: cytochrome C, haemoglobin myoglobin, albumin vận chuyển axit béo máu, protein đóng vai trị vận chuyển ion (bơm, kênh) • Immunoglobulin kháng thể • Điều hòa hoạt động gen (transcription factor) • Protein cấu trúc: trì cấu trúc thành phần sinh học: Collagen, elastin, αkeratin, sklerotin, fibroin, peptidoglican (vi khuẩn) • Protein vận động: Chuyển lượng hóa học thành lượng học (Actin myosin), tubulin • Thụ thể (receptors): Nhận tín hiệu truyền tín hiệu (glycoprotein, transmembrane protein) • Protein tín hiệu: Các protein thay đơi cấu hình có mặt phân tử tín hiệu (GTPases) • Protein dự trữ: ovalbumin trứng, casein sữa 9/18/2020 Phân loại protein dựa vào cải biến sau dịch mã • Native proteins: Khơng có thay đổi sau dịch mã • Glico-proteins: gắn với oligosaccharide mạch thẳng hay mạch nhánh • Cleaved proteins: sau dịch mã bị cắt thành hay nhiều mảnh • Proteins with disulphide bonds: cặp amino acid cysteins nối với qua cầu S-S • Protein complexes: tồn dạng homo hetero • Chemically modified proteins: gốc amino acid bị cải biến hóa học (gắn cộng hóa trị với hợp chất hóa học) • Prions: bị cuộn gấp nếp theo cách khác thường thay đổi cấu hình dịch mã Phân loại protein dựa vào cấu trúc khả hịa tan Dựa vào hình dạng khả hịa tan Protein dạng sợi (fibrous protein) Protein hình cầu (Globular proteins) Dựa vào tính phức tạp khả kết hợp với thành phần khác Protein phức hợp (protein kết hợp với thành phần khác) 9/18/2020 Protein dạng sợi dạng cầu Protein khung tế bào (Cytoskeletal proteins) Actin Arp2/3 (Actin related protein 2, 3) Coronin Dystrophin FtsZ % (Filamenting temperature-sensitive mutant Z) Keratin Myosin Spectrin Tau (protein) Tubulin 1.3 Cấu trúc protein Cấu trúc 3-D phân tử Myoglobin 9/18/2020 Các bậc cấu trúc protein Bậc I Bậc II Bậc III Bậc IV 9/18/2020 Tên Acid Amin Ký hiệu Ký hiệu 03 ký tự 01 ký tự Tên Acid Amin Ký hiệu Ký hiệu Alanine Ala A Leucine Leu L Arginine Arg R Lysine Lys K Asparagine Asn N Methionine Met M Aspartic acid Asp D Phenylalanine Phe F Cysteine Cys C Proline Pro P Glutamine Gln Q Serine Ser S Glutamic Acid Glu E Threonine Thr T Glycine Gly G Tryptophan Trp W Histidine His H Tyrosine Tyr Y Isoleucine Ile I Valine Val V 03 ký tự 01 ký tự Đặc điểm cấu tạo phân loại amino acid L-isomer dạng axit amin phổ biến tìm thấy protein 10 9/18/2020 Motif domain • Motif domain tổ hợp cấu trúc bậc • Motif: bao gồm vài cấu trúc bậc 2, khơng thiết phải thực chức • Domain: gồm nhiều cấu trúc bậc 2, phức tạp thường định nghĩa đơn vị chức định • Trong số trường hợp motif domain có ý nghĩa 20 9/18/2020 Cấu trúc bậc • Cấu trúc bậc  coi cấu trúc chiều hoàn thiện chuỗi polypeptide • Trong cấu trúc bậc protein thường có vùng cấu trúc (domain) định • Cấu trúc bậc gồm vùng cấu trúc bậc gấp nếp • Sự tương tác vùng (domain) trì số liên kết lực liên kết • Các aminoacid xa chuỗi polypeptide tương tác với nhờ liên kết như; liên kết hydro, tương tác kị nước, tương tác tĩnh điện lực van der Waals GFP (Green fluorescent protein) - Aequorea victoria - Protein gồm 238 Aminoacid, 26,9kDa - 11 chuỗi Beta, 01 chuỗi anpha vùng chromophore, 05 chuỗi alpha ngắn (alpha helice) 21 9/18/2020 Năm 1996 cấu trúc kết tinh GFP làm sáng tỏ Xoắn alpha (đỏ), phiến beta (xanh cây), vùng nối (loops) màu xanh đậm 11 phiến beta tạo nên hàng rào beta chuỗi xoắn alpha chạy xuyên qua trung tâm Chất phát quang (chromophore) định vị hàng rào beta Tháng năm 2003, ngân hàng cấu trúc protein PDB, GFP xếp vào cấu trúc protein tháng Các nhóm R cấu tạo nên cấu trúc chromophore bao gồm amino acid từ vị trí 64 đến 170 Trong Arg96 đóng vai trị quan trọng 22 9/18/2020 Cấu trúc bậc • Rất nhiều protein có chứa từ 02 chuỗi polypeptide trở lên, chúng liên kết với nhờ lực hút khơng cộng hóa trị (non-covalent) cấu trúc bậc ba trở nên ổn định • Các protein tạo nhiều chuỗi polypeptide gọi protein oligomeric • Cấu trúc hình thành nhờ tương tác monomer-monomer protein oligomeric xác định cấu trúc bậc protein • Các protein oligomeric gồm nhiều chuỗi polypeptide giống (multiple identical polypeptide chains) gọi homo-oligomers riêng biệt (multiple distinct polypeptide chains) gọi hetero-oligomers Heamoglobin hetero-oligomeric protein, bao gồm 02 chuỗi alpha 02 chuỗi beta tạo cấu trúc bậc α2β2 23 9/18/2020 Các liên kết trì cấu trúc phân tử protein • Liên kết cộng hoá trị chủ yếu liên kết peptide nối gốc axit amin tạo chuỗi polypeptide • Liên kết disulfide (-S-S-) nhóm SH gốc systein phản ứng với tạo thành góp phần đáng kể làm cuộn phân tử protein làm bền cấu trúc bậc III Có nhiều liên kết khơng cộng hóa trị (non-covalent interaction), yếu đóng vai trò quan trọng việc ổn định cấu trúc không gian, đảm bảo chức sinh học phân tử protein • Tương tác ion (Ionic interactions) • Tương tác hấp dẫn Van der waals (Van der waals interactions) • Liên kết Hydro (Hydrogen bonds) • Tương tác kỵ nước (Hydrophobic interactions) Liên kết hydro • Liên kết Hydro liên kết yếu hình thành lực hút tĩnh điện Hydro (đã liên kết phân tử) với nguyên tử có độ âm điện mạnh có kích thước bé (N,O, F ) phân tử khác phân tử • Liên kết Hydro biểu diễn ba chấm ( ) 24 9/18/2020 25 9/18/2020 Năng lượng liên kết số dạng liên kết hydro •F—H :F (155 kJ/mol or 40 kcal/mol) •O—H :N (29 kJ/mol or 6.9 kcal/mol) •O—H :O (21 kJ/mol or 5.0 kcal/mol) •N—H :N (13 kJ/mol or 3.1 kcal/mol) •N—H :O (8 kJ/mol or 1.9 kcal/mol) Chiều dài liên kết H 26 9/18/2020 Thế tĩnh điện (Electrostatic Potential): Chỉ thị cho độ phân cực • Thế tĩnh điện phân tử lượng tiềm tàng proton vị trí định gần phân tử • Thế tích điện âm (đỏ): Hấp dẫn proton mật độ điện tử phân tử • Thế điện tích dương (xanh): Sự đẩy proton nhân nguyên tử vùng có mật độ điện tử thấp Liên kết hấp dẫn (van der Waals) Là lực liên kết nội phân tử nội nguyên tử gây lực hút tạm thời lưỡng cực phân tử không phân cực nguyên tử phân bố bất đối xứng electron nhờ di chuyển chúng van der Waals tổng lực hấp dẫn lực đẩy phân tử phần phân tử Phân loại: Lực phân tử lưỡng cực (trạng thái lưỡng cực tồn lâu) (Keesom force) Lực phân tử lưỡng cực lâu phân tử cảm ứng (Debye force) Lực phân tử lưỡng cực cảm ứng tạm thời (London dispersion force) 27 9/18/2020 Van der Waals force + lực tương tác bề mặt 28 9/18/2020 Các liên kết kị nước • Các phân tử khơng phân cực (khơng chứa nhóm ion + liên kết phân cực) -> khơng hịa tan nước -> phân tử kỵ nước • Lực thúc đẩy phân tử hay vùng không phân cực phân tử liên kết với gọi liên kết kỵ nước • Vai trị: ổn định Pr, phức hợp Pr với ptử khác phân bố Pr màng sinh học Protein cấu tạo amino acid chứa gốc ưa nước kị nước • Khi protein gấp nếp, amino acid có gốc kị nước: alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tryptophan methionine có xu hướng co cụm bên phân tử protein • Cấu trúc protein hịa tan nước có lõi kị nước bên trong, lõi kị nước chủ yếu gốc kị nước amino acid • Các gốc kị nước có xu hướng giảm thiểu phạm vi tiếp xúc với nước  tạo lực lơi kéo q trình gấp nếp 29 9/18/2020 Một số tính chất protein Dung dịch keo protein, kết tủa protein • Khi hịa tan, protein tạo thành dung dịch keo • Trên bề mặt protein có nhóm phân cực, hịa tan, nước bao quanh tạo thành lớp vỏ hydrat • Độ bền dung dịch keo phụ thuộc vào nhiều yếu tố: tích điện phân tử protein, mức độ hydrat hóa, nhiệt độ…Khi thay đổi yếu tố protein kết tụ lại với nhau, gọi tượng kết tủa protein • Hiện tượng kết tủa thuận nghịch không thuận nghịch Khả hấp thụ tia tử ngoại protein • Dung dịch protein có khả hấp thụ ánh sáng tử ngoại 02 vùng bước sóng • 180-220 nm: vùng hấp thụ liên kết peptide, cực đại 190 nm • 250-300 nm: vùng hấp thụ aminoacid thơm (Phe, Tyr, Trp), cực đại 280 nm Sự kết tinh protein • Là dạng khơng hịa tan protein dung dịch, số điều kiện định Các phần protein liên kết lại với nhờ liên kết không tĩnh điện tạo thành phân tử kết tinh • Một số protein tinh thể gặp tự nhiên, số khác tạo thành điều kiện thí nghiệm 30 9/18/2020 Tính chất lưỡng tính protein • Axit amin protein có tính chất lưỡng tính, có nghĩa vừa có tính acid vừa có tính base • Khái niệm pH đẳng điện (pHi hay pI): Ở giá trị pH, tổng điện tích (+) (-) phân tử protein = Phân tử protein không di chuyển điện trường, giá trị pH gọi pHi • Như protein có chứa nhiều Asp, Glu (axit amin axit) pHi nằm vùng axit ngược lại, protein chứa nhiều axit amin kiềm (Lys, Arg, His) pHi vùng kiềm Giá trị pHi số protein thường gặp Trong điều kiện pH=pHi protein, protein dễ dàng kết tụ lại với 31 9/18/2020 Khối lượng (MW) cấu trúc phân tử số protein Protein = protein đơn giản + protein phức tạp Một số phản ứng thường dùng để định tính, định lượng protein Phản ứng biure (Biuret assay) • Là phản ứng đặc trưng cho liên kết peptide, môi trường kiềm mạnh, liên kết peptide protein phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu tím Cực đại hấp thụ phức chất 540 nm • Các aminoacid dipeptide khơng có phản ứng 32 9/18/2020 Phản ứng Folin-Ciocalteu (Lowry assay) • Là phản ứng kết hợp phản ứng biure oxi hóa aminoacid thơm (Tyr, Trp) thuốc thử folin-ciocalteu (hỗn hợp phosphotungstic acid and phosphomolybdic acid) • Phức hợp tạo thành có màu xanh da trời, hấp thụ cực đại 750 nm • Phương pháp nhạy, định lượng tới 0,01mg/ml Phản ứng với Ninhydrin • Tất a-amino acid phản ứng với Ninhydrin tạo phức chất màu xanh tím, riêng prolin tạo phức chất màu vàng • Dưới tác dụng Ninhydrin nhiệt độ cao Aminoacid tạo thành NH3, CO2 aldehit tương ứng có mạch cacbon ngắn Aa 01 Cacbon Ninhydrin chuyển thành Hydrindatin Hydrindatin, NH3 tạo phản ứng với Ninhydrin khác tạo phức chất có màu • Có thể so màu đo thể tích NH3, CO2 tạo để định lượng Aminoacid 33 9/18/2020 Phản ứng Bradford (Bradford assay) • Đây phương pháp phổ biến để định lượng protein tổng số, định lượng ngưỡng 1-10 µg/ml • Cơ chế thực dựa thay đổi màu thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250, điều kiện axit thuốc nhuộm chuyển từ màu nâu đỏ sang màu xanh có mặt protein • Cực đại hấp thụ phức hợp 595 nm Các phản ứng màu đặc trưng khác protein Những phản ứng có có mặt nhóm định chức hóa học xác định phân tử protein Có thể sử dụng chúng để phát amino acid, protein dung dịch • Phản ứng xanthproteic: gốc amino acid Tyr, Trp, Phe protein tác dụng với HNO3 đặc tạo thành màu vàng sau thêm kiềm chuyển thành da cam • Phản ứng Pauli: gốc Tyr, His protein tác dụng với diazobenzosulfonic acid tạo thành màu đỏ anh đào • Phản ứng Millon: gốc Tyr tác dụng với thuỷ ngân nitrate HNO3 đặc tạo thành kết tủa màu nâu đất • Phản ứng Saccaguichi: gốc Arg tác dụng với dung dịch kiềm α-naphtol hypobromitecho màu đỏ anh đào • Phản ứng Adamkievich: gốc Trp tác dụng với glyoxylic acid H2SO4 đặc tạo thành vịng tím đỏ mặt phân cách 34 ... biến protein/ enzyme • Enzyme cố định Chương 1 .Protein 1. 1 Khái niệm protein 1. 2 Phân loại protein 1. 3 Cấu trúc phân tử protein 1. 4 Các liên kết hóa học phân tử protein 1. 5 Tính chất protein 1. 6... C: 5 0-5 5% O: 2 1- 24% H: 6, 5-7 ,3% N: 15 -1 8 % S: 0-0 ,24% (chỉ có mặt số protein) Ngồi ngun tố trên, số protein cịn chứa lượng nhỏ nguyên tố khác như: P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca Lịch sử nghiên cứu protein. .. fluorescent protein) - Aequorea victoria - Protein gồm 238 Aminoacid, 26,9kDa - 11 chuỗi Beta, 01 chuỗi anpha vùng chromophore, 05 chuỗi alpha ngắn (alpha helice) 21 9 /18 /2020 Năm 19 96 cấu trúc