Bài giảng Công nghệ protein và enzyme: Chương 2 - TS. Nguyễn Xuân Cảnh

Bài giảng Công nghệ protein và enzyme: Chương 2 Enzyme, cung cấp cho người học những kiến thức như: Giới thiệu chung; Phân nhóm enzyme; Cơ chế xúc tác enzyme; Động học phản ứng enzyme; Phương pháp xác định hoạt độ enzyme; Sàng lọc cơ chất cho enzyme. Mời các bạn cùng tham khảo!

•9/18/2020 CHƢƠNG ENZYME • Giới thiệu chung • Phân nhóm enzyme • Cơ chế xúc tác enzyme • Động học phản ứng enzyme • Phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme • Sàng lọc chất cho enzyme Một số khái niệm chung • Enzyme chất xúc tác sinh học, có mặt tất thể sống • Chúng thúc đẩy phản ứng xảy mà khơng có mặt sản phẩm cuối • Ngoại trừ nhóm nhỏ RNA có tính xúc tác (ribozym), tất enzyme có chất protein • Tính chất xúc tác phụ thuộc vào cấu tạo protein • Một số enzyme cấu tạo gồm tồn phân tử L-amino acid liên kết với tạo thành, gọi enzyme thành phần • Đa số enzyme protein phức tạp gọi enzyme hai thành phần Phần protein gọi apoenzyme, phần protein gọi nhóm ngoại hay coenzyme •1 •9/18/2020 Nhóm ngoại: Có thể hợp chất hữu (coenzyme) nhƣ vitamin, NAD… ion kim loại Phân loại enzyme/ Enzyme Classification (EC) Cách gọi tên: tên chất đặc hiệu + tên loại phản ứng + ase Phân loại: enzyme chia thành 06 lớp gồm; • Oxydoreductase: xúc tác cho phản ứng oxy hố - khử • Transpherase: xúc tác cho phản ứng chuyển vị nhóm từ phân tử đến phân tử khác • Hydrolase: xúc tác cho phản ứng thuỷ phân vận chuyển nhóm chức chất nhận ln phân tử nước • Lyase: xúc tác cho phản ứng thêm nhóm vào nối đơi, tạo thành nối đơi cách loại nhóm • Isomerase: xúc tác cho phản ứng đồng phân hố, chuyển vị nhóm nội phân tử tạo dạng đồng phần • Ligase: xúc tác cho phản ứng tạo thành liên kết C-C, C-O, C-S C-N phản ứng ngưng tụ kèm theo phản ứng cắt đứt liên kết giàu lượng nucleosid trisphosphate, (thường ATP) •2 •9/18/2020 • Mỗi lớp chia thành nhiều tổ, tổ chia thành nhiều nhóm, nhóm có nhiều enzym khác • Trong bảng phân loại, ký hiệu enzym thường gồm 04 chữ số ngăn cách dấu “.”: số thứ lớp, số thứ tổ, số thứ nhóm, số thứ tư enzym • Ví dụ: enzym mang ký hiệu EC 2.6.1.6 enzym leucine transaminase thuộc nhóm Transferases (lớp 2), xúc tác phản ứng chuyển vị nhóm có chứa Nitơ (tổ 6/ Transferring nitrogenous groups), nhóm chứa Nitơ nhóm amin từ Leucine (nhóm 6) • Phản ứng: L-leucine+ 2-oxoglutarate = 4-methyl-2-oxopentanoate + L-glutamate Giới thiệu hệ thống phân loại enzyme quốc tế http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/ •3 •9/18/2020 •4 •9/18/2020 •5 •9/18/2020 •6 •9/18/2020 •7 •9/18/2020 Lớp Oxidoreductase • • • • • Xúc tác phản ứng oxy hóa khử Cơ chất bị oxy hóa coi chất cho H Tên enzyme: Chất cho: Chất nhận oxidoreductase Tên thông dụng Dehydrogenase Tên Reductase dùng trường hợp chất nhận O2 Con số thứ enzyme thuộc nhóm oxidoreductases (ngoại trừ 11, 13, 14 15) nhóm chất cho hydrogen bị oxi hóa: nhóm -CHO-, CHO –CO-COOH • Con số thứ 3, ngoại trừ EC 1.11, EC 1.13, EC 1.14 EC 1.15 dạng chất nhận tham gia vào phản ứng xúc tác: NAD(P)+, Cytochrome, Oxy (O), S-S • Các enzyme thuộc lớp này: dehydrogenases, reductases • Ví dụ: lactate dehydrogenase (NAD+), acyl CoA dehydrogenase (FAD), ketoacyl-ACP reductase (NADPH/H+) •8 •9/18/2020 Dehydrogenase Dehydrogenase: enzyme oxi hóa chất cách chuyển nhiều hydride (H-) tới chất nhận, thường NAD+/NADP+ flavin coenzyme FAD or FMN • Aldehyde dehydrogenase (oxy hóa aldehyde) • Acetaldehyde dehydrogenase (chuyển acetaldehyde tới acetic acid) • Alcohol dehydrogenase • Glutamate dehydrogenase (enzyme chuyển hóa glutamate thành αKetoglutarate ngược lại) • Lactate dehydrogenase • Pyruvate dehydrogenase (trong chu trình TCA, chuyển hóa Pyruvate thành Acetyl CoA) • Glucose-6-phosphate dehydrogenase (liên quan đến đường pentose phosphate) • Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (liên quan đến đường phân) Acetaldehyde dehydrogenase • Vai trị quan trọng q trình chuyển hóa ethanol • Ethanol  acetaldehyde - Acetic acid Alcohol dehydrogenase Acetaldehyde dehydrogenase •9 •9/18/2020 Reductase • Reductase enzyme xúc tác cho phản ứng khử • Ví dụ số enzyme reductase • 5-alpha reductase • Dihydrofolate reductase • HMG-CoA reductase • Methemoglobin reductase • Ribonucleotide reductase • Thioredoxin reductase • E coli nitroreductase • Methylenetetrahydrofolate reductase Lớp Transferase • Là enzym vận chuyển nhóm, chẳng hạn: methyl, glycosyl • Tên enzyme: donor: acceptor grouptransferase • Tên thơng dụng thường đặt theo acceptor grouptransferase donor grouptransferase Chất cho thường cofactor (Coenzyme) • Một số phản ứng xúc tác mơ phỏng: X-Y + Z = X + Z-Y • Hoặc chuyển nhóm Y từ X sang Z cắt đứt liên kết X-Y có tham gia Z • Việc giải thích mang tính tương đối, người ta thường đặt tên theo kiểu Y-transferase Các enzyme thuộc lớp này: kinases, aminotransferases, thiolases Ví dụ: glucokinase (ATP), aspartate aminotransferase (PLP), b-ketothiolase • • •10 •9/18/2020 Hoạt độ riêng (specific activity) • Định nghĩa: số đơn vị hoạt độ enzyme đơn vị khối lượng protein • Cơ sở để đánh giá độ mẫu enzyme • Mẫu enzyme sạch, số đơn vị hoạt độ enzyme lớn Phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme Định lượng chất sau khoảng thời gian điều kiện tối ưu • Các phản ứng màu (đo quang phổ) • Các phương pháp phóng xạ • Bằng HPLC, FPLC • Bằng huỳnh quang (FACS, Elisa) •31 •9/18/2020 Nghiên cứu động học enzyme Nghiên cứu động học enzyme nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố: nồng độ chất, enzyme, pH mơi trường, nhiệt độ, chất kìm hãm… đến tốc độ phản ứng enzyme xúc tác  Có thể biết chế phân tử tác động enzyme  Cho phép hiểu mối quan hệ mặt lượng trình enzyme  Là điều kiện cần thiết để thực tốt bước tinh chế enzyme  Khi lựa chọn đơn vị hoạt động enzyme cần phải biết điều kiện tốt hoạt động enzyme, cần phải biết yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động chúng Động học phản ứng enzym Ảnh hưởng nồng độ enzym • Trong điều kiện dư thừa chất, nghĩa [S]>>[E] lúc tốc độ phản ứng phụ thuộc vào [E] • Đo [E] cách đo vận tốc phản ứng enzyme xúc tác: v=k[E] • Có nhiều trường hợp mơi trường có chứa chất kìm hãm hay hoạt hóa vận tốc phản ứng enzyme xúc tác không phụ thuộc tuyến tính với [E] V [E] •32 •9/18/2020 Ảnh hưởng nồng độ chất Trường hợp đơn giản nhất: chất k1 k2 E  S  ES  E  P k -1 E = Enzyme S = Cơ chất P = Sản phẩm ES = Phức hợp Enzyme - Cơ chất k1: Hằng số tốc độ phản ứng thuận (tạo thành ES) k-1: Hằng số tốc độ phản ứng nghịch (ES chuyển thành E S) k2: Hằng số tốc độ phản ứng tạo thành sản phẩm •33 •9/18/2020 Gọi v1 vận tốc phản ứng tạo thành phức chất ES Gọi v-1 vận tốc phản ứng tạo phân ly phức chất ES tạo thành E S Gọi v0 vận tốc phản ứng tạo thành E P v1 = k1[E][S] v-1 = k-1[ES] v2 = k2[ES] Khi hệ thống đạt trạng thái cân ta có: k-1[ES]+k2[ES] = k1[E][S] (k-1+k2)[ES] = k1[E][S] (1) •34 •9/18/2020 Vmax= k2[E0] Thay vào (3) ta có: vo  Vmax S K M  S Phương trình Michaelis – Menten (1913) Km gọi số Michelis Menten đặc trưng cho enzyme Km đặc trưng cho lực enzyme với chất, Km có trị số nhỏ lực enzyme với chất lớn, nghĩa vận tốc phản ứng enzyme xúc tác lớn KM  k 1 k k   Ks  k1 k1 k1 •35 •9/18/2020 Khi tăng [S] v phản ứng tăng, tăng [S] đến giá trị v đạt đến giá trị vmax không tăng ta tiếp tục tăng [S] Khi Km = [S] v0 =1/2 Vmax Giá trị km số enzym •36 •9/18/2020 Các phản ứng qua nhiều bước E+S k1   k-1 vo  k2 k3 ES  ES  E + P kcat[ E ][ S ] K M  S kcat = k2k3/(k2 + k3) Cách tính Kcat ME: trọng lượng phân tử enzym (Da = g/mol) mE: lượng enzym sử dụng cho phản ứng (g) mP: lượng sản phẩm tạo (mol) t: Thời gian phản ứng (s) Quan hệ Vmax Kcat: Vmax = Kcat *[E] •37 •9/18/2020 Giá trị kcat số enzym Ý nghĩa Km • Km hiểu cách đơn giản thể lực sức gắn enzyme với chất • Giá trị Km thấp lực lớn (chỉ cần lượng nhỏ chất, phản ứng đạt tốc độ định) • Giá trị Km cao  lực E S thấp  cần nhiều chất với đạt tốc độ định •38 •9/18/2020 Ý nghĩa Vmax • Vmax nồng độ chất mà tất vị trí hoạt động (trung tâm hoạt động) enzyme hoàn toàn bị bão hịa • Vmax chịu ảnh hưởng nồng độ chất (phản ứng bậc 1) Ý nghĩa Kcat • Kcat xem số chuyển hóa enzyme mô tả = số phản ứng enzyme giây • Tỉ lệ Kcat/ km gọi hiệu xúc tác (catalytic effiency) enzyme Dùng để so sánh tính đặc hiệu enzym với chất khác •39 •9/18/2020 Enzyme xúc tác phản ứng có hay nhiều chất Phản ứng tạo phức 03 thành phần Phản ứng không tạo phức 03 thành phần (phản ứng pingpong •40 •9/18/2020 Ảnh hƣởng chất ức chế enzyme • Ức chế cạnh tranh: Khi chất chất ức chế cạnh tranh vị trí trung tâm hoạt động enzyme • Ức chế không cạnh tranh: Khi chất ức chế gắn phân tử enzyme dẫn đến giảm hiệu xúc tác • Sự phân biệt xác định cách vẽ phản ứng động học có mặt khơng có mặt chất ức chế Ức chế cạnh tranh (Competitive Inhibition) •41 •9/18/2020 • Khi có mặt chất ức chế cạnh tranh, enzyme đòi hỏi nồng độ [S] lớn để cạnh tranh vị trí trung tâm hoạt động (để đạt tốc độ khơng có chất ức chế) • Như vậy, Vmax đạt đủ chất (địi hỏi nhiều chất hơn) • Giá trị Km lớn Ức chế không cạnh tranh (Uncompetitive Inhibition) •42 •9/18/2020 • Enzyme bị công chất ức chế  giảm hiệu xúc tác • Tốc độ phản ứng enzyme (v) giảm tất nồng độ chất, bao gồm Vmax ½ Vmax • Giá trị Km khơng thay đổi vị trí hoạt động enzyme (mà khơng bị ức chế) không thay đổi (N-tosyl-L-phenylalanine chloromethylketone) Ảnh hưởng chất hoạt hóa (activator)  Là chất làm tăng khả xúc tác chuyển hóa chất thành sản phẩm Thông thường cation kim loại hay hợp chát hữu vitamin tan nước  Ví dụ: Mg++ hoạt hóa enzyme mà chất phosphoryl hóa pyrophosphatase (cơ chất pyrophosphate), adenosintriphosphatase (cơ chất ATP)  Tính chất hoạt hóa cation kim loại: + Mỗi cation kim loại hoạt hóa cho kiểu phản ứng định + Cation kim loại có tính đặc hiệu tương đối hay tuyệt đối + Cation kim loại có đối kháng ion + Phụ thuộc nồng độ cation kim loại + Cation kim loại làm thay đổi pH tối thích + Phụ thuộc chất cation kim loại •43 •9/18/2020 Ảnh hưởng nhiệt độ  Ta tăng vận tốc phản ứng hóa học cách tăng nhiệt độ mơi trường, tượng tuân theo quy luật Vant -Hoff Điều có nghĩa tăng nhiệt độ lên 100C tốc độ phản ứng tăng lên lần  Đối với phản ứng enzyme xúc tác áp dụng quy luật phạm vi định,vì chất enzyme protein Nếu tăng nhiệt độ lên 40-500C xảy trình phá hủy chất xúc tác Sau nhiệt độ tối thích tốc độ phản ứng enzyme xúc tác giảm  Mỗi enzyme có nhiệt độ tối thích khác nhau, phần lớn phụ thuộc nguồn cung cấp enzyme Ảnh hưởng pH  Sự phân li khác phân tử protein giá trị pH khác làm thay đổi tính chất trung tâm liên kết chất hoạt động phân tử enzyme, dẫn đến giá trị xúc tác khác phụ thuộc vào giá trị pH, enzyme có pH tối thích  Ảnh hưởng giá trị pH đến tác dụng enzyme sở sau: • Enzyme có thay đổi khơng thuận nghịch phạm vi pH cực hẹp • Ở hai sườn pH tối thích xảy phân ly nhóm coenzyme • Làm thay đổi mức ion hóa hay phân ly chất • Làm thay đổi mức ion hóa nhóm chức định phân tử enzyme dẫn đến làm thay đổi lực liên kết enzyme với chất thay đổi hoạt tính cực đại •44 •9/18/2020 Các yếu tố ảnh hưởng khác  Ánh sáng: Có ảnh hưởng khác đến loại enzyme, bước sóng khác có ảnh hưởng khác nhau, thường ánh sáng trắng có tác động mạnh nhất, ánh sáng đỏ có tác động yếu  Sóng siêu âm: Tác động khác loại enzyme, có enzyme bị hoạt tính, có enzyme lại khơng chịu ảnh hưởng  Enzyme trạng thái dung dịch bền kết tinh dạng tinh thể, tinh khiết enzyme bền, nồng độ enzyme dung dịch thấp bền  Tác động tia tử ngoại tăng lên nhiệt độ tăng Ví dụ: tác động tia tử ngoại nhiệt độ cao, enzyme amylase nhanh chóng hoạt tính  Tác động số ion kim loại dịch với nồng độ khoảng 10-3M Ca++ làm tăng tính bền •45 ... L-leucine+ 2- oxoglutarate = 4-methyl -2 - oxopentanoate + L-glutamate Giới thiệu hệ thống phân loại enzyme quốc tế http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/ •3 •9/18 /20 20 •4 •9/18 /20 20 •5 •9/18 /20 20... thành E P v1 = k1[E][S] v-1 = k-1[ES] v2 = k2[ES] Khi hệ thống đạt trạng thái cân ta có: k-1[ES]+k2[ES] = k1[E][S] (k-1+k2)[ES] = k1[E][S] (1) •34 •9/18 /20 20 Vmax= k2[E0] Thay vào (3) ta có: vo ... • Ở động vật, α-Amylase có pH tối ưu khoảng 6, 7-7 ,0 •16 •9/18 /20 20 Beta amylase • β-Amylase (EC 3 .2. 1 .2) gọi 1, 4-? ?-D-glucan maltohydrolase, glycogenase, saccharogen amylase • β-amylase sinh tổng