Đang tải... (xem toàn văn)
Bài giảng Công nghệ protein và enzyme: Chương 3 Các phương pháp nghiên cứu protein/ enzyme, cung cấp cho người học những kiến thức như: Tách chiết và tinh sạch protein/ enzyme; Sản xuất protein/ enzyme tái tổ hợp; Cải biến protein/ enzyme; Phân tích cấu trúc, dự đoán chức năng. Mời các bạn cùng tham khảo!
9/18/2020 Chƣơng CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU PROTEIN/ ENZYME Mục đích • Để làm gì? • Số lượng bao nhiêu? • Độ tinh nào? Đối tƣợng • Thu nhận từ đối tượng nào? • Đối tượng nào? • Có thỏa mãn “mục đích” khơng? Xây dựng quy trình • Cần nhóm phương pháp? • Các phương pháp có tính khả thi khơng? • Nhóm phương pháp phù hợp gì? 9/18/2020 Các nội dung nghiên cứu protein/ enzyme Tách chiết tinh protein/ enzyme • Phá tế bào • Loại bỏ tạp chất • Phân tách protein/ enzyme • Bảo quản protein/ enzyme Sản xuất protein/ enzyme tái tổ hợp • Tách dịng • Biểu tinh Cải biến protein/ enzyme Phân tích cấu trúc, dự đốn chức Tách chiết tinh protein/ enzyme Protein ngoại bào Protein nội bào Loại bỏ tạp chất Phá vỡ tế bào Tinh Định tính định lượng Bảo quản 9/18/2020 Protein ngoại bào (Extracellular proteins) Những protein tổng hợp tế bào sau tiết ngồi mơi trường ngoại bào để thực chức sinh học tế bào thể: • Protein tham gia truyền tín hiệu ngoại bào: hormone, cytokine, chemokine • Các enzyme tiêu hóa: trypsin, pepsin • Protease ngoại bào: Cathesin • Kháng thể dịch thể Trypsin (EC3.4.21.4) Chymotrypsine (EC3.4.21.1) 9/18/2020 • Trypsin chymotrypsin 02 enzyme phổ biến hệ tiêu hóa, sinh từ tuyến tụy sau tiết vào dịch ruột non • Trypsin thuộc nhóm serine protease, thường cắt chuỗi peptide vị trí cacboxyl lysine arginine (ngoại trừ trường hợp sau amino acid proline) • Chymotrypsin thường cắt liên kết peptide vị trí cacboxyl số amino acid kị nước có kích thước lớn tyrosine, triptophan, phenylalanine Pepsin (EC3.4.23.1) • Pepsin thuộc nhóm aspartate protease, sinh dày Cùng với Trypsin Chymotrypsin 03 enzyme thuộc nhóm phân giải protein tìm thấy dạng tinh thể hệ tiêu hóa • Pepsin thường cắt hiệu liên kết peptide tạo Amino acid kị nước Amino acid thơm tyrosine, triptophan, phenylalanine 9/18/2020 9/18/2020 • Thu dịch nuôi cấy: Ly tâm loại bỏ tế bào Dịch enzyme ngoại bào • Ưu điểm: Nhanh, đơn giản, chi phí thấp 9/18/2020 Protein nội bào (Intracellular proteins) Phá vỡ tế bào: Tùy thuộc vào tính chất loại tế bào mà sử dụng phương pháp phù hợp • Nghiền đồng thể • Siêu âm • Dùng áp suất • Nghiền với cát, hạt thủy tinh • Vortex mạnh với hạt thủy tinh • Xử lý enzyme: lysozyme • Sử dụng: chất hoạt động bề mặt (SDS) 9/18/2020 9/18/2020 9/18/2020 Các chất hoạt động bề mặt • Ionic (cation anion): SDS, LiDS Protein subunit (gây biến tính) xác định Mw • Nonionic: Triton X-100, Tween 20 tách phức hợp protein (ít gây biến tính) (có khả kết tủa) • Zwiterionic: CHAPS hạn chế protein-protein interaction gây biến tính protein Thao tác với protein enzyme • Ở nhiệt độ thấp 40C • Giảm thiểu bước quy trình tách chiết, tinh • Bảo quản đệm chiết phù hợp có mặt chất ức chế protease (PMSF, EDTA) • Các chất thường dùng trình bảo quản (albumin, glycerol, PEG) 10 9/18/2020 10 9/18/2020 Một số đuôi liên kết với protein tái tổ hợp (Tag-fusion) thường gặp Đuôi lực (Affinity tag) Số Aa Trình tự Poly-His Thường HHHHHH Poly-Arg Thường RRRRR Cationexchange Glutatione S-transferase 211 Protein Glutathione Maltose-binding protein 396 Protein Cross-linked amylose Streptavidin binding protein 38 Peptide Streptavidin Calmodulin-binding protein 26 Peptide Calmodulin Chitin-binding protein 51 Protein domain Chitin c-myc 11 EQKLISEEDL Anti-body HA(Hemaglutanin) YPYDVPDYA Anti-body 8/24 DYKDDDK/ DYKDDDK x3 Anti-body 11 MASMTGGQQMG Anti-body Flag/x3Flag T7 Ái lực với Ni Maltose binding protein (MBP) GlutathioneS-transferase (GST) N-utilization substrate (NusA) Small ubiquitinmodifier (SUMO) Thioredoxin Vai trị Tag-Fusion gì? 11 9/18/2020 Chuyển gen đích từ vector tách dịng sang vector biểu NcoI HindIII Biến nạp vào tế bào chủ • Biến nạp shock nhiệt • Biến nạp xung điện • Biến nạp súng bắn gen • Biến nạp thông qua tế bào chủ trung gian (Agrobacter) 12 9/18/2020 Phát biểu protein tái tổ hợp 13 9/18/2020 Tinh protein tái tổ hợp 14 9/18/2020 Một số vấn đề trình sản xuất protein tái tổ hợp Vấn đề cần quan tâm thiết kế mồi? Làm để tách Tag-fusion khỏi protein đích? Ảnh hưởng tag-fusion đến cấu trúc protein đích? Cách xử lý? Hướng giải protein không biểu hiện? Cải biến protein tái tổ hợp Phân tích chức protein Phân tích cấu trúc protein Phân tích mối quan hệ cấu trúc chức Phân tích trung tâm hoạt động Thiết kế protein mang đặc tính 15 9/18/2020 Định hướng (Directed) Ngẫu nhiễn (Random) Đột biến Đột biến điểm Transition Transversion Đột biến đoạn Thêm đoạn Mất đoạn Đột biến ngẫu nhiên (Random Mutagenese) Khó xác định vị trí đột biến Thường sử dụng cho nghiên cứu gen chưa rõ trình tự, cấu trúc Tạo thư viện đột biến Một số phương pháp tạo đột biến chủ yếu • Sử dụng chủng vi khuẩn gây đột biến E.coli XL1red • Sử dụng tia tử ngoại (UV) • Sử dụng phương pháp cải biến hóa học: deamination, alkylation, Base-Analog Mutagens • Sử dụng phương pháp PCR: DNA shuffling, error prone PCR 16 9/18/2020 Chủng vi khuẩn XL1-Red Chủng vi khuẩn mang đột biến thiếu hụt 03 đường sửa chữa ADN chính: • mutS: Khơng sửa chữa lỗi bắt cặp không phù hợp (error-prone mismatch repair) • mutD: Thiếu hụt enzyme 3´- to 5´- exonuclease DNA polymerase III • mutT: Khơng có khả thủy phân 8-oxodGTP Khi chuyển gen đích vào vi khuẩn khả sinh đột biến cao khoảng 5000 lần so với chủng E coli bình thường Tăng tỷ lệ đột biến tia UV 17 9/18/2020 Cải biến hóa học: Khử nhóm Amin (Deamination) Chất gây đột biến thường dùng: HNO2, NaHSO3, NH2OH 18 9/18/2020 Cải biến hóa học: Đột biến Base-Analog 19 9/18/2020 Cải biến hóa học: Alkyl hóa (Alkylation) Chất gây đột biến thường dùng: Ethyl methane sulfonate (EMS), Dimethyl sulfate Phương pháp PCR: DNA shuffling 20 9/18/2020 Phương pháp PCR: Error Prone PCR Đột biến điểm định hướng (Site-Directed Mutagenesis) Xác định vị trí đột biến Sử dụng gen biết trình tự Ứng dụng nghiên cứu cấu trúc chức protein 21 9/18/2020 Các kiểu đột biến điểm định hướng 22 9/18/2020 23 9/18/2020 FUSION-PCR 24 ... protein 39 6 Protein Cross-linked amylose Streptavidin binding protein 38 Peptide Streptavidin Calmodulin-binding protein 26 Peptide Calmodulin Chitin-binding protein 51 Protein domain Chitin c-myc 11... 9/18/2020 Điện di protein 02 chiều (Two-Dimensional Difference Gel Electrophoresis) 37 9/18/2020 Công nghệ protein tái tổ hợp (Recombinant Protein Technology) 9/18/2020 Ứng dựng protein tái tổ hợp:... (Tag-fusion) thường gặp Đi lực (Affinity tag) Số Aa Trình tự Poly-His Thường HHHHHH Poly-Arg Thường RRRRR Cationexchange Glutatione S-transferase 211 Protein Glutathione Maltose-binding protein 39 6